Các phương pháp phát hiện thực phẩmthức ăn chăn nuôi chứa thành phần từ sinh vật biến đổi gen

Đó có thể là động vật hay thực vật mang các gene tái tổ hợp chuyển vào một cách nhân tạo nhờ công nghệ sinh học thay đổi một số phân tử DNA như các loại ngũ cốc, rau củ, trái cây, gia sú

Đề tài: Các phương pháp phát hiện thực phẩm/thức ăn chăn nuôi chứa thành phần từ sinh vật biến

đổi gen GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành

1

Tổng quan và đặt vấn

đề

Tổng quan và đặt vấn

đề

• Thực phẩm biến đổi gene (GMF - genetically modified food) là thực phẩm được chế biến từ các cơ thể sinh vật chuyển đổi gene (GMO - genetically modified organism) Đó có thể là động vật hay thực vật mang các gene tái tổ hợp chuyển vào một cách nhân tạo nhờ công nghệ sinh học thay đổi một

số phân tử DNA như các loại ngũ cốc, rau củ, trái cây, gia súc,… để cho ra những phẩm chất mong muốn như: tăng khả năng chống cỏ dại, chống sâu bệnh hay tăng hàm lượng dưỡng chất,…

• Việt Nam đã cấp phép 21 sự kiện ngô, đậu tương biến đổi gen sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

• Việc xét chấp thuận một giống cây trồng GMO cụ thể có được trồng trong sản xuất hay không căn cứ vào kết quả đánh giá tính toán đối với môi trường, sức khỏe con người và động vật của giống đó, nghĩa là từng giống GMO được xem xét, đánh giá trước khi cho phép được đưa ra thị trường.

⇒ Vì thế nhiều kỹ thuật phân tích đã và đang được phát

triển để đáp ứng nhu cầu này Việc phát hiện và

nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen phải tiến hành ở

hai mức độ:

- Bước thứ nhất (ở mức độ thấp) là phát hiện có hay

không Muốn chuyển một gene nào đó vào nông sản thì

trong chuỗi gene sẽ có đoạn gene nối Phát hiện đoạn

gene nối tức là thực phẩm có chuyển gene

- Bước hai thì phải trang bị đoạn gene chuẩn (đoạn gene

primer) để so sánh và biết được họ đưa gene gì vào, như

gene tăng cường chuyển hoá đường hay gene kháng sâu

Tổng quan và đặt vấn

đề

*Việc nhận biết thực phẩm biến đổi gen rất cần thiết

đối với nhiều ứng dụng như để đánh giá mức độ sạch của hạt giống hay đối với việc bắt buộc dán nhãn thực phẩm ở một số quốc gia

Các phương pháp

phổ biến và ứng

dụng

Phương pháp dựa trên

⇨ Tập trung kỹ thuật Realtime-PCR

∙ Phương pháp dựa trên cơ sở RNA (Phân tích Northern blot)

Các pp phổ biến

Các phương pháp phổ biến và ứng dụng

Phương pháp dựa trên protein

ELISA

(Enzyme-linked immunosorbent assay)

• Mỗi protein thường có các kháng thể

đặc hiệu của riêng mình, do đó có

thể sử dụng các kháng thể đặc hiệu

để phát hiện protein đó

• Đặc điểm chung của phương pháp

Elisa là dựa trên sự kết hợp đặc

hiệu giữa kháng nguyên và kháng

thể, trong đó kháng thể được gắn

với một enzyme Khi cho thêm cơ

chất thích hợp (thường là

nitrophenol phosphate) vào phản

ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất

thành một chất có màu

Nguyên tắc

→ Sự xuất hiện màu chứng tỏ

đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

ELISA ASSAYS

Ứng dụng: Hiện nay, trên thị trường đã có một số loại kit Elisa như:

- Bộ kit Bt-Cry2Ab & Bt-Cry3Bb1: để phát hiện sự có mặt hoặc không có của các protein Bt-Cry2Ab & Bt-Cry3Bb1 được biểu hiện trong các sản phẩm ngô (MON

89034, MON 88017, MON 863, …).

- Bộ kit Bt-Cry3A: để phát hiện nội độc tố Bt chiết xuất từ mầm, củ và lá khoai tây chuyển gen biểu hiện gen Cry3A bị cắt ngắn.

