Khảo sát đột biến gen atp7b (các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 và 20) trong bệnh wilson bằng kỹ thuật giải trình tự sanger

Đồng là một khoáng chất vi lượng mà cơ thể chúng ta cần với số lượng nhỏ, cần thiết cho sự trao đổi chất của tế bào, các quá trình chuyển hóa.. Sau khi được hấp thụ tại ruột non nhờ meth

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Tên đề tài :

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN ATP7B (CÁC EXON 2,

8, 10, 12, 14, 16 VÀ 20) TRONG BỆNH WILSON BẰNG

KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SANGER.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

GVHD : PGS.TS.BS Hoàng Anh Vũ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Tên đề tài :

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN ATP7B (CÁC EXON 2,

8, 10, 12, 14, 16 VÀ 20) TRONG BỆNH WILSON BẰNG

KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SANGER.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC

GVHD : PGS.TS.BS Hoàng Anh Vũ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài thực tập tốt nghiệp, em đã

nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, cùng với sự góp ý, cảm thông của các quý

thầy cô, gia đình và bạn bè Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn chân thành nhất, em

xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

Thầy PGS.TS.BS Hoàng Anh Vũ, thầy Hồ Quốc Chương mặc dù trong điều kiện

tình hình dịch bệnh Covid-19 khá phức tạp nhưng thầy vẫn chấp nhận, tạo điều kiện cho

em có được chỗ thực tập tốt Bên cạnh đó thầy cũng đã tận tình truyền đạt, hướng dẫn,

kiên nhẫn, động viên và chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài thực tập tốt

nghiệp này

Các anh chị kỹ thuật viên, nghiên cứu viên, nhân viên trung tâm Y Sinh học phân tử

- Trường đại học Y Dược TP.HCM, đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong

quá trình thực hiện thực tập tốt nghiệp

Ban Giám hiệu nhà trường, quý Thầy Cô khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học

Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt

những năm học qua Bên cạnh đó quý Thầy Cô luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có

thể hoàn thành thực tập tốt nghiệp

Toàn thể các bạn bè của em, những người luôn sẵn sàng giúp đỡ em trong học tập,

trong quá trình thực hiện đề tài và đời sống

Cuối cùng, con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và những người thân trong

gia đình đã yêu thương, chăm sóc, động viên và làm chỗ dựa vững chắc giúp con đạt

được mục tiêu trong 4 năm đại học này

Với điều kiện thời gian thực tập còn hạn chế do tình hình dịch bệnh, cũng như kinh

nghiệm bản thân em còn hạn chế, em tin rằng báo cáo thực tập tốt nghiệp của em không

thể tránh khỏi những thiếu sót

Em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH WILSON 3

1.1.1 Sơ lược về bệnh Wilson 3

1.1.2 Sinh bệnh học của bệnh Wilson 3

1.1.3 Cơ chế phân tử bệnh Wilson 5

1.2 BỆNH HỌC PHÂN TỬ BỆNH WILSON 6

1.2.1 Vị trí của gen ATP7B 6

1.2.2 Cấu trúc của gen ATP7B 6

1.2.3 Chức năng của protein ATP7B 7

1.2.4 Đột biến gen ATP7B 8

1.3 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN ATP7B GÂY BỆNH WILSON 9

