Vận chuyển điện tử trong con đường chuyển đổi acetate thành methane trong vi khuẩn cổ sống ở biển methanosarcina acetivorans

So với các tế bào phát triển bằng metanol, M. acetivorans phát triển bằng acetate đã tổng hợp một lượng protein lớn hơn được mã hóa trong một đơn vị phiên mã 7 gen được chú thích cho phức hợp Mrp được báo cáo trước đây là hoạt động như một antiporter (chất trao đổi) chuyển natriproton trong liên giới Vi khuẩn. Sự khác biệt được báo cáo ở đây giữa M. acetivorans và M. mazei có thể là do sự thích nghi của M. acetivorans với môi trường biển.

VẬN CHUYỂN ĐIỆ N TỬ T RONG CON ĐƯ Ờ NG CHUYỂN ĐỔI

ACET ATE TH ÀNH METHANE T RO NG VI KHUẨN CỔ SỐ NG Ở BIỂN

METHANOSARCI NA ACETI VORANS

Tóm tắt

Phương pháp sắc ký lỏng – hybrid linear ion trap– phương pháp phổ khối cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier (Khối phổ cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier là một loại máy phân tích khối lượng để xác định tỷ lệ khối lượng trên điện tích của các ion dựa trên tần

số cyclotron của các ion trong một từ trường cố định) được sử dụng để xác định sự đa dạng khác biệt của protein trong các tế bào tăng trưởng acetate so với protein trong các tế bào tăng

trưởng metanol của Methanosarcina acetivorans phân lập ở biển về mặt trao đổi chất đánh dấu

14N so với 15N Nhiều hơn 246 protein khác nhau ở M acetivorans được so sánh với 240 gen biểu hiện khác nhau đã được báo cáo trước đó của Methanosarcina mazei phân lập nước ngọt

được xác định bằng phiên mã của các tế bào phát triển bằng acetate so với các tế bào phát triển bằng metanol Sự khác biệt rõ ràng đã được tiết lộ đối với các protein liên quan đến vận chuyển

điện tử và bảo tồn năng lượng So với các tế bào phát triển bằng metanol, M acetivorans phát

triển bằng acetate đã tổng hợp một lượng lớn hơn các tiểu đơn vị được mã hóa trong một đơn

vị phiên mã 8 gen tương đồng với các operon mã hóa phức hợp vận chuyển điện tử Rnf chuyển

vị ion được đặc trưng trước đó từ liên giới Vi khuẩn (domain bacteria) Kết hợp với các phân tích trình tự và sinh lý học, những kết quả này cho thấy rằng M acetivorans thay thế phức hợp

H2-evolving Ech hydrogenase của các loài Methanosarcina nước ngọt bằng phức hợp Rnf,

tạo ra gradient ion xuyên màng để tổng hợp ATP So với các tế bào phát triển bằng metanol,

M acetivorans phát triển bằng acetate đã tổng hợp một lượng protein lớn hơn được mã hóa

trong một đơn vị phiên mã 7 gen được chú thích cho phức hợp Mrp được báo cáo trước đây là

hoạt động như một antiporter (chất trao đổi) chuyển natri/proton trong liên giới Vi khuẩn Sự khác biệt được báo cáo ở đây giữa M acetivorans và M mazei có thể là do sự thích nghi của

M acetivorans với môi trường biển

Giới thiệu

Việc chuyển đổi sinh khối trong điều kiện kị khí thành khí methane là điều cần thiết cho chu trình carbon toàn cầu Hầu hết khí methane được tạo ra bởi quy trình hai bước trong

đó chất hữu cơ phức tạp được lên men thành acetate, chất này sau đó được chuyển đổi thành

khí methane và carbon dioxide Quá trình tương tự cũng là chìa khóa để biến đổi sinh khối thực vật có thể tái tạo thành khí methane (biomethanation: biometan hoá là một quá trình trong đó vật liệu hữu cơ được chuyển đổi bằng vi sinh vật trong điều kiện yếm khí thành khí sinh học) như một nguồn năng lượng thay thế Việc sản xuất cây trồng năng lượng tái tạo cho quá trình biometan hoá đặc biệt thuận lợi để giảm lượng khí thải CO2 vào khí quyển, vì CO2 được tạo ra bằng cách đốt cháy khí methane và được tái chế thông qua quá trình quang hợp của thực vật