- Bộ kit CspB: để phát hiện định tính protein CspB trong lá ngô (MON 87460, …)

- Bộ kit eCry3.1Ab: để phát hiện sự hiện diện có hoặc không có mặt của protein eCry3.1Ab biểu hiện trong hạt ngô hoặc lá ngô (sự kiện 5307 của Syngenta, …) Ngoài ra còn rất nhiều bộ kit khác như: Bt-Cry1Ab/1Ac; Bt-Cry1F; Bt-Cry2A;

…

Ứng dụng cụ thể

Phương pháp ELISA để xác định protein CP4 EPSPS có trong đậu tương Roundup Ready ®1 GTS 40-3-2 và các thành phần có nguồn gốc từ nó

• Đậu tương (Glycine max) là nguồn thực phẩm và thức ăn chăn nuôi quan trọng) Gần đây, thông qua công nghệ sinh học hiện đại người ta đã đưa một loại gen là cp4 epsps vào một số giống đậu tương

• Gen kháng glyphosat lấy từ loài vi khuẩn Agrobacterium dòng CP4 Protein CP4 EPSPS quy định tạo ra sức kháng thuốc diệt cỏ glyphosate (Roundup ®1) Protein CP4 EPSPS được tạo ra có thể được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu

Sau khi rửa, kháng thể đa dòng

đã liên kết với peroxidaza cải ngựa (horseradish peroxidas) (HRP) được thêm vào, kháng thể này liên kết đặc hiệu với vị trí kháng nguyên thứ hai trên protein CP4 EPSPS

Sau khi rửa, cơ chất màu tetramethylbenzidin (TMB) đặc hiệu đối với HRP được thêm vào, HRP tạo ra tín hiệu màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên trong dải tuyến tính Thêm dung dịch hãm để ngừng sự đổi màu Cường độ màu tạo thành được đo

ở bước sóng 450 nm

1 Kháng thể đơn dòng

2 Bề mặt phủ

1 Kháng nguyên

2 Bề mặt phủ

1 HRP

2 Kháng thể phát hiện

3 Bề mặt phủ

Chuẩn bị mẫu

Lấy mẫu thử đồng nhất từ mẫu phòng thử nghiệm, mẫu kép, xem ISO 21568.

Đối với đậu tương nguyên liệu, nên lấy 2 000 g, trộn lẫn rồi nghiền nhỏ cho tới khi lọt qua rây Để phân tích định lượng thì kích cỡ hạt nghiền phải nhỏ hơn 150 mm và phân tích định tính phải nhỏ hơn 450 mm Khi rây bột phải cẩn thận tránh nhiễm

bẩn Ngoài ra, cần chú ý không làm mẫu bị nóng quá (protein CP4 EPSPS chưa bị phá hủy)

Chuẩn bị dung dịch kháng thể cộng hợp

• Dung dịch gốc kháng thể cộng hợp

Làm tan chất kháng thể cộng hợp đông khô (Protein thỏ kháng CP4 EPSPS cộng hợp với peroxidaza cải ngựa

(HRP), đông khô) bằng dung dịch đệm pha loãng cộng hợp (10 % huyết thanh chuột đã vô hoạt bằng nhiệt) theo hướng dẫn

• Chuẩn bị dung dịch đệm rửa

Pha loãng 10 lần dung dịch đệm rửa đậm đặc (Dung dịch đệm rửa đậm đặc 10 lần, PBS, Tween 20, pH 7,1) bằng nước

với tỷ lệ 1:10 (1+9).

Một vận hành gồm: phân tích trắng, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm và mẫu chưa biết Tất cả các dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu chuẩn và phân tích trắng phải được chạy hai lần song song

Nếu vận hành không đạt các tiêu chí chấp nhận thì phải lặp lại toàn bộ qui trình Các dung dịch mẫu thử không đạt được các tiêu chí chấp nhận trong bất kỳ lần vận hành nào thì phải tiến hành lần hai.

Tiêu chí chấp nhận hoặc loại bỏ kết quả

✔ Phương pháp thực hiện đơn giản

✔ Có tính kinh tế và cần ít kĩ năng hơn so với phương pháp dựa trên DNA

✔ Thiết bị đơn giản

- Nhược điểm:

o Độ nhạy thấp (giới hạn phát hiện trong khoảng 0,01 - 1%)

o Kit elisa cần bảo quản tốt mới đảm bảo chất lượng (ví dụ một số loại kit phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC)

o Cần kháng thể đặc hiệu (một số loại protein không có hoặc mất thời gian mới tạo ra kháng thể đặc hiệu cho nó)

o Định lượng đôi khi không chính xác bởi biến thiên hàm lượng protein do tác động bên ngoài như thời tiết, điều kiện dinh dưỡng

o Yêu cầu cao về cấu trúc protein: không biến tính, không bị gắn thêm các đoạn protein hay polisaccarit khác

