Đồ án tốt nghiệp xác định cộng đồng vi sinh bằng phương pháp pcr và dgge từ rơm trước và sau khi xử lý trồng nấm rơm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH CỘNG ĐỒNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ DGGE TỪ RƠM TRƯỚC VÀ SAU KHI XỬ LÝ TRỒNG NẤM RƠM Ngành CÔNG NGHỆ SIN[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH CỘNG ĐỒNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ DGGE TỪ RƠM TRƯỚC VÀ SAU KHI

XỬ LÝ TRỒNG NẤM RƠM

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

CN NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực hiện : HOÀNG NGỌC PHƯƠNG THẢO MSSV: 0851110222 Lớp: 08DSH4

TP Hồ Chí Minh, 2012

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nghiên cứu về cộng đồng vi sinh vật trong các môi trường sống nhằm tìm hiểu thêm đa dạng sinh học là một trong những mong muốn của các nhà khoa học trên thế giới Trước đây, để phân tích cộng đồng vi sinh vật trong các môi trường tự nhiên, các nhà khoa học phải nuôi cấy và phân lập qua nhiều công đoạn khác nhau, tốn thời gian và công sức nhưng lại không đem đến kết quả mong muốn

Trong số tất cả các vi sinh vật trong tự nhiên, khoảng 99% không được phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy Vì vậy, sinh học phân tử, phương pháp nhận biết độc lập, khuếch đại và giải trình tự gen 16S rDNA, thường được sử dụng để có một dữ liệu đầy đủ hơn về một cộng đồng sống trong một môi trường cụ thể, sinh học phân

tử ra đời đã khắc phục những khó khăn vẫn còn hạn chế của công nghệ sinh học, nhằm góp phần xác định cộng đồng của vi sinh vật trong môi trường nhanh chóng

mà không phải qua nhiều giai đoạn nuôi cấy và phân lập, qua đó giúp các nhà khoa học hiểu biết nhiều hơn về đa dạng sinh học, từ đó đưa vào các ứng dụng nhằm phục vụ cho thực tiễn

Áp dụng sinh học phân tử để nghiên cứu cộng đồng vi sinh có trong rơm rạ

ở giai đoạn trước và sau khi xử lý trong trồng nấm là rất cần thiết Định danh hệ vi sinh vật có trong mẫu rơm bằng việc ly trích và thu nhận DNA trực tiếp, so sánh sự thay đổi hệ vi sinh trong mẫu rơm ở các giai đoạn tiền xử lý trước khi đưa vào trồng nấm, từ đó có thể bổ sung hệ vi sinh phù hợp vào giai đoạn rơm tiền xử lý nhằm rút ngắn thời gian ủ rơm trước khi đưa vào trồng nấm, đem lại hiệu quả kinh

tế cao hơn cho người dân Đây cũng là bước khởi đầu quan trọng cho chúng ta có thêm kiến thức về sự đa dạng sinh học trong nguồn cơ chất này, góp phần ứng dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

2 Tình hình nghiên cứu

Ly trích DNA của vi sinh vật trực tiếp từ rơm rạ để tìm hiểu cộng đồng vi sinh vật đã được thực hiện tại một số phòng thí nghiệm về nông nghiệp các nước Tuy có những quy trình ly trích DNA khác nhau nhưng đều chung mục đích là thu nhận DNA của nhóm vi khuẩn phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

Ở Việt Nam, mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn nhưng vẫn chưa được ứng dụng nhiều so với vai trò mà nó có thể mang lại Rơm rạ nói riêng và từ biomass nói chung không được sử dụng một cách hiệu quả Phần lớn chúng được đốt và bỏ trở lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà nông, làm cơ chất trồng nấm, làm thức ăn cho gia súc…gây lãng phí một nguồn năng lượng tiềm năng Việc ly trích và thu nhận trức tiếp DNA của nhóm vi khuẩn

từ rơm vẫn chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều, chủ yếu là phân lập và ly trích từ những chủng thuần vi sinh cho những mục đích nghiên cứu khác nhau

3 Mục đích nghiên cứu

- Ly trích và thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước và sau khi xử lý

trong trồng nấm

- Xác định nhóm vi khuẩn trong rơm trước và sau khi xử lý trong trồng nấm

bằng phương pháp PCR và DGGE, giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 của đoạn 16S rDNA

- Thành lập cây phân loài của nhóm vi khuẩn có trong rơm trước và sau xử lý

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh trực tiếp từ rơm xử lý trong trồng nấm

