Đồ án tốt nghiệp thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded rna vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh macrobrachium rosenbergii (de man, 1879)

1 MỞ ĐẦU Tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 là một trong những loài giáp xác thương mại rất quan trọng, được đánh bắt và nuôi trồng rộng rãi và phân bố tự nhiên trong

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỰC NGHIỆM CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP DOUBLE STRANDED RNA VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI

GIỚI TÍNH TÔM CÀNG XANH

Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn : Th.S BÙI THỊ LIÊN HÀ Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM HOÀNG MSSV: 0851110091 Lớp: 08DSH4

TP Hồ Chí Minh, 2012

1

MỞ ĐẦU

Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) là một trong

những loài giáp xác thương mại rất quan trọng, được đánh bắt và nuôi trồng rộng rãi

và phân bố tự nhiên trong các ruộng lúa (New, 2005) Năm 1987, sản lượng M

rosenbergii toàn cầu ước tính đạt khoảng 27000 tấn mỗi năm (New, 1990) Một số

lượng lớn được sản xuất ở Trung Quốc và mở rộng nhanh chóng ra Ấn Độ và Bangladesh (New, 2005) Ngày nay, nó được nuôi rộng rãi ở các nước trên thế giới

Trong thập kỷ qua, sản lượng trung bình mỗi năm của M rosenbergii tăng 9-35,5%

về giá trị Năm 1993, tổng sản lượng là 17,164 tấn, trị giá 116,799,000 USD và năm

2005 đạt 205,033 tấn với trị giá 896,263,000 USD Việc nuôi trồng tôm càng xanh

đóng góp lớn vào ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu, cả về số lượng và giá trị M

rosenbergii được nuôi nhiều ở Châu Á và một số khu vực khác như Châu Phi,

Israel, Trung và Nam Mỹ (Nhan, 2009)

Tại Việt Nam, tôm càng xanh là đối tượng nuôi bản địa được nông dân ưa thích, được nhiều địa phương xác định là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao, đặc biệt là những khu vực nuôi tôm thương mại ở lưu vực sông Mê Kông Do đó nhu cầu về con giống cho việc nuôi đại trà là rất lớn

Tuy nhiên, trong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con cái Khi chiều dài cơ thể đạt trung bình 8-14 cm và trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển của con đực và con cái tương đương nhau Nhưng khi chiều dài cơ thể vượt quá 14 cm, con đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009) Do ở giai đoạn này con cái ngưng phát triển và tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản (Ra`anan và Cohen, 1984) Tôm đực lớn nhất có thể đạt 110 g, trong khi tôm cái lớn nhất chỉ đạt 50 g sau 7 tháng nuôi (Lê Quang Khôi, 2009) Đây là một vấn đề gây trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm càng xanh thương phẩm vì con có kích thước càng lớn thì giá thành càng cao và sản lượng thu hoạch cũng sẽ tăng cao

Nghiên cứu của Sagi và Ra`anan trong năm 1988 đã chứng minh rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đạt sản lượng cao hơn việc nuôi toàn cái hay đực và cái trong cùng quần thể Khối lượng trung bình của mỗi quần thể lần lượt là 473

2

những kết quả tương tự khi tiến hành thí nghiệm nuôi tôm toàn đực, toàn cái và hỗn hợp cả đực và cái (Siddiqui, 1997) Điều này thể hiện rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đã làm tăng sản lượng một cách đáng kể và mang lại lợi nhuận cao hơn việc nuôi toàn cái hay hỗn hợp đực và cái Do đó, sự phát triển những kỹ thuật cho việc sản xuất quần thể toàn đực là nhu cầu cần thiết cho việc nuôi tôm càng xanh Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chức năng làm bất hoạt gene của iRNA trong tế bào tôm (Estrada và ctv, 2007) Và đây là một trong những công cụ

có tiềm năng đáp ứng cho việc sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo và Kempheus, 1995) đã được sử dụng như một công cụ hiệu quả để làm bất hoạt các sản phẩm gene bằng cách tiêm RNA mạch đôi vào trong cơ thể của nhiều loài giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008) Ý tưởng tạo ra con cái giả bằng cách làm bất hoạt RNA thông tin mã hóa gene tuyến đực insuline-like của tôm càng xanh