Sự hiểu biết về con đường chuyển đổi acetate thành methane là hết sức quan trọng đối với việc phát triển các thông số quy trình để kiểm soát và tối ưu hóa quá trình biến đổi sinh học quy mô lớn của sinh khối tái tạo Cơ sở cho sự hiểu biết này là việc xác định các protein mới cần thiết cho con đường hình thành khí methane từ acetate Cơ sở cho sự hiểu biết này là việc xác định các protein mới cần thiết cho con đường hình thành khí methane từ acetate Hồ sơ phiên mã

của loài nước ngọt Methanosarcina mazei (17) đã xác định các gen được điều chỉnh tăng để

đáp ứng với sự phát triển của axetat so với sự phát triển của methanol, cho thấy vai trò của các protein được mã hóa đặc trưng cho con đường chuyển hóa acetate thành methane Kết quả cho

thấy con đường ở M mazei tương tự như con đường được đề xuất trước đây đối với các loài Methanosarcina nước ngọt khác (8–10, 29) Một phân tích proteomic gần đây của các loài vi sinh vật biển Methanosarcina acetivorans sử dụng điện di trên gel hai chiều và matrix -assisted

laser desorption– time of flight tandem mass spectrometry (MS) (gel 2-D/MS) đã xác định được 34 protein có nhiều hơn ở các tế bào phát triển trong acetate so với các tế bào phát triển trong methanol (25, 26) Ở đây, chúng tôi báo cáo một phân tích sâu hơn bằng cách sử dụng sắc ký lỏng (LC)–hybrid linear ion trap –Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR)

MS để xác định các protein phong phú khác nhau từ các tế bào tăng trưởng bằng acetate so với các tế bào tăng trưởng bằng methanol được đánh dấu chuyển hóa bằng 14N so với 15N tương ứng Kết quả cung cấp sự hiểu biết chi tiết hơn về con đường acetate ở loài vi sinh vật biển

này, cho thấy sự khác biệt sâu sắc trong con đường chuyển hóa acetate thành methane của M acetivorans so với của M mazei và các loài Methanosarcina nước ngọt khác

Vật liệu và phương pháp

Tăng trưởng tế bào

Các tế bào phát triển từ acetate của M acetivorans được nuôi cấy như mô tả trước đây

(25) Các tế bào sinh trưởng trong methanol được nuôi cấy như mô tả trước đây (25), ngoại trừ việc 14NH4Cl được thay thế bằng 15NH4Cl (98%) (Sigma, St Louis, MO) Các tế bào từ cả hai môi trường đã được thu trong giai đoạn giữa của sự tăng trưởng theo cấp số nhân ở mật độ

quang học ở 600nm lần lượt là 0,8 và 0,6 đối với các môi trường acetate và methanol, như đã

mô tả trước đây (25)

Chiết xuất protein, điện di trên gel SDS-polyacrylamide (PAGE) và phân hủy trong gel