- Tiến hành tinh sạch và kiểm tra độ tinh sạch DNA của nhóm vi khuẩn

- Sử dụng phương pháp khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn Điện di

và kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose

- Xác định nhóm vi khuẩn trong rơm bằng phương pháp DGGE vùng V3 thuôc đoạn gene 16S rDNA

- Giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 của đoạn 16S rDNA

- Hình thành cây phân loài của hệ vi khuẩn có trong rơm trước và sau khi xử lý

5 Phương pháp nghiên cứu

- Hình thức thu mẫu: Thu mẫu rơm trước và sau khi xử lý trong trồng nấm

- Ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh bằng phương pháp SDS

- Tinh sạch DNA bằng bộ kit: GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit

- Xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR khuếch đại đoạn gene 16S rDNA dựa vào cặp mồi 27F 5’ – GA GTT TGA TCM TGG CTC AG – 3’ và 1492R 5’ – TAC GGG TAC CTT GTT CG ACT T – 3’, sau đó tinh sạch sản phẩm PCR trước khi phân tích DGGE

- Phương pháp DGGE được sử dụng để xác định hệ vi khuẩn trong mẫu:

+ PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn được thực hiện với cặp mồi chuyên biệt cho nhóm vi khuẩn là 517R 5’ – ATT AC GCG GCT GCT CC – 3’ và 357F – GC 5’ – CGC CCG CGC GCG GGC GGG GGG GGG GCA CGG GGG CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’

+ Thực hiện phương pháp DGGE trên gel polyacrylamide

+ PCR vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA sau khi DGGE với cặp mồi 357F 5’ – CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’ và 517R 5’ – ATT ACC GCG GCT GCT GG – 3’ Tinh sạch và thu nhận DNA từ gel polyacrylamide bằng bộ Kit QIAEX II trước khi bước vào giải trình tự loài

+ Giải trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA của vi khuẩn

+ Kết quả giải trình tự được so chuỗi bằng chương trình BLAST trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI

6 Kết quả nghiên cứu

- Ly trích và thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước và sau xử lý trong trồng nấm rơm

- Xác định nhóm vi khuẩn cần nghiên cứu dựa vào sự khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phản ứng PCR

- Xác định nhóm vi khuẩn trong mẫu bằng phương pháp DGGE của vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA

- Giải mã được trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA của vi khuẩn

- Hình thành cây phân loài của cộng đồng vi khuẩn có trong rơm trước và sau

xử lý

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:

- Chương 1: Tổng quan

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về rơm rạ

1.1.1 Thành phần cấu tạo của rơm rạ

Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt Nam Hình ảnh đất Việt thường được mô tả như là một chiếc đòn gánh khổng lồ với hai đầu là hai vựa thóc lớn là Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) và Đồng Bằng Sông Hồng (ĐBSH) Khoảng 80% trong số 11 triệu hộ nông dân tham gia sản xuất lúa gạo, chủ yếu dựa vào hình thức canh tác thủ công truyền thống [8]

Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một lượng lớn phế phẩm từ cây lúa bao gồm rơm và trấu Rơm và trấu là hai trong số nhiều nguồn biomass phổ biến và có tiềm năng ở Việt Nam

Rơm rạ là thành phần hỗn hợp của nhiều hợp chất hóa học khác nhau tạo nên trong một thành phần cấu trúc cao phân tử gồm cacbonhydrate, một lượng nhỏ protein và khoáng Nghiên cứu tế bào qua kính hiển vi có thể cho thấy mô hình cấu tạo phức tạp của rơm

Các phần phân đoạn chính của thực vật nói chung và rơm rạ nói riêng gồm: các đốt (mắt), lóng (thân) và lá Tỷ lệ cấu trúc phân đoạn của các loài tương đối khác nhau do nhiều yếu tố: Loài, vụ mùa, đất, điều kiện khí hậu…Như một hệ quả, khi thành phần hóa học các phần phân đoạn của thực vật khác nhau thì cấu tạo của mỗi loài cũng khác nhau [17]

Thành phần hóa học của rơm rạ tính theo khối lượng khô gồm cellulose 60

%, lignin 14%, đạm hữu cơ (protein) 3,4%, chất béo (lipid) 1,9% Nếu tính theo nguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hydro (H) 5%, oxygen (O) 49%, N khoảng 0,92% , một lượng rất nhỏ photpho (P), lưu huỳnh (S) và kali (K)

Bảng 1.1: Thành phần cấu tạo hóa học ở các phần phân đoạn của rơm ở 2 dạng lúa:

lúa ngắn ngày và lúa dài ngày(Antongiovanni và cộng sự, 1991) [17]