(Macrobrachium rosenbergii insuline-like androgenic gland, Mr-IAG) bằng RNA

mạch đôi (dsRNA) đã được thực hiện thành công tại quy mô phòng thí nghiệm (Ventura và ctv, 2009) Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn như là một hướng tiếp cận mới để tạo ra quần thể tôm toàn đực cho việc nuôi tôm càng xanh thương mại

Xuất phát từ những nhu cầu con giống tôm càng xanh đực từ thị trường thì

đề tài “Thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)” là cần thiết và đang được nhiều mong đợi

Mục tiêu đề tài là ứng dụng dsRNA để tạo ra tôm càng xanh cái giả, từ con cái giả này sẽ sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực để đáp ứng nhu cầu cho việc nuôi tôm càng xanh thương phẩm

Những nội dung cần thực hiện là:

+ Tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi cho kỹ thuật bất hoạt RNA

+ Kiểm tra hiệu quả của Mr-IAG RNA mạch đôi đối với việc chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh với các nồng độ và tần suất tiêm khác nhau

3

+ Kiểm tra ảnh hưởng của thời gian tiêm Mr-IAG RNA mạch đôi lên

sự tạo thành tôm càng xanh cái giả

Phương pháp nghiên cứu của đề tài là thu thập thông tin từ các bài báo khoa học đã công bố, các nghiên cứu trong và ngoài nước, thu thập các số liệu thực nghiệm và xử lý bằng phần mềm excel

Các kết quả đạt được của đề tài:

+ Tổng hợp thành công dsRNA bằng bộ kit Promega

+ Khảo sát được nồng độ tiêm dsRNA 1,25 µg/g, tần suất tiêm 1 lần/tuần là có thể làm bất hoạt gene mã hóa cho hormone tuyến đực ở tôm PL25 để tạo ra tôm càng xanh cái giả

+ Thời gian tiêm dsRNA phải kéo dài đến khi con cái giả thành thục sinh sản

Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:

+ Chương 1 Tổng quan: giới thiệu sơ lược về tôm càng xanh

Macrobrachium rosenbergii, tổng quan về tuyến đực, cơ chế làm bất hoạt gene của

iRNA

+ Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: vật liệu sinh học là tôm PL25, phương pháp tổng hợp dsRNA theo bộ kit Promega, thí nghiệm tiêm được thực hiện với 3 nồng độ tiêm là 5 µg/g; 2,5 µg/g và 1,25 µg/g và các tần suất tiêm là 3 lần/ tuần, 2 lần/tuần và 1 lần/tuần Thí nghiệm thời gian tiêm được thực hiện trong vào 4 tháng với nồng độ tiêm là 1,25 µg/g và tần suất tiêm là 1 lần/tuần

+ Chương 3 Kết quả và thảo luận: nêu lên các kết quả đạt được là tổng hợp được dsRNA, nồng độ và tần suất tiêm dsRNA tốt nhất, tạo được con cái giả đến tháng thứ 4 của thí nghiệm

+ Chương 4 Kết luận và đề nghị: một số kết quả mà đề tài đã đạt được và đưa ra một số kiến nghị để làm hướng nghiên cứu trong tương lai

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Phân loại (New, 2002)

Tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1897), là loài đầu tiên được biết đến trong giống Macrobrachium và được công nhận lần đầu tiên vào năm