Tế bào từ khoảng 40 ml dịch nuôi cấy được tái huyền phù trong 100 µl Tris-HCl 10

mM chứa 5 mM MgCl2 và 100 U DNase (Roche, Indianapolis, IN) và ủ trên đá trong 20 phút Phương pháp xử lý này được thực hiện sau khi bổ sung 900 µl urê 8 M chứa 0,05% sodium dodecyl sulfate (SDS) và vortex trong 3 phút Lysate toàn bộ tế bào đã được làm sạch bằng cách ly tâm ở 13.000 x g trong 20 phút ở 4°C Nồng độ của chiết xuất protein toàn tế bào, được xác định bằng xét nghiệm Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA), từ các tế bào tăng trưởng bằng acetate và methanol lần lượt là 5,8 và 3,5 mg/ml Chiết xuất toàn tế bào của các tế bào tăng trưởng bằng acetate và methanol được kết hợp để tạo ra hỗn hợp 1:1 (khối lượng/trọng lượng) của các protein được đánh dấu 14N và 15N Một phần dịch chiết chứa 40 µg của hỗn hợp đã được pha loãng thành 45 µl với dung dịch đệm mẫu SDS-PAGE bao gồm 2% (wt/vol) SDS, 25% (vol/vol) glycerol, 100 mM dithiothreitol, 0,01% bromophenol xanh lam và 62,5 mM HCl (pH 7) Mẫu được phân giải trong a precast 12-well linear gradient Criterion Tris-HCl gel từ 10,5 đến 14% (Bio-Rad, Hercules, CA) được phát triển ở 160 V trong 50 phút Gel được nhuộm bằng bạc như mô tả trước đây (32) Các làn (lanes) được cắt thành 10 phân đoạn, mỗi phân đoạn chứa tổng mật độ gần giống như ước tính bằng cách kiểm tra trực quan với sự

hỗ trợ của nguồn sáng mờ Mỗi phần được băm riêng thành các khối ~1-mm3 và được rửa, phân hủy trong gel và các bước chiết xuất peptide như đã mô tả trước đây (36), ngoại trừ việc thể tích dung dịch được thêm vào cho mỗi bước đã được điều chỉnh để phù hợp với thể tích của các miếng gel cho mỗi phần SDS-PAGE Sequencing-grade Trypsin (Promega, Madison, WI) đã được sử dụng làm enzyme tiêu hóa Dung dịch chiết xuất peptide thu được cho mỗi phân đoạn ( ~1,2 ml) được cô đặc đến thể tích cuối cùng ~ 30 ul trong hệ thống SPD1010 SpeedVac (Thermo Savant, Holbrook, NY) ở 45°C trong ống ly tâm siêu nhỏ 1,5 ml

Xác định protein và xác định tỷ lệ đa dạng

Protein được xác định từ chiết xuất peptide của từng phần gel SDS-PAGE một chiều bằng cách sử dụng chiến lược (strategy) shotgun proteomics tương tự như đã mô tả trước đây (42) Khoảng 10 µl của dung dịch chiết xuất peptide đã được nạp vào cột 100 dBx 15 cm được chứa đầy với các hạt MagicC18 5~um (Michrom BioResources, Auburn, CA) theo sau là một

gradient tuyến tính (linear gradient) 75 phút từ 2% đến 35 % (vol/vol) acetonitril trong 0,1% axit formic sử dụng tốc độ dòng chảy 300-nl/min Thiết bị Hydrid linear ion trap-FTICR (LTQ

FT MS; Thermo Electron, San Jose, CA) đã được sử dụng để phân tích Trong một chu kỳ thu thập dữ liệu, một lần quét biến đổi MS Fourier (FT) có độ phân giải cao duy nhất với sự tích lũy lên đến 2 x106 ion được theo sau bởi việc thu được phổ MS song song bằng cách sử dụng linear ion trap (tích lũy 3x104 ion) lên đến bảy trong số các ion mạnh nhất với loại trừ động học được đặt 1 phút Một chu kỳ thu thập dữ liệu duy nhất đã hoàn thành trong khoảng 3,5 giây Mỗi phần SDS-PAGE một chiều được phân tích hai lần Dữ liệu thu được được tìm kiếm dựa trên cơ sở dữ liệu NCBI của M acetivorans C2A trong hai tìm kiếm Sequest riêng biệt, một tìm kiếm tương ứng với 14N và tìm kiếm kia tương ứng với ghi nhãn 15N The precursor ion mass tolerance được đặt thành ±1,4 Da và trypsin được chỉ định là enzyme phân giải protein với tối đa hai lần phân cắt bị bỏ sót Để giảm thiểu tỷ lệ nhận dạng âm tính giả, các peptides được xác định bằng các giá trị tương quan chéo (Xcorr) lớn hơn 1,5 (1) tái tạo LC/hybrid linear ion trap-FTICR MS chạy ban đầu đã được chọn Chỉ những peptit có dung sai khối lượng tiền chất (the precursor mass tolerance) là ±10 ppm sau đó mới được chấp nhận là nhận dạng chính xác Trong khoảng 15% số lần nhận dạng peptide, đồng vị thứ hai ban đầu được chỉ định làm ion tiền chất, dẫn đến sự dịch chuyển khối lượng 1-Da Trong những trường hợp này, sự dịch chuyển đã được hiệu chỉnh cho đỉnh đơn đồng vị trước khi áp dụng giới hạn độ chính xác khối lượng tiền chất 10 ppm Độ phong phú tương đối của các peptit đã xác định sau đó được tính toán bằng chương trình do phòng thí nghiệm phát triển (2) xác định tỷ lệ diện tích đỉnh sắc ký (chromatographic peak areas) của các cặp peptit được đánh dấu đồng vị Để định lượng thành công, phải tìm được cặp peptit 14N15N đồng rửa giải với ít nhất một peptit được xác định bằng cách sử dụng tiêu chí tìm kiếm cơ sở dữ liệu được chỉ định ở trên và sự chênh lệch khối lượng giữa các peptit tương ứng với số lượng nguyên tử nitơ trong chuỗi peptit Trong bước tiếp theo,

