Đồ án tốt nghiệp thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn bacillus spp và lactobacillus spp đối với một số nấm mốc sinh độc tố aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP VÀ LACTOBACILLUS SPP ĐỐI VỚI[.]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN

BACILLUS SPP VÀ LACTOBACILLUS SPP ĐỐI VỚI

MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

MSSV: 1515100007 Lớp: 15HSH01

i

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường Đại Học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh

Những kết quả trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác với bất kì hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực Tôi xin chịu toàn bộ trách nhiệm về đồ án của mình

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hôm nay

Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em

đã được các thây, cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy, Cô nhờ

có thầy, cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Hương, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương và thực hiện, hoàn thành đồ án này

Em cũng xin cám ơn các Thầy, Cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe

iii

MỤC LỤC

TRANG

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 2

CHƯƠNG I: TÔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nấm: 4

1.1.1 Giới thiệu chung 4

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra 4

1.1.3 Tác hại của nấm 5

1.1.3.1 Tác hại của nấm gây cho người và động vật 5

1.1.3.2 Tác hại của nấm gây cho thực vật 6

1.1.4 Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm 6

1.2 Tổng quan về hợp chất kháng nấm: 7

1.2.1 Hợp chất kháng nấm hóa học 10

1.2.2 Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học 10

1.2.3 Hợp chất kháng nấm trong sinh học 13

1.2.3.1 Hợp chất kháng nấm từ thực vật: 13

1.2.3.2 Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: 17

a Khả năng kháng nấm mốc của Bacillus spp 17

b Khả năng kháng nấm mốc của Lactobacillus spp 19

1.3 Các phương pháp sàng lọc các chủngVSV kháng nấm mốc: 21

1.3.1 Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn) 21

1.3.2 Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) 23

1.3.3 Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa 2 lớp): 25

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Địa điểm nghiên cứu: 26

2.2 Thời gian nghiên cứu: 26

2.3 Vật liệu nghiên cứu: 26

2.3.1 Giống vi sinh vật: 26

2.3.1 Hóa chất và môi trường sử dụng 26

2.3.1.1 Hóa chất: 26

2.3.1.2 Môi trường nuôi cấy: 26

2.4 Thiết bị và dụng cụ: 27

2.4.1 Thiết bị: 27

2.4.2 Dụng cụ: 28

2.5 Phương pháp luận: 28

2.6 Phương pháp nghiên cứu: 29

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

2.6.2 Khảo sát sự tăng trường của nấm mốc: 30

2.6.3 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với nấm mốc: 30

2.6.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc: 35

2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp với nấm mốc: 39

2.6.6 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn 43

2.6.6.1 Nhuộm gram 43

2.6.6.2 Nhuộm bào tử 44

2.6.6.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 44

v

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45

3.1 Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn 45

3.1.1 Nhuộm Gram: 45

3.1.2 Nhuộm bào tử: 46

3.1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 47

3.2 Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc: 48

3.3 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với các chủng nấm mốc: 50

3.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với các chủng nấm mốc: 66

3.5 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với các chủng nấm mốc 81

3.6 So sánh khả năng đối kháng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn thông qua cách chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) 90

KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

LAB Lactobacillus spp

PDA Potato dextrose agar

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học được sử dụng để bảo quản hạt giống 9

Bảng 1.2.Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 18

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus spp 45 Bảng 3.2 Một số phản ứng sinh hóa của các chủng Bacillus spp 47

Bảng 3.3 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn

Bacillus spp theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn

53

Bảng 3.4 So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus

spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn

54 Bảng 3.5 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn

62 Bảng 3.6 So sánh số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi

khuẩn 63 Bảng 3.7 Thống kê số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốccủa các chủng vi khuẩn

Bacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán

68 Bảng 3.8 So sánh sô liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Bacillus spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán

69 Bảng 3.9 Thống kê số liệu vòng ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán

76

Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch

tán 77 Bảng 3.11 Thống kê số liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi

khuẩn Bacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp

84 Bảng 3.12 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Bacillus spp trong các nhóm theo phương pháp đõ dĩa 2 lớp 85

Bảng 3.13 Sắp xếp số liệu trung bình ức chế của các chủng nấm mốc của các vi

khuẩn Lactobacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp

89 Bảng 3.14 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 90 Bảng 3.15 Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp theo từng phương pháp

dựa theo xếp hạng LSD 91

Bảng 3.16 Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp theo từng phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 92

ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Metalaxyl 10

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Manocozeb 11

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole 11

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của Pyrones 14

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của Viridines 15

Hình 1.6 Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn LAB đối với nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013) 20

Hình 1.7 Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn 21

Hình 1.8 Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015)

22

Hình 1.9 Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 23

Hình 1.10 Phương pháp đối kháng che phủ của Bacillus spp với các loại nấm (trích từ Kumar và các cộng sự,2009) 24

