ĐỀ TÀI PHÊ DUYỆT PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Người thực hiện Trần Thị Như Quỳnh Lớp CNTPA Khóa 61 Ngành Công nghệ thực phẩm Giáo v[.]
Trang 1HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN
GLUTATHIONE TỪ SINH KHỐI NẤM MEN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE GSH16
1
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Trang 31.1 Đặt vấn đề
Glutathione (GSH) là một hợp chất thiol phi protein, tồn tại trong tế
bào thực vật, động vật và vi sinh vật, là một chất chống oxy hóa
nội sinh quan trọng, hỗ trợ cho hệ thống miễn dịch và có tác động
khử độc trong tế bào
Hiện nay, các nước có nền công nghiệp vi sinh phát triển như Mỹ,
Canada, Hà Lan, Ba Lan, Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc, Hàn
Quốc,… chủ yếu tập trung nghiên cứu và sản xuất glutathione từ
nấm men
Ở nước ta hiện nay nhu cầu sử dụng các thực phẩm chức năng có
tác dụng phòng chống và chữa một số bệnh như gan, tiểu đường,
mỡ máu…là rất lớn Các sản phẩm chứa glutathione trên thị trường
hiện nay chủ yếu nhập ngoại giá thành cao, chưa đáp ứng được
phần lớn người tiêu dùng
Nghiên cứu các phương pháp thu nhận glutathione từ
sinh khối nấm men saccharomyces cerevisiae GSH16
PHẦN I MỞ ĐẦU
3
Trang 41.2 Mục tiêu
Mục tiêu chung
Lựa chọn được
phương pháp với
các điều kiện tối ưu
Xác định được phương pháp phá vỡ tế bào với các điều kiện tối ưu để
thu được lượng GSH đạt hiệu suất cao nhất
Xác định được các ảnh hưởng của điều kiện cô đặc và điều kiện sấy đến
quá trình thu nhận bột nấm men giàu GSH
Thu được sản phẩm đạt chất lượng cảm quan
Trang 52.1 Đối tượng
Nấm men khô Saccharomyces cerevisiae GSH16 trong dự án sản xuất thử nghiệm chế phẩm
glutathione (GSH) và thực phẩm chức năng giàu GSH từ nấm men Nấm men khô có hàm lượng GSH chiếm 2,3% và độ ẩm 2,05%
2.2 Bố trí thí nghiệm
Phương pháp sốc nhiệt
Phương pháp sử dụng enzyme Phương pháp trích ly bằng cồn
5
PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc chân không đến hiệu suất trích
ly GSH Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến
hiệu suất trích ly GSH
Trang 62.3 Phương pháp phân tích
Phân tích hàm lượng GSH nội bào của nấm men: Hàm lượng GSH của mẫu được đo theo phương
pháp alloxan GSH sẽ phản ứng với alloxan dưới các điều kiện của thí nghiệm Do peak hấp thụ của dung dịch phản ứng ở OD 305 nm, hàm lượng GSH có thể được xác định bằng phương pháp đo quang
UV
2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Excel và phần mềm thống kê SAS 9.0 Các số liệu được so sánh bằng phương pháp phân tích ANOVA trong phép so sánh Tukey một chiều
PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 73.1 Thu nhận SGH bằng phương pháp sốc nhiệt
3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian đun sôi đến hiệu suất trích ly GSH
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
7
Bảng 1 Ảnh hưởng của thời gian đun sôi đến
hiệu suất trích ly GSH
Thời gian đun sôi (phút)
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH trong dung dịch (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch (mg)
Hiệu suất trích ly GSH
Ghi chú: Các giá trị theo cột có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có nghĩa ở mức ý nghĩa α
= 0.05 trong phép so sánh tukey một chiều.
Trang 8PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Bảng 2 Ảnh hưởng của thời gian làm lạnh đến hiệu suất
trích ly GSH 3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian làm lạnh đến hiệu suất thu hồi GSH
Thời gian làm lạnh (phút)
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH trong dung dịch (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch (mg)
Hiệu suất trích ly GSH
Trang 93.1.3 Ảnh hưởng của số lần sốc nhiệt đến hiệu suất trích ly GSH
Bảng 3 Ảnh hưởng của số lần sốc nhiệt đến hiệu
suất trích ly GSH
9
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Số lần sốc nhiệt
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH trong dung dịch (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch
(mg)
Hiệu suất trích ly GSH
Ghi chú: Các giá trị theo cột có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có nghĩa ở mức ý nghĩa α
= 0.05 trong phép so sánh tukey một chiều.
Trang 103.2 Phương pháp trích ly cồn
3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến hiệu suất trích ly GSH
Bảng 4 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến hiệu
suất trích ly GSH
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nồng độ cồn (%)
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH trong dung dịch (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch (mg)
Hiệu suất trích ly GSH
Trang 113.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men khô/dung môi đến hiệu suất trích ly GSH
Bảng 5 Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men khô/dung môi đến hiệu suất trích ly GSH
11
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tỷ lệ nấm men khô/dung môi
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH trong dung dịch (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch (mg)
Hiệu suất trích ly GSH
(%)
Ghi chú: Các giá trị theo cột có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có nghĩa ở mức ý nghĩa α
= 0.05 trong phép so sánh tukey một chiều.
Trang 123.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất trích ly GSH
Bảng 6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất
Nồng độ GSH trong dung dịch (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch (mg)
Hiệu suất trích ly GSH
Trang 133.2.4 Ảnh hưởng của thời gian trích ly cồn đến hiệu suất trích ly GSH
Bảng 7 Ảnh hưởng của thời gian trích ly cồn
đến hiệu suất trích ly GSH
13
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thời gian trích ly (h)
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH trong dung dịch (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch (mg)
Hiệu suất trích ly GSH
Ghi chú: Các giá trị theo cột có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có nghĩa ở mức ý nghĩa α
= 0.05 trong phép so sánh tukey một chiều.