tỷ lệ phong phú tương đối của protein được tính bằng cách lấy trung bình tỷ lệ phong phú peptide đã xác định Điều quan trọng là, sự kết hợp của dung sai khối lượng tiền chất (±10 ppm), các giá trị Sequest Xcorr và sự hiện diện của một cặp đỉnh kết hợp đã cung cấp khả năng nhận dạng protein có độ tin cậy cao

Phân tích sắc tố tế bào

Các phần màng tế bào và tế bào chất được phân tách theo cách tương tự như mô tả trước đây (21) Các tế bào được tái tạo huyền phù trong dung dịch đệm Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) chứa DNase I (10 ug/ml) và được phá vỡ bằng cách cho chúng 2 lần đi qua máy ép tế bào áp

lực của Pháp (French pressure cell press: là một thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm sinh học để phá vỡ màng sinh chất của tế bào bằng cách đưa chúng qua một van hẹp dưới áp suất cao) ở 1,38x108 Pa Các mảnh vụn của tế bào được tách ra bằng cách ly tâm ở 10.000 x g trong

20 phút ở 4°C Dịch chiết tế bào được tách thành các phần màng tế bào và tế bào chất bằng cách ly tâm ở 100.000 μg trong 60 phút ở 4°C Dung dịch nổi phía trên được loại bỏ và màng chứa pellet được rửa một lần bằng dung dịch đệm được mô tả ở trên và được nối lại trong cùng một dung dịch đệm Nhuộm heme của các protein được phân tách bằng SDS-PAGE được thực hiện bằng cách sử dụng o-dianisidine (Sigma) như đã mô tả trước đây (35) Band 55-kDa được tiết lộ bằng cách nhuộm heme của phần màng từ các tế bào tăng trưởng acetate đã được cắt bỏ

và chịu sự tiêu hóa trong gel và chiết xuất peptide như mô tả ở trên Các peptide được phân tích bằng LC/hydrid linear ion trap-FTICR MS Reduced-minus-oxidized-difference của các phân đoạn màng thu được ở nhiệt độ phòng như đã mô tả trước đây (22) bằng cách sử dụng máy đo quang phổ Beckman DU-7400 Các mẫu được oxy hóa trong không khí và sau đó khử bằng một vài hạt dithionite

RT-PCR

Phiên mã ngược (RT)-PCR đã được thực hiện như mô tả trước đó (24), với các sửa đổi RNA tổng số được phân lập từ các tế bào M acetivorans tăng trưởng bằng axetat hoặc metanol bằng cách sử dụng bộ RNeasy Total RNA Mini (QIAGEN) RNA tinh khiết được xử

lý hai lần bằng DNase I không chứa RNase (QIAGEN) và một lần bằng RQ1 DNase (Promega)