Thành phần cấu tạo

Lúa dài ngày Lúa ngắn ngày Lóng Đốt (mắt) Lá Lóng Đốt (mắt) Lá

g/kg DM

Thành tế bào 782 737 787 766 773 800

Cellulose 411 327 323 433 332 364

Hemicellulose 245 286 256 242 331 283

Rơm rạ có hai đặc tính cơ bản là: Hàm lượng N thấp (< 1%), nghèo khoáng và vitamin, chứa nhiều xơ thô nên tỷ lệ tiêu hóa thấp Việc tiêu hóa xơ nhờ hoạt động lên men của vi sinh vật trong đường tiêu hóa Chất xơ trong rơm chủ yếu

là cellulose, hemicelluloses và lignin Giữa chúng có các liên kết hóa học tạo nên

sự bền vững của màng tế bào thực vật Cellulose gồm nhiều chuỗi thẳng ghép nhau thành bó dài nhờ mạch nối hydrogen tạo thành các micell bền vững Cellulose có cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharide gọi là cellobiose, có cấu trúc từ hai phân tử D – glucose Cấu trúc bậc

2 và bậc 3 rất phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết hydro [2]

Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững, một phân tử cellulose gồm từ 7000 – 14000 đơn vị glucose tạo thành Hemicellulose là những heteropolysaccharide cùng với cellulose có ở màng tế bào thực vật Hemicellulose không hòa tan được trong nước nhưng hòa tan được trong dung dịch kiềm và bị

thủy phân bởi acid dễ dàng hơn so với cellulose Khi bị thủy phân, từ hemicelluloses sẽ tạo ra glucose, fructose, mantose, galactose, cuabinose và xylose Thành phần thứ ba đáng chú ý trong xơ là lignin Lignin luôn đi kèm với cellulose

và hemicellulose trong thành phần tế bào, không hòa tan trong nước, trong các dung môi hữu cơ bình thường và rất bền vững bởi enzyme của hệ sinh vật dạ cỏ Nhưng dưới tác dụng của kiềm thì lignin một phần bị phân giải và chuyển vào dung dịch Trong dạ cỏ loài nhai lại có những vi khuẩn đặc biệt chứa enzyme cellulase phân giải được cellulose Cellulose và hemicellulose là những hợp chất có thể tiêu hóa được Nhưng phần lớn cellulose tham gia cấu tạo trong của vách tế bào rơm nên enzyme của hệ vi sinh vật không dễ dàng tác động được Lớp ngoài thành tế bào được tạo thành chủ yếu từ các phức chất lignohemicellulose mà các enzyme vi sinh dạ cỏ phân giải vô cùng chậm Điều đó cản trở những lớp trong giàu cellulose trước tác động của enzyme vi sinh vật, cũng như cản trở sự phân giải chất chứa tế bào Để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa của rơm rạ và các chất xơ khác, các nhà nghiên cứu

đã tiến hành xử lý rơm bằng nhiều phương pháp như: lý học, hóa học, vi sinh vật học [1]

1.1.2 Cộng đồng vi sinh vật phân giải cellulose

Rơm rạ có từ 400 - 430 g xơ trong 1 kg chất khô khó phân hủy Về nguyên tắc rơm rạ có thể được hệ vi sinh dạ cỏ phân giải, tuy nhiên do bị lignin hóa cao nên khả năng tiêu hóa thực tế bị hạn chế Sự liên kết chặt chẽ giữa lignin với cacbonhydrate tạo thành các phức hợp lingo – hemicellulose/cellulose ở vách tế bào thực vật Liên kết này có lợi cho thực vật nhưng lại bất lợi cho quá trình lên men của vi sinh vật, làm cản trở tác động của enzyme vi sinh vật Các biện pháp xử

lý nhằm làm thay đổi một số tính chất hóa lý của rơm để làm tăng khả năng phân giải của vi sinh vật với thành phần xơ

Cellulose là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật Hàng ngày, hàng giờ, một lượng lớn cellulose được tích lũy lại trong đất do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống Một phần không nhỏ do con người thải ra dưới dạng rác thải, giấy vụn, phôi bào, mùn cưa… Nếu không có

quá trình phân giải của sinh vật thì lượng chất hữu cơ khổng lồ này sẽ tràn ngập trái đất

Cellulose rất khó phân giải, bởi vậy vi sinh vật phân hủy cellulose phải có một hệ enzyme gọi là cellulase bao gồm 4 enzyme khác nhau Enzyme C1 có tác dụng cắt đứt liên kết hydro, biến dạng cellulose tự nhiên có cấu hình không gian thành dạng cellulose vô định hình, enzyme này gọi là cellobiohydrolase