1705 Quá trình đặt tên cho tôm càng xanh cả giống và loài đã gặp khá nhiều khó

khăn trong lịch sử Trong quá khứ tên của giống bao gồm cả Cancer (Astacus) và

Palaemon Trước kia, tên M rosenbergii bao gồm Palaemon carcinus, P dacqueti,

và P rosenbergii và đến năm 1959 tên khoa học Macrobracchium rosenbergii xuất

hiện và được chấp nhận phổ biến ở hầu hết các nước

Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda

Bộ phụ: Pleocyemata Phân bộ: Caridea Họ: Palaemonidae

Họ phụ: Palaemoninae Giống: Macrobrachium Loài: M rosenbergii (De Man, 1879)

Tên tiếng anh: Giant freshwater prawn

1.2 Đặc điểm sinh học của tôm càng xanh

1.2.1 Phân bố

Tôm càng xanh M rosenbergii phân bố tự nhiên ở Đông Nam Á, các nước ở

Nam Thái Bình Dương, phía Bắc châu Đại Dương và phía Tây của các đảo Thái Bình Dương (New và Singholka, 1982; New, 2002)

Tôm càng xanh phân bố ở tất cả các thủy vực nước ngọt và các thủy vực nước lợ của nhiều vùng trên thế giới (Nguyễn Việt Thắng, 2003) Môi trường sống

5

của tôm càng xanh đa dạng trong thủy vực nước trong cũng như nước đục Ở Việt Nam, tôm càng xanh phân bố chủ yếu ở các tỉnh Nam Bộ đặc biệt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002)

1.2.2 Vòng đời và tập tính sống

Vòng đời của tôm càng xanh được chia làm 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu

ấu trùng và tôm trưởng thành Khi tôm đã trưởng thành, chúng thường sống trong môi trường nước ngọt như: sông, rạch, ao, hồ.…Cũng chính nơi đây xảy ra quá trình thành thục, phát dục và giao vĩ đẻ trứng Nhưng khi ôm trứng chúng có xu thế bơi ra vùng nước lợ từ 6-18 0/00, ở đó ấu trùng được nở ra và sống trôi nổi theo kiểu phù du Sau 11 lần lột xác với 12 giai đoạn biến thái ấu trùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Postlarvae-PL) lúc này tôm con di cư về vùng nước ngọt, sống và lớn lên ở đây (Ling và Omerica, 1962; Nguyễn Thanh Phương, 2003)

Ấu trùng có tính hướng quang mạnh, vận động trôi nổi trong nước Sang thời

kỳ hậu ấu trùng và giai đoạn trưởng thành, tôm có tập tính sống ở đáy, bám vào cây cỏ; giá thể…Tôm trưởng thành ít hoạt động và thường ẩn náo vào ban ngày và tích cực hoạt động vào ban đêm Tôm càng xanh có tập tính ăn thịt lẫn nhau, vì vậy việc dùng giá thể tăng chổ ẩn nắp, hạn chế hiện tượng ăn thịt lẫn nhau để nâng cao tỷ lệ sống của tôm (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008)

1.2.3 Hình thái và tăng trưởng

Dựa vào hình dạng và màu sắc để phân biệt giữa tôm càng và các nhóm tôm khác Tôm càng xanh có cơ thể thon dài, đối xứng 2 bên Con trưởng thành thường

có màu xanh dễ nhận, đôi khi có màu nâu nhạt (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008)

Tôm càng xanh ở nước ta có trọng lượng cá thể khá lớn, con đực đạt tới 450 g/cá thể, thân tương đối tròn, cá thể trưởng thành có màu xanh dương đậm Chủy phát triển nhọn và cong lên ½ bề dài tận cùng của chủy, phía trên mắt chủy có

11-15 răng và 3-4 răng sau hốc mắt Mặt dưới thường có 12-11-15 răng Chiều dài chủy của con cái khi trưởng thành thường bằng hoặc ngắn hơn vỏ đầu ngực, còn chủy của con đực dài hơn chiều dài ở đầu ngực (Lê Quang Khôi, 2009)

