Mô hình đánh giá hoạt tính làm sáng da

N I DUNG CHÍNH ỘI DUNG CHÍNH Tổng quan về melanin và cách hình thành sắc tố trên da  Enzyme tyrosine và cơ chế chống hình thành sắc tố  Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro củ

MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH LÀM SÁNG DA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TPHCM – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM

Khoa Hóa học

Môn: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN & PHÁT TRIỂN THUỐC

Giảng viên: GS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai

N I DUNG CHÍNH ỘI DUNG CHÍNH

 Tổng quan về melanin và cách hình thành sắc tố trên da

 Enzyme tyrosine và cơ chế chống hình thành sắc tố

 Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của

chất ức chế được chiết xuất từ cây Secang

 Thử nghiệm in vivo của DeoxyArbutin trên động vật

và trên người

Tổng quan về melanin và cách hình thành sắc tố trên da

Tổng quan về melanin

 Melanin là sắc tố quyết định màu da, mắt và tóc của mỗi người, nằm ở đáy thượng bì.

 Melanin có tác dụng hữu ích trong việc bảo vệ da người chống lại tác hại của tia cực tím.

 Tuy nhiên, việc sản xuất quá nhiều melanin gây ra các vấn đề về

da liễu như tàn nhang, đốm đồi mồi, nám da cũng như ung thư

Cách hình thành sắc tố trên da

Melanocyte ở lớp hạ bì sản sinh melanin

Melanosome vận chuyển melanin

lên lớp biểu bì phía trên

Melanin được đẩy dần lên lớp thượng bì và hình thành sắc tố cho da

Enzyme tyrosine và cơ chế chống hình thành sắc tố

 Oxy hóa L-tyrosine thành L-DOPA (xúc tác bởi enzyme tyrosinase)

 L-DOPA oxy hóa thành DOPAQuinone

 DOPAQuinone phản ứng tự phát (tự động oxy hóa) tạo thành dopachrome có vai trò trong quá trình hình thành sắc tố

 Tạo ra hai loại melanin : eumelanin (nâu đen) và pheomelanin (vàng đỏ)

Hướng nghiên cứu

Tyrosinase là một đích phân tử quan trọng tham gia vào quá trình

hình thành các sắc tố melanin

Ức chế enzym tyrosinase có thể làm hạn chế việc sản sinh quá nhiều các sắc

tố melanin, từ đó giúp điều trị các rối loạn liên quan đến tăng sắc tố da

L-tyrosine Tyrosinas L-DOPA QuinoneDOPA Melanin

e

Tyrosinas e

O 2

Tổng quan

• Cây Secang tên khoa học là “Caesalpinia span L.” là một loại cây thân gai, lá nhỏ, ở ngọn có hoa màu vàng hoặc cam Phát triển mạnh ở Indonesia, Ấn Độ và Malaysia Các hợp chất được chiết xuất từ gỗ cây Secang đã được chứng minh

có nhiều hoạt tính dược lý như chống oxy hóa , chống tăng sinh và gây apoptosis trên một số tế bào ung thư

• Những hợp chất hoạt động này được phân loại thành homoisoflavonoid Flavonoid đã được đánh giá có thể vô hiệu hóa enzyme tyrosinase.

Quy trình chiết xuất

Lõi gỗ cây Caesalpinia được tán

thành bột và được chiết bằng

cách ngâm với Ethanol 70% Tỷ lệ

mẫu:dung môi = 1:10 (ngâm trong

48h) Sau đó chiết xuất được cô

đặc dưới áp suất thấp bằng dàn

cô quay Gọi tên chiết xuất này là

Secang ethanolic.

11

Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase

- Đồng nhất

- Ủ trong 25 phút ở nhiệt độ phòng

Đo độ hấp thu bằng máy đo quang phổ

UV-VIS

- Đồng nhất

- Ủ trong 25 phút ở nhiệt độ phòng

Đo độ hấp thu bằng máy đo quang phổ

UV-VIS

Độ hấp thụ của dopachrome ở

bước sóng cực đại

Đánh giá khả năng ức chế bằng

phương pháp trắc quang

15

Dopachrome là kết quả của quá trình oxy hóa L-DOPA bởi tyrosinase

→ Sự hiện diện của chất ức chế làm giảm sản xuất dopachrome

 Dung dịch control: có màu cam đậm/đỏ

 Dung dịch mẫu thử: có hoạt tính ức chế tyrosinase càng mạnh thì

càng giảm cường độ màu da cam

Tyrosinas

e

Xác định độ hiệu quả của chiết

xuất

Tính% ức chế tyrosinase bằng cách so sánh sự khác biệt về độ hấp thụ của dung dịch không có chất ức chế với độ hấp thụ của dung dịch

có chất ức chế

Trong đó:

 Abs non: độ hấp thụ của dung dịch không có chất ức chế

 Abs test: độ hấp thụ của dung dịch có chất ức chế

%inhibition =

Xét sự ức chế: Chất ức chế được thêm vào với nồng độ tăng dần

17

Xác định độ hiệu quả của chiết

xuất

Sử dụng máy đo quang phổ UV-VIS, đo tại bước sóng 480nm,dựng đồ thị, chạy chương trình tính toán IC50, thu được các kết quả:

Xác định độ hiệu quả của chiết

xuất

Xác định độ hiệu quả của chiết

xuất

→ Sàng lọc cho thấy có thể nghiên cứu hoạt tính từ chiết xuất cây

Caesalpinia và phát triển để làm giảm sắc tố da từ thiên nhiên

Thử nghiệm in vivo của

DeoxyArbutin trên động vật và trên người

Tổng quan về Deoxy Arbutin (dA)

yl)oxy)phenol

(S)-4-((tetrahydro-2H-pyran-2-O OH

O

Ủ 10 phút, 70°C

Ủ tiếp 22 phút sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng

Định lượng tyrosine đã phản ứng bằng HPLC

Kết quả

Hiệu quả ức chế tyrosine của dA, HQ (hydroquinone), Kojic acid, Arbutin

Bôi 1 lớp kem chứa 3% chất thử (dA, HQ, Kojic acid, Arbutin) mỗi ngày liên tục trong 9 tuần

Điều trị trong 6 tuần với liều lượng

0, 0.1, 0.3, 1.0 và 3.0% dA và được đánh giá trong 8 tuần tiếp theo sau khi ngừng sử dụng.

Đo màu da mỗi 7 ngày bằng máy đo sắc độ Minolta

Mức độ làm sáng da của các chất thử nghiệm so với nhóm control (vehicle)

 dA cho thấy không có dấu hiệu kích ứng da nhưng HQ lại có Các nốt đỏ xuất hiện trên da khi sử dụng HQ

Khả năng ức chế tyrosine ở các nồng độ dA khác nhau

 Sau 6 tuần điều trị, lượng 0.3%, 1% và 3% tốt hơn đáng kể so với control.

 Mức 0.3% được xem là mức tốt nhất để sử dụng lâu dài

 Mức 0.1% không có sự thay đổi so với nhóm control

dấu hiệu kích ứng cho da,

có tiềm năng phát triển

trong dược phẩm làm sáng

da

Thử nghiệm dị ứng lặp lại theo thời

gian (HRIPT)

Thử nghiệm dị ứng lặp lại theo thời gian: Human repeat insult patch test (HRIPT)

• Là thí nghiệm đánh giá dị ứng da trên cơ thể người

• Tất cả các sản phẩm đều phải thông qua thí nghiệm này

• Thí nghiệm được thực hiện thông qua các miếng dán.

Cách tiến hành

31

o 94 đối tượng nam nữ đã tham gia hoàn thành HRIPT Loại trừ tiêu chí sử dụng

thuốc ức chế miễn dịch, đang và thường xuyên sử dụng thuốc chống viêm thuốc chống viêm ngoài da, ung thư da, tiểu đường, hô hấp mãn tính, tiêm dị ứng liên tục, ban đỏ nhẹ, phụ nữ đang cho con bú hoặc đang mang thai.

Các miếng dán chứa 0.2g kem dưỡng ẩm với 3% dA được sử dụng trên cánh tay trong 24h Sau đó, đối tượng thử nghiệm được thay thế miếng dán khác, liên tục trong 3 tuần rồi đến 2 tuần ngưng sử dụng Tiếp tục sử dụng và ghi nhận sau 24h và 96h

 Kết quả đánh giá: Không có phản ứng da với bất kỳ hỗn hợp thử

nghiệm nào tại tia UVA được chiếu xạ ngoại trừ các vị trí bị ban đỏ rất nhẹ

Đánh giá 1đ

Thời gian: đầu tháng 11 đến đầu tháng 2

Thử nghiệm được tiến hành trên 50 người gồm:

Thử nghiệm lâm sàng trên người

 Thực hiện nghiên cứu mù đôi với

3% dA và giả dược Thí nghiệm xuyên suốt 12 tuần.

 L value được đo từ lúc bắt đầu thí nghiệm và sau 12 tuần thí nghiệm bằng máy đo sắc độ Minolta.

34 người da trắng (L value = 62.7)

16 người da màu (L value= 60.6)

Kết quả

Kết luận

Nghiên cứu chứng minh rằng:

• dA hiệu quả hơn so với arbutin, axit kojic và hydroquinone.

• An toàn, ổn định hơn.

• Ít gây độc tế bào, ít gây kích ứng da và hấp thu tốt hơn

• Có tiềm năng phát triển và liều lượng tư vấn là 0,1% -3% trong mỹ phẩm.

Tài liệu tham khảo

1 Laksmiani, N P L & Nugraha, I P W Depigmentation activity of secang (Caesalpinia sappan L.) Extract through tyrosinase, tyrosinase related protein-1 and dopachrome tautomerase inhibition Biomed Pharmacol J 12, 799–808 (2019).

2 Niu, Y et al Effective Compounds From Caesalpinia sappan L on the Tyrosinase In Vitro and In Vivo Nat Prod Commun 15, (2020).

3 Boissy, R E., Visscher, M & deLong, M A DeoxyArbutin: A novel reversible tyrosinase inhibitor with effective in vivo skin lightening potency Exp Dermatol 14, 601–608 (2005).

4 Chawla, S et al Mechanism of tyrosinase inhibition by deoxyArbutin and its second-generation derivatives Br J Dermatol 159, 1267–1274 (2008).

5 Pillaiyar, T., Manickam, M & Namasivayam, V Skin whitening agents: Medicinal chemistry

perspective of tyrosinase inhibitors J Enzyme Inhib Med Chem 32, 403–425 (2017).

6 Kim, Y J & Uyama, H Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: Structure,

inhibition mechanism and perspective for the future Cell Mol Life Sci 62, 1707–1723 (2005).

7 Chang, T S An updated review of tyrosinase inhibitors Int J Mol Sci 10, 2440–2475 (2009).

37