Nguyên lý: Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn

chất màu được phân bố đều trên bản giấy sắc ký

• Kháng nguyên (KN) đặc thù của protein được

gắn cố định tại “vạch phản ứng”

• Khi nhỏ mẫu cần xác định kháng thể (KT) lên bản

sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong mẫu sẽ kết

hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch

KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ

bị giữ lại tại “vạch phản ứng” do KT kết hợp với

KN → “vạch phản ứng” hiện màu Nếu trong mẫu

Nguyên lý: Western Blot là kỹ thuật lai

giữa protein với protein (kháng nguyên - kháng thể) Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang

Phương pháp này sử dụng điện di trên gel SDS-PAGE để phân tách các protein còn nguyên vẹn bằng cấu trúc 3D hay protein

đã biến tính theo độ dài của mạch polypeptide Protein này sau đó sẽ được chuyển lên màng, ở đó chúng được gắn bằng các kháng thể đặc hiệu với protein mục tiêu

Phương pháp Western

Blot

Phương pháp khuếch đại trình tự nuceotide

PCR (pp dựa trên cơ

Realtime-sở DNA)

Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một kỹ thuật

sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một

hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp

lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao

của một trình tự DNA nào đó.

Realtime PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch

đại DNA đích hiển thị ngay ở mỗi chu kỳ nhiệt của

là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại.

Khi quá trình PCR diễn ra, ADN mới được tạo ra từ ADN khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử ADN tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền trong đó các mẫu DNA được khuếch đại theo cấp số nhân.

+ Phát hiện gen đặc trưng loài Lec

(đậu tương), gen Hmg (ngô)

Kết quả khuếch đại được quan sát thông qua các tín hiệu huỳnh quang được giải phóng trong quá trình phản ứng PCR xảy ra Các tín hiệu này được phát hiện và ghi lại dưới dạng biểu đồ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về số lượng sản phẩm khuếch đại DNA đích có mặt ở mỗi chu kỳ

Một số ứng dụng (từ viện Kiểm nghiệm VSATTP quốc gia)

để kháng một số sâu bộ cánh phấn, để định lượng số lượng tương đối ADN ngô dòng MON 89034

Nguyên tắc

• Đoạn ADN đặc hiệu ngô dòng MON 89034 kích thước 79 bp được khuếch đại bằng PCR

• Các sản phẩm PCR tích lũy được đo ở mỗi chu trình (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu trình tự đích được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang

• Để định lượng tương đối hàm lượng ADN ngô dòng MON 89034, sử dụng đồng thời các mồi

và đoạn dò đặc hiệu để khuếch đại đoạn 77 bp của gen hmg A trong các mẫu chuẩn ngô

Nguyên liệu

=>Chiều dài sản phẩm PCR đặc hiệu gen hmg A là 79 bp; chiều dài sản phẩm PCR đặc hiệu MON

89034 là 77 bp

• Nước

• Đệm PCR (không chứa magie clorua

• Dung dịch magie clorua (MgCl2), c(MgCl2) =

25 mmol/l

• Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (mỗi

loại)

• Các oligonucleotit

• Enzym ADN polymerase chịu nhiệt

• (Enzym ADN Polymerase của AmpliTaq Gold® 1)

• Uracil W-glycosylase (tùy chọn)

• Hỗn hợp phản ứng khuếch đại

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích đặc hiệu taxon và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang đánh dấu khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hoặc xác nhận giá trị sử dụng.

Sử dụng Máy chu trình nhiệt-hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 SDS và GeneAmp® 5700 SDS (Applied Biosystems)

Chuẩn bị ADN cho phản ứng PCR

(Xem TCVN 7606 (ISO 21571) về

nguyên tắc tách chiết axit nucleic

hoặc các sản phẩm kit tách chiết

thương mại phổ biến)

Kiểm chứng PCR

Có thể sử dụng các mẫu chuẩn được chứng nhận MON 89034 (vật liệu chứa < 0,02 % đến 100 % ngô biến đổi gen) được sản xuất bởi AOCS, ISO Guide 17034:2016 (dãy AOCS 0906-E) làm kiểm chứng dương và vật liệu so sánh chuẩn.