6

Hình 1.1 Tôm càng xanh M rosenbergii

Chân thứ 2 luôn phát triển hơn các chân khác, nhất là con đực trưởng thành, đôi chân bò thứ 2 có hình dạng và kích thước giống nhau ở 2 phía (trái và phải); (Lê Quang Khôi, 2009)

Đặc điểm về kích cỡ, hình dạng, màu sắc và các gai trên đôi càng sẽ thay đổi theo giai đoạn thành thục của tôm, nhất là ở tôm đực Khi tôm còn nhỏ, đôi càng có màu trong, sau chuyển thành vàng cam (còn gọi là càng lửa), chưa có gai hay có gai rất mịn trên càng, chưa có hay rất ít lông tơ Khi tôm lớn, đôi càng có màu xanh đậm, xuất hiện nhiều gai nhọn và lông tơ trên càng Quá trình thay đổi trên được thể hiện qua các giai đoạn như: tôm nhỏ, tôm càng lửa nhạt, tôm càng lửa đậm, tôm càng lửa đậm chuyển tiếp càng xanh, tôm càng xanh nhạt, tôm càng xanh đậm và tôm già (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009)

Trong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con cái Khi chiều dài cơ thể đạt trung bình 8-14 cm và trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển

7

của con đực và con cái tương đương nhau Nhưng khi chiều dài cơ thể vượt quá 14

cm, con đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009)

1.3 Đặc điểm sinh sản của tôm càng xanh

1.3.1 Phân biệt tôm đực và tôm cái

Tôm càng xanh trưởng thành không những dễ dàng phân biệt đực và cái qua đôi chân bò thứ 2 (càng) mà còn qua cơ quan sinh dục như lỗ sinh dục đực nằm ở gốc chân bò thứ 5, lỗ sinh dục cái nằm ở gốc chân bò thứ 3 (Nguyễn Việt Thắng, 1993)

Tôm đực có kích cỡ lớn hơn tôm cái cùng tuổi Đầu ngực tôm đực to hơn và khoang bụng hẹp hơn tôm cái Đôi càng thứ 2 to, dài và thô Cơ quan sinh dục trong của con đực gồm một đôi tinh sào, một đôi ống dẫn tinh và đầu mút Đôi tinh sào ngoằn ngèo nằm giữa mặt lưng của giáp đầu ngực nối với ống dẫn tinh chạy từ trước tim dọc sang 2 bên viềng sau của giáp đầu ngực và đổ vào đầu mút nằm ở đốt gốc của chân ngực thứ năm Túi tinh hình thành trong quá trình phóng tinh Túi tinh chứa khối tinh trùng không di động

Ở con cái, buồng trứng nằm trên mặt lưng của phần đầu ngực, giữa dạ dày và gan tụy Khi buồng trứng thành thục sẽ có màu vàng có thể nhìn thấy qua giáp đầu ngực, trải dài từ sau mắt đến đốt đầu của phần bụng Ống dẫn trứng nối từ buồng trứng ở trước tim chạy dọc 2 bên về phía bụng đổ về túi chứa tinh ở đốt gốc của chân ngực thứ ba (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009)

8

Đặc điểm Tôm đực Tôm cái

Kích cỡ Lớn hơn và đầu ngực to

hơn tôm cái

Nhỏ hơn và đầu ngực nhỏ hơn tôm đực

Càng Đôi càng thứ 2 rất to, ghồ

ghề, nhiều gai

Nhỏ hơn và nhẵn hơn càng của tôm đực

Lỗ sinh dục Hiện diện dưới gốc của

chân ngực thứ năm và có nắp đậy

Hiện diện dưới gốc của chân ngực thứ ba, có màng mỏng bao phủ Bụng Mặt bụng có đốt thứ nhất

có điểm cứng ở giữa

Tôm cái thành thục có tấm bụng thứ nhất, thứ 2, thứ ba dài và nở rộng, hình thành buồng ấp trứng