Trang 143.2.5 Ảnh hưởng của số lần trích ly cồn đến hiệu suất trích ly GSH
Bảng 8 Ảnh hưởng của số lần trích ly cồn
đến hiệu suất trích ly GSH
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Lần trích ly
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH trong dung dịch (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch (mg)
Hiệu suất trích ly GSH
Trang 153.3 Phương pháp sử dụng enzyme
3.3.1 Ảnh hưởng của loại enzyme đến hiệu suất trích ly GSH
Bảng 9 Ảnh hưởng của loại enzyme đến hiệu
Nồng độ GSH thu được (mM/L)
Hàm lượng GSH
(mg)
Hiệu suất trích ly GSH
(%) Papain 0,9 a ±0,01 9,31 a ±0,456 2,57 a ±0,154 11,17 a ±0,672
Trypsin 0,85 a ±0,01 9,93 a ±0,450 2,59 a ±0,148 11,26 a ±0,643
Flavourzyme 0,86 a ±0,01 10,60 b ±0,192 2,80 b ±0,018 12,17 a ±0,078
Ghi chú: Các giá trị theo cột có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có nghĩa ở mức ý nghĩa α
= 0.05 trong phép so sánh tukey một chiều.
Trang 163.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/sinh khối khô đến hiệu suất trích ly GSH
Bảng 10 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/sinh khối khô đến
hiệu suất trích ly GSH
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tỷ lệ enzyme/sinh khối khô (%)
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH thu được (mM/L)
Hàm lượng GSH
(mg)
Hiệu suất trích ly GSH
Trang 17Bảng 11 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/sinh khối
khô đến hiệu suất trích ly GSH 3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/sinh khối khô đến hiệu suất trích ly GSH
17
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tỷ lệ nước/sinh khối khô
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH thu được (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch (mg)
Hiệu suất trích ly GSH
(%) 2,5/1 0,89 d ±0,01 9,92 a ±0,188 2,71 c ±0,281 11,78 c ±1,225
3,5/1 3,84 b ±0,01 9,94 a ±0,308 11,73 a ±0,691 51 a ±3,005
Ghi chú: Các giá trị theo cột có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có nghĩa ở mức ý nghĩa α
= 0.05 trong phép so sánh tukey một chiều.
Trang 183.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất trích ly GSH
Để hoạt lực của enzyme hoạt động mạnh nhất lựa chọn nhiệt độ là 500C để enzyme flavozyme thủy phân nấm men sinh tổng hợp GSH Nhiệt độ thủy phân này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo
3.3.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân của enzyme đến hiệu suất trích ly GSH
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Bảng 12 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất trích ly GSH
Thời gian thủy phân (h)
Thể tích dịch thu được (mL)
Nồng độ GSH trong dung dịch (mM/L)
Hàm lượng GSH trong dung dịch (mg)
Hiệu suất trích ly GSH
(%)
Trang 19PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Hình 1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của các phương pháp tách chiết đến hiệu
suất trích ly GSH từ sinh khối tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
GSH16
Trang 203.4 Kết quả phân tích dịch trích ly trước khi cô đặc
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Các chỉ tiêu Hàm lượng
Bảng 13 Kết quả phân tích của dịch trích ly
trước khi cô đặc
Trang 21PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thu hồi dịch chiết nấm men bằng trích
Trang 223.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc chân không đến hiệu suất thu hồi GSH
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Bảng 14 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc chân không đến hiệu suất thu hồi GSH
Các chỉ tiêu Nhiệt độ cô
Nồng độ GSH trong dung dịch (µM/l) 18674
Trang 233.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đầu vào đến hiệu suất thu hồi GSH
23
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Bảng 15 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đầu vào đến hiệu suất thu hồi GSH
Các chỉ tiêu Nhiệt độ sấy đầu vào
Vàng nhạt, bột tơi xốp, mịn, không bị dính thùng sấy, mùi thơm
Vàng nâu , mất mùi thơm, hơi có mùi cháy khét, bột tơi, mịn
Hiệu suất thu hồi GSH
sau khi sấy so với dịch
cô đặc (%)
Trang 24PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
1 Đã xác định được phương pháp thu nhận dịch chiết
GSH bằng phương pháp trích ly cồn đem lại hiệu suất thu
hồi GSH cao nhất.
2 Đã xác định được các thông số, điều kiện tối ưu nhất
trong phương pháp trích ly cồn để thu được hiệu suất trích
ly cao nhất là 66,35%:
- Nồng độ cồn: 30%
- Nhiệt độ của quá trình trích ly là: 25 0 C
- Thời gian chiết: 2h
- Tỷ lệ nấm men khô/dung môi là: 1/10
- Số lần trích ly: 2 lần
3 Đã xác định được nhiệt độ 600 C là phù hợp nhất cho
quá trình cô đặc chân không, thời gian cô đặc 90 phút
Hiệu suất thu hồi GSH là 90%, thu được dịch có màu vàng
rơm, mùi thơm.
4 Đã xác định được nhiệt độ sấy phun đầu vào là: 1700 C,
4.2 Kiến nghị
• Nghiên cứu thêm về các phương pháp thu nhận dịch chiết GSH khác
• Ứng dụng tạo ra nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng ăn và uống giàu GSH.
Trang 25CẢM ƠN QUÝ THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ CHÚ Ý LẮNG NGHE!