Enzyme thứ hai là endoglucanase có khả năng cắt đứt các liên kết β-1, 4 bên trong phân tử tạo thành những chuỗi dài Enzyme thứ 3 là exo – gluconase tiến hành phân giải các chuỗi trên thành Disaccharide gọi là Cellobiose Cả hai loại enzyme endo và exo – gluconase được gọi là Cx Enzyme thứ 4 là β – glucosidase tiến hành thủy phân cellobiose thành glucose [2]

Cellulose tự nhiên cellulose vô định hình cellobiose glucose

Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose nhờ có hệ cellulase ngoại bào

Cellulase được tổng hợp từ nhiều chủng vi sinh khác nhau:

+ Cellulase từ vi khuẩn: Bacillus megaterium, Pseudomonas fluorenscens, Acetobacter Xylium, vi khuẩn dạ cỏ, Clostridium…

+ Cellulase từ xạ khuẩn: Các loài Actinomyces, Streptomyces…

+ Cellulase từ nấm: Aspergylus niger, Aspergylus Oryzae, Tricoderma, Mucor pusillus [22]

Trong đó vi nấm là nhóm có khả năng phân giải mạnh vì nó tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme đầy đủ các thành phần Các nấm mốc có hoạt tính

phân giải cellulose đáng chú ý là Tricoderma Hầu hết các loài thuộc chi Tricoderma sống hoại sinh trong đất và đều có khả năng phân hủy cellulose Chúng

tiến hành phân hủy các tàn dư của thực vật để lại trong đất, góp phần chuyển hóa

một lượng chất hữu cơ khổng lồ Tricoderma còn sống trên tre, nứa, gỗ tạo thành

lớp mốc màu xanh phá hủy các vật liệu trên Trong nhóm vi nấm, ngoài

Tricoderma còn có nhiều giống khác có khả năng phân giải cellulose như Aspergillus, Fusarium, Mucor…

Nhiều loài vi khuẩn cũng có khả năng phân hủy cellulose Thường ở trong đất có ít loài vi khuẩn có khả năng tiết ra đầy đủ 4 loại enzyme, trong hệ enzyme cellulase Nhóm này tiết ra một loại enzyme trong hệ enzyme cellulase Nhóm này tiết ra một loại enzyme này, nhóm khác tiết ra loại khác, chúng phối hợp với nhau

để phân giải cơ chất trong mối quan hệ hỗ sinh

Nhóm vi khuẩn hiếu khí gồm Pseudomonas, Cellulomonase, Achromobacter

Nhóm vi khuẩn kỵ khí bao gồm Clostridium và đặc biệt là nhóm vi khuẩn

sống trong dạ cỏ của động vật nhai lại Chính nhờ nhóm vi khuẩn này mà trâu bò có thể sử dụng cellulose có trong cỏ, rơm rạ làm thức ăn Đó là những cầu khuẩn

thuộc chi Rumonococcus có khả năng phân hủy cellulose thành đường và các acid

hữu cơ

Ngoài vi nấm và vi khuẩn, xạ khuẩn và niêm vi khuẩn cũng có khả năng phân hủy cellulose Người ta thường sử dụng xạ khuẩn, đặc biệt là chi

Streptomyces trong việc phân hủy rác thải sinh hoạt Những xạ khuẩn này thường

thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 45 – 50 0C rất thích hợp với quá trình ủ rác thải.[2]

Nhìn chung, hệ vi sinh vật trong rơm rạ rất đa dạng về cả mặt phân loại và chức năng Tổng cộng có 259 chủng vi khuẩn và 45 loài nấm đã được phân lập với các đặc tính chức năng khác nhau Sự đa dạng cộng đồng vi sinh vật trong rơm rạ được đánh giá bằng việc giải trình tự 16S rDNA đã cho kết luận rằng có 17 họ vi

khuẩn và 9 họ nấm có trong rơm Bacillaceace, Burkholderiaceae, Enterobacteraceae và Pseudomonadaceae là các họ phổ biến nhất Hoạt động phân giải cellulose được phát hiện ở Bacilliaceae, Enterobacteriaceae, Flexibateraceae, Microbacteriaceae và Paenibacillaceae Hoạt tính phân giải chitin phổ biến ở các loài Flexibacterceae, Burkholderiaceae, Enterobacteriaceae, Oxalobacteriaceae, Staphylococcaeae và Xanthomonadaceae Các tác nhân gây bệnh ở lúa tiềm năng là