1.3.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 9

1.3.2 Phương pháp Sanger 11

1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) 13

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Hóa chất 14

2.2.1 Hóa chất tách chiết DNA bộ gen (gDNA) từ mẫu máu 14

2.2.2 Hóa chất PCR 14

2.2.3 Hóa chất dùng trong điện di trên gel agarose 14

2.2.4 Hóa chất dùng cho phản ứng tinh sạch sản phẩm PCR 14

2.2.5 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR giải trình tự 14

2.2.6 Hóa chất dùng cho quá trình kết tủa sản phẩm PCR 15

2.3 Trang thiết bị nghiên cứu 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu 15

2.4.1 Thu thập dữ liệu 15

2.4.2 Kỹ thuật tách chiết DNA từ mẫu máu 16

2.4.3 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận 16

2.4.4 Kỹ thuật PCR khuếch đại các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 và 20 của gen ATP7B 17

2.4.5 Điện di 18

2.4.6 Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm PCR 19

2.4.7 Kỹ thuật PCR giải trình tự (Cycle Sequencing) 19

2.4.8 Kết tủa sản phẩm PCR giải trình tự 20

2.4.9 Giải trình tự và phân tích kết quả 21

2.5 Thời gian thực hiện và địa điểm 21

2.6 Quy trình nghiên cứu 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Kết quả khai thác dữ liệu 23

3.2 Tách chiết DNA 23

4.1 Kết luận 30 4.2 Đề nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATOX1 : Antioxidant 1 Copper Chaperone

ATP : Adenosine triphosphate

ATP7B : P-type ATPase

Bp : Base pair

CBPs : Copper Binding Proteins

CCS1 : Chaperone đồng cho superoxide dismutase 1

MBDs : Metal Binding Domains

NCBI : National Center for Biotechnology Information

OD : Optical density

PCR : Polymerase Chain Reaction

SOD1 : Superoxide dismutase 1

NCBI : National Center for Biotechnology Information

ddATP : Dideoxyadenin triphosphat

ddCTP : Dideoxycitosin triphosphat

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 : Các trình tự mồi dùng để khuếch đại các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 và 20 của

gen ATP7B 17

Bảng 2.2 : Thành phần phản ứng PCR 18

Bảng 2.3 : Chu trình luân nhiệt PCR vùng khởi động gen ATP7B 18

Bảng 2.4 : Thành phần hóa chất cho phản ứng tính sạch sản phẩm PCR 19

Bảng 2.5 : Chu trình luân nhiệt trong quy trình tinh sạch sản phẩm PCR 19

Bảng 2.6 : Thành phần hóa chất PCR trong giải trình tự 20

Bảng 2.7 : Chu trình luân nhiệt PCR giải trình tự 20

Bảng 3.1 : Độ tinh sạch của DNA tổng số thu nhận được từ mẫu máu 23

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 : Con đường chuyển hóa đồng trong tế bào gan 5

Hình 1.2 : Vị trí của gen ATP7B 6

Hình 1.3 : Tổ chức cấu trúc của gen ATP7B 7

Hình 1.4 : Phân bố một số đột biến trên gen ATP7B 8

Hình 1.5 : Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR 11

Hình 1.6 : Quy trình của phương pháp Sanger 12

Hình 2.1 : Quy trình xác định đột biến gen ATP7B 22

Hình 3.1: Kết quả PCR của gen ATP7B của mẫu WD-65, WD-67 trên các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 và 20 24

Hình 3.2 : Kết quả giải trình tự trên exon 2 25

Hình 3.3 : Kết quả giải trình tự trên exon 8 25

Hình 3.4 : Kết quả giải trình tự trên exon 10 26

Hình 3.5 : Kết quả giải trình tự trên exon 12 26

Hình 3.6 : Kết quả giải trình tự trên exon 14 27

Hình 3.7 : Kết quả giải trình tự trên exon 16 27

Hình 3.8 : Kết quả giải trình tự trên exon 20 28

Hình 3.9 : Đột biến c.2333G>T (p.R778L) trên exon 8 của gen ATP7B 29

Hình 3.10 : Đột biến c.2549C>T (p.T850I) trên exon 10 của gen ATP7B 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Wilson là tình trạng bệnh đặc trưng bởi sự tích tụ đồng trong cơ thể, ảnh hưởng đến gan, não, cũng như các cơ quan khác Bệnh được tác giả Kinnear Wilson mô tả lần đầu tiền vào năm 1912 Bệnh Wilson là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường,

liên quan đến sự thay đổi chức năng của gen ATP7B [14] Vai trò của protein ATP7B là

điều hòa quá trình hấp thụ, chịu trách nhiệm phân bố và thải trừ đồng ra ngoài cơ thể