Lông tơ sinh dục Không có Xuất hiện nhiều trên chân

ngực và chân bụng của tôm trưởng thành Tuyến androgenic Dãy tế bào dính vào vùng

cuối của ống dẫn tinh

Không có

Chiều dài và kích cỡ thành

thục

Chiều dài 17,5 cm, trọng lượng trung bình 35 g

Chiều dài 15 cm, trọng lượng trung bình 25 g Phụ bộ giao vĩ Xuất hiện những nhánh

trong và nhánh phụ trong của chân bụng thứ 2

Không có

(Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009)

1.3.2 Thành thục, giao vĩ, đẻ trứng và ấp trứng của tôm càng xanh

Trong tự nhiên cũng như trong điều kiện nhân tạo, tôm thành thục và giao vĩ xảy ra hầu như quanh năm Mùa đẻ rộ của tôm càng xanh ở đồng bằng Nam Bộ tập trung từ tháng 4-6 và từ tháng 8-10 (Nguyễn Việt Thắng, 1993; Nguyễn Thị Thanh

9

Thủy, 2005) Tôm cái thành thục lần đầu tiên ở khoảng 3-3,5 tháng kể từ hậu ấu trùng 10-15 ngày (PL10-15) Kích cở tôm nhỏ nhất đạt thành thục từ 10-13 cm và 7,5

g (Nguyễn Việt Thắng, 1993)

Quá trình lột xác tiền giao vĩ của tôm cái sẽ tiết ra chất dẫn dụ có tác dụng kích thích tôm đực tìm đến Sau khi tôm lột xác 1-22 giờ, thường 3-6 giờ, tôm bắt đầu giao vĩ Toàn bộ quá trình tiếp xúc và giao vĩ xảy ra trong vòng 20-35 phút Sau khi giao vĩ 2-5 giờ, có khi 6-24 giờ, tôm cái bắt đầu đẻ trứng (Nguyễn Thanh Phương, 2003) Tôm thường đẻ trứng vào ban đêm Tôm cái thường di chuyển từ tầng đáy lên tầng giữa hay tầng mặt để đẻ Trong quá trình đẻ trứng, trứng được thụ tinh khi đi ngang túi chứa tinh Trứng sẽ lần lượt dính từng chùm vào các lông tơ của các đôi chân bụng thứ tư, thứ ba, thứ hai, thứ nhất Thời gian đẻ trứng khoảng 10-60 phút và thông thường từ 15-25 phút Những tôm cái thành thục chín muồi nhưng không được giao vĩ vẫn đẻ trứng trong vòng 24 giờ sau khi lột xác Những trứng này do không được thụ tinh nên sẽ rụng sau 1-2 ngày (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002)

Trong quá trình ấp trứng, tôm cái thường dùng chân bụng quạt nước, tạo dòng nước, cung cấp dưỡng khí cho trứng Thời gian ấp trứng đến trứng nở có thể

từ 15-23 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ nước (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008)

1.4 Tổng quan về tuyến đực

Hệ thống nội tiết của nhóm giáp xác gồm một phần của tuyến sinus và

cơ quan X nằm trong cuống mắt Cơ quan X sản xuất gonal-inhibiting hormone (GIH) và molt-inhibiting hormone được giữ trong tuyến sinus trước khi được lưu thông trong cơ thể Ở giáp xác cơ quan Y nằm trong trung tâm phần đầu ngực và sản xuất ra gonal-stimulating hormone (GSH) và ecdysone GIH và GSH tác động trực tiếp vào buồng trứng và gián tiếp vào tinh hoàn thông qua sự tiết hormone từ tuyến androgenic (AGH) Giáp xác có các cơ quan thuộc hàm dưới, các cơ quan neurohemal, đây là những vị trí tổng hợp và tiết ra methyl farnosoate, một loại hormone có vai trò quan trọng trong sự trưởng thành sinh dục ở con đực và con cái, phát triển hệ thống sinh sản rõ