Hình 1.11 Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đỗ dĩa 25

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng dối kháng của các chủng vi khuẩn có lợi đối với nấm mốc 29

Hình 2.2 Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường 31

Hình 2.3 Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế theo phương pháp ria 2 đường vi

khuẩn 35

Hình 2.4 Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 36

HÌnh 2.5 Cách đặt thạch vi khuẩn trong phương pháp đặt thạch khuếch tán 37

Hình 2.6 Mô tả cách đo vòng ức chế của vi khuẩn theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 38

Hìn h 2.7.Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp thạch 40

Hình 3.1 HÌnh thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp 45

HÌnh 3.2 Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn 46

Hình 3.3 Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn 47

Hình 3.4 Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA 48

Hình 3.5 Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến 49

Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ phế phẩm 55

Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ đất 56

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử nước thải 57

Hình 3.13 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân lập tử nem 63

xi

Hình 3.14 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân

lập tử cơm mẻ 64

Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập

tử phụ phế phẩm 70

Hình 3.19 Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus 66spp phân

lập tử đất 71

Hình 3.20 Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấmmốccủa nhóm Bacillus spp phân lập

tử nước thải 72

Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp

phân lập tử nem 78

Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp

phân lập tử cơm mẻ 79

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề:

Hiện nay, trên thế giới và nước ta đang nghiên cứu về các phương pháp đối kháng lại các loại nấm mốc khác nhau như đối kháng giữa nấm có lợi với nấm mốc hay đối kháng giữa các vi sinh vật có lợi với nấm mốc

Độc tố của các loại vi nấm có nhiều loại như aflatoxin, ocharatoxin, tricothecenes, zearalenone… Các loại độc tố này rất nguy hiểm, thường gây nhiễm trên nông sản, gây độc cho con người và gia súc như là gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến và nếu bị nhiễm ở hàm lượng cao sẽ gây chết người Trong khi đó, thuốc trừ nấm mốc hóa học lại gây nhiều tác dụng phụ ảnh hường đến đời sống của con người và động vật

Vì vậy, ở nước ta đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng lại nấm mốc gây hại trên nông sản và thực phẩm bằng các loại nấm có lợi khác

như Trichoderma spp…và sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật hóa học Nhưng

việc sử dụng vi sinh vật có lợi để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại vẫn còn khá mới và chưa được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm

Từ những vấn đề trên, để phân lập được các chủng vi sinh vật có khả năng kháng

nấm mốc trong in vitro đã có nhiều đề tài và các phương pháp kháng nấm mốc

khác nhau nhưng chưa có sự so sánh giữa các phương pháp đó với nhau Từ đó,

em đã thực hiện nhiều phương pháp kháng nấm mốc khác nhau và so sánh chúng

và sau đó, tìm ra phương pháp thích hợp và hiệu quả nhất với phòng thí nghiệm

của trường Chính vì vậy, em xin thực đề tài “Thử nghiệm các phương pháp

đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp và

Lactobacillus spp đối với một số nấm mốc Aspergillus spp sinh aflatoxin”

2

2 Tình hình nghiên cứu:

Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kháng nấm mốc gây hại trong nông sản và thực phẩm theo nhiều phương pháp khác nhau

 Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại nấm mốc theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi,2004) như: “ Phân

lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp ứng dụng trong bảo quản nông sản”

(Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm

thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp Của vi khuẩn Lactobacillus L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015)…

 Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn

lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong-

75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và Schnurer,2001)

3 Mục đích nghiên cứu:

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả

nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp của

phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường

4 Mục tiêu nghiên cứu:

Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ

thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp của phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực

Phẩm- Môi Trường

5 Nhiệm vụ nghiên cứu:

 Xác định tỉ lệ đối kháng của 10 chủng Bacillus spp và 10 chủng Lactobacillus spp đối với 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp tiềm năng sinh

aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phông, đậu nành và cà phê bằng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method)

 Xác định tỉ lệ đối kháng nấm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán.(Agar Plug Diffusion Method)

 Đánh giá khả năng đối kháng nấm theo phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method)

 Đánh giá tương quan giữa các phương pháp, từ đó đề nghị phương pháp thích hợp nhất cho phòng thí nghiệm

6 Phương pháp nghiên cứu:

a Phương pháp luận:

Dựa trên các chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp đã được phân

lập trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm các phương pháp đối kháng nấm đã được mô tả trong tài liệu.Từ đó, đưa ra phương pháp thích hợp nhất trong phòng thí nghiệm để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại trên thực phẩm và hạt giống cây trồng

b Phương pháp xử lí số liệu:

 Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

 Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lí số liệu

7 Kết quả đạt được từ đề tài:

 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillusspp.và vi khuẩn Lactobacillus spp

có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm

 Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn (Dual Culture Two Line Culture Method)

 Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar Plug Diffusion Method)

 Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method)

 Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí nghiệm