để loại bỏ DNA gây ô nhiễm RT-PCR được thực hiện với bộ Access RT-PCR (Promega) sử dụng 50 đến 100 ng RNA tổng số đã tinh chế (trình tự mồi và cặp mồi được sử dụng lần lượt được liệt kê trong Bảng S1 và S2 trong tài liệu bổ sung) PCR đối chứng được thực hiện mà không cần bổ sung RT với bốn bộ mồi khác nhau để xác nhận việc loại bỏ hoàn toàn DNA

Kết quả và thảo luận

Xác định protein

Các phân tích gel/MS 2-D trước đó của M acetivorans phân lập ở biển đã xác định

được tổng cộng 412 gen sản phẩm Việc xác định cường độ điểm được chỉ định rằng có 34 sản phẩm gen khác nhau giữa các tế bào phát triển bằng axetat và metanol Để có được một phân tích định tính và định lượng sâu hơn, chúng tôi sử dụng cột ion tuyến tính LC/lai-FTICR MS

để phân tích tế bào phát triển bằng axetat và metanol được dán nhãn chuyển hóa bằng 14N và

15N tương ứng Tổng cộng có 1.081 protein được phát hiện (dữ liệu chưa được công bố), chiếm 21% trong số 4.524 gen được báo cáo trong bộ gen Trong số 1.081 protein được phát hiện,

246 đã được tìm thấy có sự khác biệt gấp 3 lần giữa tế bào phát triển bằng axetat và metanol được xác định bằng hai hoặc nhiều cặp peptit hơn 246 protein này được coi là có thể đóng vai trò cụ thể đối với sự tăng trưởng hoặc hình thành khí mê-tan từ metanol hoặc axetat Lịch sử

phiên mã gần đây của chủng phân lập nước ngọt M mazei đã phát hiện 3.371 gen được biểu

hiện, 240 trong số đó cho thấy sự biểu hiện khác biệt gấp 2,5 lần giữa tế bào phát triển bằng axetat và metanol

Trong số 246 protein khác nhau được xác định cho M acetivorans, 60 được mã hóa bởi các gen tương đồng ≥2,5 lần được biểu hiện chuyên biệt ở M mazei Trong số 60 protein này

từ M acetivorans, các mô hình phong phú khác nhau cho 57 protein phù hợp với hồ sơ phiên

mã của M mazei Hơn nữa, các phương pháp được báo cáo ở đây cho M acetivorans đã xác

định được 20 loại protein đa dạng khác nhau trước đây được xác định bởi gel/MS 2-D so với các mẫu phân tích của tất cả 20 protein đều phù hợp với kết quả gel/MS 2-D Những kết quả này là một bằng chứng xác nhận mạnh mẽ các phương pháp thử nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu này Ở đây, chúng tôi tập trung vào các protein chọn lọc có tính đa dạng khác biệt cao đã xác định được hai phức hợp enzyme được đề xuất liên quan đến chức năng vận chuyển

điện tử ở M acetivorans phát triển bằng axetat

Con đường chuyển đổi acetate thành metan trong M.acetivorans

Lịch sử phiên mã của các tế bào M mazei phát triển bằng acetate so sánh với methanol

cho thấy con đường chuyển đổi acetate thành metan tương tự như trước đây được xác định đối

với các loài Methanosarcina nước ngọt khác Tuy nhiên, M acetivorans được phân lập từ trầm

tích biển trong đó nó có chức năng chuyển đổi acetate thành metan trong quá trình phân hủy

kỵ khí của tảo bẹ khổng lồ Do đó, so sánh bản sao của các chủng phân lập nước ngọt M Mazei với protein của M acetivorans có giá trị để xác định các enzyme lõi thiết yếu trong đường dẫn

acetate và cách đánh giá tính linh hoạt trao đổi chất để đáp ứng với môi trường Phương pháp thử nghiệm tiên tiến được sử dụng trong nghiên cứu này đã xác định một số protein không được xác định trong phân tích gel/MS 2-D trước đó, dẫn đến sự hiểu biết chi tiết hơn về con đường như trong Hình 1 Con đường tổng thể có thể được chia thành hai phần Phần đầu tiên liên quan đến việc chuyển đổi nhóm methyl của acetate thành metan, được gọi là phản ứng của một carbon được xúc tác bởi các enzyme thể hiện màu xanh trong hình 1