Chương trình thời gian-nhiệt

độ

Chương trình thời gian-nhiệt

độ được nêu trong Bảng được tối ưu hóa trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM® 7700 (Applied Biosysytem)

• Đối với định lượng tương đối, hàm lượng GMO đơn bội, w, được xác định theo công thức sau:

Một số ứng dụng khác

- Ưu điểm:

✔ Real-time PCR là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

✔ Real-Time PCR là kỹ thuật cho phép khuếch đại DNA mục tiêu và kết quả khuếch đại được thể hiện tức thì ngay sau mỗi chu kỳ phản ứng

✔ Hạn chế nguy cơ ngoại nhiễm do sản phẩm PCR

✔ Tiện lợi là một ưu điểm của kỹ thuật Realtime PCR

✔ Cho phép định lượng chính xác

✔ Tiết kiệm thời gian

- Nhược điểm:

o Chi phí đầu tư nghiên cứu cao

o Gặp không ít khó khăn trong việc thiết kế mẫu dò

o Đòi hỏi phải có trang thiết bị, trình độ cao

o Giới hạn về khả năng đọc huỳnh quang của thiết bị, nên khi dùng realtime pcr cao nhất chỉ phát hiện được 6 gene mục tiêu

PCR (pp dựa trên cơ

Realtime-sở DNA)

Northern blot là là một kỹ thuật được sử

dụng để nghiên cứu biểu hiện gen bằng

cách phát hiện RNA (hoặc cô lập mRNA )

trong một mẫu

Phương pháp dựa trên cơ sở RNA (Phân tích Northern blot)

Nguyên tắc: RNA mẫu được tách ra dựa

trên kích thước với sự trợ giúp của điện di

trên gel Các đoạn RNA đã tách được

chuyển đến một màng hỗ trợ và sau đó

được xử lý bằng một đầu dò DNA được

đánh dấu Nếu mẫu chứa trình tự RNA bổ

sung, đầu dò sẽ liên kết với màng và có thể

hình dung nó bằng nhiều phương pháp khác

nhau

Phương pháp dựa trên cơ sở RNA (Phân tích Northern blot)

-Ưu điểm:

✔ Độ đặc hiệu cao

✔ Có thể phát hiện ra những thay đổi nhỏ trong biểu hiện gen mà các phương pháp khác không thể phát hiện được

✔ Phát hiện kích thước RNA

✔ Quan sát các sản phẩm mối nối thay thế

✔ Sử dụng các đầu dò có độ tương đồng một phần

✔ Chất lượng và số lượng RNA có thể được đo trên gel trước khi thấm

-Nhược điểm:

∙ Phương pháp Northern blot tiêu chuẩn có độ nhạy thấp

∙ Kỹ thuật này yêu cầu một lượng lớn trình tự mẫu RNA đích trong khi các kỹ thuật mới hơn như PCR thời gian thực chỉ cần một bản sao RNA duy nhất để khuếch đại

RT-∙ Kỹ thuật Northern blot rất nhạy cảm với sự phân hủy nhỏ của các mẫu RNA Sự xuống cấp ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng và định lượng dữ liệu

∙ Northern blot chỉ có thể đo sự tích lũy mRNA ở trạng thái ổn định chứ không phải sự ổn định của RNA hoặc tốc độ phiên mã

Kết luận

03

✔ Cho đến nay các phương pháp chính đã phát triển

để phát hiện GMO và các dẫn xuất của GMO chủ

yếu dựa trên việc phát hiện DNA, trong khi chỉ một

vài phương pháp đã được phát triển để phát hiện

protein hoặc RNA

✔ Việc khảo nghiệm được thực hiện theo các quy định

pháp lý hiện hành của Việt Nam, đồng thời đảm bảo

các yêu cầu chung của quốc tế về khảo nghiệm đánh

giá rủi ro cây trồng GMO Theo quy trình, từ việc

khảo nghiệm giống cây trồng GMO đến khi được

phép sử dụng trong sản xuất phải trải qua nhiều

bước rất chặt chẽ và được quy định của luật pháp

Việc quy định một giống cây trồng GMO được sử

dụng làm thức ăn chăn nuôi hoặc làm thực phẩm

phải là giống đã được 5 nước phát triển trên thế giới

cho phép sử dụng là rất chặt chẽ

• TCVN 7607 : 2007, Thực phẩm – Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – Phương pháp dựa trên protein

• TCVN 12613:2019 (ISO 21570:2005), Thực phẩm – Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – Phương pháp dựa trên định lượng axit nucleic

• JRC Compendium of Reference Methods for GMO Analysis (2011), Quantitative PCR method for detection of maize event MON 89034

• Sinh vật và thực phẩm biến đổi gen- Cục quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản

• Trang web: https://www.isaaa.org/ và một số trang web liên quan

Tài liệu tham

khảo

-THANKS FOR WATCHING-