Do đó, khi đột biến gen xảy ra sẽ gây rối loạn quá trình chuyển hóa đồng đặc biệt là giảm bài tiết đồng qua đường mật Lượng đồng ứ lại trong cơ thể sẽ lắng đọng dần trong các cơ quan: gan, não (chủ yếu ở nhân xám), mắt, da, thận, xương và nhiều cơ quan khác, gây ra các triệu chứng khác nhau trên lâm sàng [22]

Bệnh Wilson được ghi nhận hầu hết ở các quốc gia và các chủng tộc trên thế giới với

tỷ lệ mắc dao động trong khoảng 1/100.000 đến 1/35.000 trẻ em được sinh ra Tỷ lệ người mang bệnh là 1/90 người, do đó bệnh Wilson trở thành rối loạn phổ biến nhất theo

di truyền học Mendel [29]

Đồng là một khoáng chất vi lượng mà cơ thể chúng ta cần với số lượng nhỏ, cần thiết cho sự trao đổi chất của tế bào, các quá trình chuyển hóa Ngoài ra đồng còn tham gia duy trì chức năng của nhiều enzyme như cytochrome c oxidase, ceruloplasmin, Cu/Zn-dependent superoxide dismutases, tyrosinase, dopamine-β-hydroxylase và peptidyl-α-monooxygenase Các enzyme này xúc tác cho quá trình phosphoryl hóa, vận chuyển sắt, chống oxy hóa, trung hòa các gốc tự do và tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh [25] Ở điều kiện sinh lý bình thường, lượng đồng được cơ thể hấp thụ từ 2-5 mg/ngày Sau khi được hấp thụ tại ruột non nhờ methallothionin, đồng được đưa vào huyết tương và gắn với albumin dưới dạng Cu2+ trước khi kết hợp với các protein hepatocuprein của gan để tổng hợp thành cerulopasmin hoặc đào thải qua mật Khoảng 95% đồng trong máu dưới dạng ceruloplasmin, có bản chất là alpha globulin Ceruloplasmin là một protein rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa đồng trong cơ thể Những người mắc bệnh Wilson, sự kết hợp đồng vào ceruloplasmin và sự bài tiết đồng qua mật bị suy giảm [6]

Gan là cơ quan chính của cân bằng nội mô trong cơ thể, liên quan đến việc loại bỏ đồng dư thừa Lượng đồng bị ứ lại trong cơ thể không đào thải ra ngoài được, nó là một chất oxy hóa kích thích hình thành các gốc tự do và quá trình peroxy hóa lipid Trong tế bào gan, vai trò vận chuyển đồng do ATPase vận chuyển là ATP7B Sự sai hỏng về mặt

di truyền của gen ATP7B dẫn đến rối loạn chức năng vận chuyển đồng, gây ra sự tích tụ

đồng trong gan, là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh Wilson với các triệu chứng như: xơ gan, rối loạn tiêu hóa, rối loạn nội tiết, ảnh hưởng thần kinh và nhiều triệu chứng khác [30]

Hiện nay, đã có hơn 600 đột biến trải dài trên toàn bộ gen ATP7B đã được công bố trên các cơ sở dữ liệu về đột biến bệnh gen ở người HGMD [20] Đột biến gen ATP7B

có nhiều dạng khác nhau và đặt trưng cho từng chủng tộc, vùng lãnh thổ Đột biến điển hình gây bệnh Wilson ở những bệnh nhân Châu Âu (Trung, Đông và Bắc Âu) là đột biến H1069Q trên exon 14 với tỷ lệ từ 30-70% [32] Ở Tây Ban Nha, đột biến sai nghĩa M645R ở exon 6 phổ biến với tỷ lệ là 55% [17] Tại Anh, nghiên cứu của Curtis và cộng

sự ghi nhận tỉ lệ đột biến trên các exon 8, 14 và 18 chiếm đến 60% [28] Ở khu vực Châu