Hình 1 Con đường được đề xuất để chuyển đổi acetate thành metan bởi M acetivorans

ACK, acetate kinase; PTA, phosphotransacetylase; COA-SH, Coenzyme A; Thmpt, tetrahydromethanopterin; FDR, giảm ferredoxin; FDO, oxy hóa ferredoxin; CDH, CO dehydrogenase/acetyl CoA synthase; Com-sh, coenzyme m; MTR, methyl-THMPT: com-SHYLTransferase; COB-SH, Coenzyme B; Cam, anhydrase carbonic; MA-RNF, M

Acetivorans RNF; MP, methanophenazine; HDR-DE, heterodisulfide reductase; MRP, nhiều sức cản/pH điều chỉnh Na+ /H+ đối vận (antiporter); ATP, H -Transporting ATP synthase Phản ứng chuyển carbon được xúc tác bởi các enzyme thể hiện màu xanh lam (xem văn bản) Phản ứng truyền electron được xúc tác bởi các enzyme thể hiện màu xanh lá cây

(i) Các phản ứng một carbon dẫn đến metan

Các kết quả thể hiện trong Bảng 1 phù hợp với vai trò được đề xuất trước đây đối với acetate kinase, phosphotransacetylase, CO dehydrogenase/acetyl coenzyme A (COA), methyl-tetrahydromethanopterin (THMPT) bởi các phân tích gel 2-D/MS Tuy nhiên, các phương pháp tiên tiến được sử dụng trong nghiên cứu này tiếp tục cho thấy anhydrase carbonic (CAM;

MA2536) có nhiều hơn trong các tế bào M acetivorans phát triển trong môi trường acetate, tương ứng với sự tăng điều hòa của gen mã hóa enzyme trong M Mazei Sự tham gia của

enzyme này trong việc chuyển đổi acetate thành metan lần đầu tiên được báo cáo cho

Methanosarcina thermophila và trước đây được đề xuất để tạo điều kiện cho việc loại bỏ CO2

khỏi tế bào bằng cách chuyển đổi nó thành bicarbonate bên ngoài tế bào (Hình 1)

Bảng 1 Sự đa dạng của các protein đóng vai trò trong con đường chuyển hóa Acetate thành

Methane trong M acetivorans

Tất cả các enzyme được đề xuất để xúc tác chuyển đổi nhóm methyl của actetate thành

metan bởi M acetivorans (Hình 1) đã được xác định ở các loài Methanosarcina nước ngọt khác và gần đây bằng cách phân lập M Mazei nước ngọt Do đó, các enzyme và phản ứng này

có thể được coi là cốt lõi đối với con đường chuyển đổi acetate thành metan bởi các loài

Methanosarcina trong môi trương nước ngọt và ở biển Tuy nhiên, các kết quả được trình bày

trong phần tiếp theo cho thấy sự khác biệt đáng kể trong các phản ứng vận chuyển điện tử trong

con đường acetate của M acetivorans so với các loài Methanosarcina nước ngọt khác

(ii) Vận chuyển điện tử và bảo toàn năng lượng Sự phong phú của Cdh trong các tế

bào phát triển trong axetat so với trong các tế bào phát triển trong metanol đã được báo cáo trước đó (25, 26) và được xác nhận ở đây cho thấy rằng bước vận chuyển điện tử đầu tiên được

đề xuất cho M acetivorans cũng giống như bước đối với M mazei và các loài Methanosarcina

nước ngọt khác, trong đó Cdh oxy hóa nhóm carbonyl của acetyl-CoA và cho điện tử cho ferredoxin (40, 41) Tuy nhiên, như được nêu chi tiết bên dưới trong các phần tiếp theo, sự vận

chuyển điện tử từ ferredoxin đã khử sang CoM-S-S-CoB được đề xuất ở đây cho M acetivorans