Á, Hàn quốc có đột biến R778L trên exon 8 được tìm thấy với tỷ lệ 37,5% [34]; tại Trung Quốc, đột biến R778L ở exon 8 phổ biến với tỷ lệ là 31,9% và đột biến P992L ở

exon 13 với tỷ lệ 11,2% [24] Đột biến R778L trên exon 8 của gen ATP7B đã được công

bố là phổ biến nhất trong quần thể Châu Á Vùng thường xảy ra đột biến trên gen ATP7B

tại các nước ở khu vực Châu Á cũng được xác định bao gồm các exon 8, 12, 13, 14, 16

và 18; ở Trung Quốc bao gồm các exon 8, 12, 13 và 16 [10]

Việc phát hiện các đột biến trên gen ATP7B có ý nghĩa rất quan trọng trong việc hỗ

trợ chẩn đoán, tư vấn di truyền cho người bệnh Wilson Ở khu vực Châu Á, đột biến trên các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 và 20 có tần suất phổ biến, do đó tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Khảo sát đột biến gen ATP7B (các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 và 20) trong

bệnh Wilson bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger”

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:

Thực hiện quy trình khảo sát đột biến gen ATP7B (các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 và

20) bằng phương pháp Sanger

Xác định đột biến ghi nhận tại các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 và 20 trên gen ATP7B

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH WILSON.

1.1.1 Sơ lược về bệnh Wilson

Bệnh Wilson là tình trạng bệnh đặc trưng bởi sự tích tụ đồng trong cơ thể Nồng độ đồng trong nội bào tăng lên dẫn đến stress oxy hóa, hình thành gốc tự do và rối loạn chức năng ty thể Những tác động kết hợp này có thể dẫn đến chết tế bào trong mô gan,

mô não và nó cũng ảnh hưởng đến hệ thống các cơ quan khác Bệnh Wilson là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường dẫn đến suy giảm vận chuyển đồng trong gan và

bài tiết đồng trong mật và bệnh có liên quan đến sự thay đổi chức năng của gen ATP7B

trong gan [14]

Bệnh Wilson được phát hiện ở hầu hết các quốc gia và các chủng tộc trên thế giới với tỷ lệ mắc dao động trong khoảng 1/100.000 đến 1/35.000 trẻ sinh ra Tỷ lệ người mang gen dị hợp tử là khoảng 1/90 ở nhiều nhóm dân tộc khác [29]

Nghiên cứu của Coffey AJ và cộng sự năm 2013 đã xác định tỷ lệ di truyền của bệnh

Wilson là 1/7.026 Ở Vương quốc Anh bằng cách xác định trình tự gen ATP7B trên

1.000 bệnh nhân, cho thấy tỷ lệ đột biến gen ở Anh cao hơn nhiều so với tỷ lệ đột biến bệnh Wilson được báo cáo với tỷ lệ mắc là 1/30.000 [33] Ngoài ra, bệnh Wilson được cho là có tỷ lệ mắc cao hơn ở các nước châu Á Tỷ lệ mắc bệnh Wilson là khoảng 1/ 3.000 ở dân số Hàn Quốc [31] và ở Hồng Kông tỷ lệ mắc khoảng 1/5.400 [31] Ở Đông

Á tỷ lệ lưu hành của nó được ước tính là khoảng 1/1.500 đến 1/3.000 Tỷ lệ mắc bệnh Wilson ở nam và nữ đều có khả năng mắc bệnh như nhau Tuổi mắc bệnh trong khoảng

từ 4 đến 40 tuổi, và đột biến này cũng đã được phát hiện ở trẻ nhỏ 3 tuổi cũng như người lớn 70 tuổi [19]

1.1.2 Sinh bệnh học của bệnh Wilson

Đồng là một nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự trao đổi chất bình thường của tế bào Đóng vai trò vận chuyển các enzym khác nhau liên quan đến các quá trình tế bào

đa dạng như hô hấp ty thể (cytochrome C), sinh tổng hợp melanin (tyrosinase), chuyển hóa dopamine (DOPA-β-monooxygenase), cân bằng nội môi sắt (ceruloplasmin), bảo

vệ chống oxy hóa (superoxide dismutase), hình thành mô liên kết (lysyl oxidase), và peptide amid hóa Khi lượng đồng dư thừa sẽ gây độc cho tế bào, do đó nồng độ đồng trong tế bào được kiểm soát chặt chẽ [23]

Bình thường lượng đồng trong cơ thể ước tính có khoảng 100 mg Khoảng 75% đồng được hấp thụ từ ruột non và sau đó vận chuyển đến các tế bào gan Đồng được vận chuyển vào tế bào gan thông qua protein vận chuyển đồng CTR-1 (copper transporter 1) Sự hấp thụ đồng xảy ra nhiều nhất ở dạ dày và tá tràng, có hai cơ chế hấp thụ đồng Một cơ chế là thông qua protein trung gian, đồng kết hợp với protein phân tử trọng lượng thấp ở niêm mạc dạ dày là metallothionein Sau khi đồng đến tế bào gan,

50-nó được tích hợp vào các enzyme có chứa đồng và protein gắn đồng (CBPs: Copper Binding Proteins), bao gồm ceruloplasmin và ferroxidase huyết thanh Cơ chế thứ hai liên quan đến sự vận chuyển các phức hợp Cu - glutathione qua màng niêm mạc Trong

tế bào gan, glutathione (GSH) có ái lực cao với Cu, phức hợp Cu - GSH được hình thành giúp vận chuyển đồng trong nội bào trong cơ thể [6]

Cơ chế đầu tiên chuyển hoá đồng - metallothionein Metallothionein là một nhóm các protein nội bào giàu cysteine có khả năng liên kết các ion kim loại, bao gồm đồng, cadmium và kẽm, có vai trò quan trọng để bảo vệ các protein nội bào khỏi độc tính của đồng Đồng theo thức ăn đi vào cơ thể được hấp thu 40-60%, sau khi hấp thu sẽ được vận chuyển bởi albumin tới gan và được dự trữ ở dạng Cuproprotein Metallothionein

là một protein liên kết kim loại, trọng lượng phân tử thấp, giàu cystein Khi khả năng liên kết đồng của metallothionein đến giới hạn, đồng dư thừa cũng được lắng đọng trong các lysosome nơi tích tụ phức hợp đồng, có khả năng gây ra tổn thương gốc tự do

Đồng độc hại làm hỏng màng lysosome, tạo ra đồng dư thừa trong tế bào chất gây tổn

thương tế bào đồng thời giải phóng đồng ra hệ tuần hoàn [15]

Cơ chế thứ hai chuyển hoá đồng - albumin Trong tĩnh mạch, đồng được hấp thụ từ ruột và vận chuyển đến gan gắn với albumin dưới dạng Cu2+ Đồng được hấp thu vào tế bào hoặc được sử dụng trong quá trình tổng hợp các enzym có chứa đồng, chẳng hạn như cytochrome oxidase và superoxide dismutase Sau đó, đồng được thải ra ngoài qua nước tiểu [7]

Hình 1.1 : Con đường chuyển hóa đồng trong tế bào gan [3]

1.1.3 Cơ chế phân tử bệnh Wilson

Protein APT7B được tổng hợp trong mạng lưới nội chất, sau đó di chuyển đến bộ

máy Golgi trong tế bào gan Gen ATP7B được biểu hiện nhiều nhất ở gan, nhưng cũng

được tìm thấy ở thận, nhau thai, tuyến vú, não và phổi Ở bệnh nhân Wilson, sự bài tiết đồng qua mật bị giảm là cơ chế bệnh sinh căn bản của sự tích tụ đồng trong cơ thể Sự giảm thải đồng qua mật và giảm khả năng gắn kết đồng vào ceruloplasmin là hậu quả trực tiếp của sự biến đổi hoặc mất chức năng của ATP7B ATP7B là protein nội bào,

định vị chủ yếu ở trans-Golgi của tế bào gan, đóng vai trò quan trọng trong việc kết hợp đồng với ceruloplasmin và bài tiết đồng trong mật Vị trí này trong tế bào giúp cho

ATP7B thực hiện được đồng thời 2 chức năng: thải đồng ra ngoài gan vào mật, gắn kết đồng vào ceruloplasmin mới tổng hợp [12]