(Hình 1) về cơ bản khác với sự vận chuyển của các loài nước ngọt Ở các loài nước ngọt, ferredoxin khử được đề xuất để tặng điện tử cho Ech hydrogenase gắn màng tạo ra H2 và bơm proton ra ngoài màng (15, 28, 29) H2 bị oxy hóa bởi một hydrogenase khác tặng điện tử cho methanophenazine trong màng Cuối cùng, methanophenazine đã khử sẽ tặng các electron cho heterodisulfide reductase làm giảm CoM-S-S-CoB, kèm theo sự đẩy ra của các proton Tuy

nhiên, bộ gen của M acetivorans không chứa gen mã hóa Ech hydrogenase chức năng (11, 18),

cho thấy các thành phần vận chuyển điện tử thay thế liên quan đến việc chuyển điện tử sang CoM-S-S-CoB

Các phân tích gel/MS 2-D trước đây chỉ ra rằng sản phẩm của MA0659 có trong các tế

bào M acetivorans được nuôi cấy bằng axetat; tuy nhiên, mức độ phong phú so với các tế bào

phát triển bằng metanol không được xác định, điều này ngăn cản việc đề xuất vai trò của sản phẩm này trong việc chuyển đổi một trong hai cơ chất thành metan (25) Tuy nhiên, người ta đưa ra giả thuyết rằng MA0659 mã hóa một trong sáu tiểu đơn vị của phức hợp được mã hóa bởi cụm gen MA0659- 0664 với khả năng thay thế chức năng bơm ion của Ech hydrogenase

Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng các sản phẩm của MA0659, MA0661 và MA0664 có nhiều hơn

gấp nhiều lần trong các tế bào phát triển trong axetat so với các tế bào M acetivorans phát triển

trong metanol (Bảng 1), hỗ trợ vai trò trong con đường axetat Hơn nữa, phân tích RT-PCR cho thấy MA0658 và MA0665 được đồng phiên mã với MA0659-664 (Hình 2) Cuối cùng,

việc xóa các gen đồng phiên mã tạo ra một đột biến của M acetivorans không thể phát triển

trong axetat (P C W Metcalf, Đại học Illinois) Những kết quả này cho thấy một cách mạnh

mẽ rằng MA0658-0665 mã hóa phức hợp tám tiểu đơn vị hoạt động trong quá trình phát triển

của M acetivorans trong axetat Đáng chú ý, bộ gen của M mazei không chứa các gen tương đồng với MA0658-0665 (18), hỗ trợ thêm cho vai trò của phức hợp đặc trưng cho M acetivorans

Mặc dù MA0659-0664 được chú thích là mã hóa cho các tiểu đơn vị của sodium translocating NADH:ubiquinone oxyoreductase (Nqr), nhưng việc tìm kiếm cơ sở dữ liệu cho thấy rằng các trình tự axit amin có sự tương đồng lớn hơn với các tiểu đơn vị của phức hợp Rnf (cố định đạm Rhodobacter) có liên quan, và bản sắc lớn nhất là với cụm gen rnf được chú thích

cho Clostridium tetani (Hình 3) Phức hợp Rnf lần đầu tiên được mô tả trong Rhodobacter capsulatus (34), nơi nó được đề xuất để mã hóa phức hợp liên kết màng sáu tiểu đơn vị (20)

(RnfABCDGE) oxy hóa NADH và khử một ferredoxin sau đó tặng điện tử cho nitrogenase

Hình 2 Lập bản đồ phiên mã cụm gen M acetivorans bằng RT-PCR (A)

MA4566-MA4572 (B) MA0658-MA0665 Mũi tên đại diện gen và hướng phiên mã Các sản phẩm RT-PCR dự đoán được thể hiện bằng các dòng bên dưới gen và được dán nhãn bằng các chữ cái Dự đoán kích thước sản phẩm RT-PCR được hiển thị trong ngoặc đơn Các chữ cái phía trên các làn gel tương ứng với các sản phẩm RT-PCR dự đoán RT-PCR

được thực hiện với tổng số RNA từ các tế bào M acetivorans được nuôi cấy bằng axetat