Trong điều kiện đồng ở mức thấp, ATP7B giữ lại trong mạng lưới trans-Golgi của tế bào gan Khi mức đồng tăng lên, ATP7B được phân phối đến một khoang nội bào, dạng

lỗ và tái chế trở lại mạng lưới trans-Golgi đến khi đồng bị loại bỏ [15] Sự đột biến của

gen ATP7B làm gián đoạn quá trình định vị và vận chuyển protein có thể có tác động

xấu đến chức năng tổng thể của ATP7B và góp phần vào sự tiến triển của bệnh Wilson [1]

1

BỆNH HỌC PHÂN TỬ BỆNH WILSON

1.2.1 Vị trí của gen ATP7B

Gen ATP7B nằm trên nhiễm sắc thể 13q14.3, mã hóa cho một loại adenosine

triphophatase vận chuyển đồng giả định gồm 21 exon và 20 intron, với tổng chiều dài là

80 kb [27]

Hình 1.2 : Vị trí của gen ATP7B

(https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ATP7B)

1.2.2 Cấu trúc của gen ATP7B

Gen ATP7B mã hóa protein ATPase loại P được bảo tồn cao, chịu trách nhiệm vận

chuyển đồng và các kim loại nặng khác qua màng tế bào bằng cách sử dụng năng lượng được lưu trữ trong các phân tử adenosine triphosphate (ATP) Khung đọc mở 4,3 kb mã hóa một protein 1.465 axit amin với các tính năng đặc trưng của ATPase loại P Vị trí

xuyên màng của gen ATP7B bao gồm một trình tự gồm sáu vùng liên kết đồng, mỗi

vùng chứa một CXXC (cysteine) Đồng được ATOX1 (Antioxidant 1 Copper Chaperone), một chaperone đồng trọng lượng phân tử thấp chuyển đến các mô típ CXXC, bắt đầu chuyển đồng qua màng Golgi [18]

Một số vùng chức năng của ATP7B: 6 vùng liên kết đồng, một vùng truyền tải vùng

A (gốc axit amin 837–864, chứa trình tự Thr-Gly-Glu (TGE)) tham gia vào sự chuyển năng lượng của quá trình thủy phân ATP để vận chuyển cation, kênh cation và có chức năng khử phosphoryl hóa Sự khử phosphoryl hóacủa axit aspartic được thực hiện nhờ phản ứng trung gian của enzyme phosphatase nội bào, trong đó vùng A đóng vai trò then

vùng xuyên màng M đặt hiệu cho protein vận chuyển kim loại nặng Vùng xuyên màng nằm trên 8 exon từ exon 6 đến exon 12, exon 19 và exon 20 [21]

Vị trí bám cho các nguyên tử đồng (MBDs – Metal Binding Domains) của các axit amin đầu N gồm 6 vị trí liên kết đồng, một MBDs sẽ gắn với một nguyên tử đồng Sự vận chuyển tích cực của đồng qua màng là một quá trình phức tạp bắt đầu với đồng liên

kết ATP7B ở vùng tận cùng N và vận chuyển đồng qua màng tế bào, sử dụng ATP làm

nguồn năng lượng Tiếp theo, đồng tự do liên kết nội bào với các mô típ GG trong MBDs, tiếp theo là vận chuyển đến các mô típ trình tự Cys-Pro-Cys (CPC) trong MBDs Cuối cùng, quá trình khử phosphoryl hóa acyl-phosphate ở vùng A thải ra đồng ra khỏi

tế bào màng [30]

Hình 1.3 : Tổ chức cấu trúc của gen ATP7B [29]

1.2.3 Chức năng của protein ATP7B

Trong tế bào gan, ATP7B thực hiện hai chức năng quan trọng trong mạng lưới Golgi hoặc trong túi tế bào chất Trong mạng lưới trans-Golgi, ATP7B hoạt hóa ceruloplasmin bằng cách đóng gói sáu phân tử đồng thành apoceruloplasmin, sau đó được tiết vào huyết tương Trong tế bào chất, ATP7B cô lập đồng dư thừa thành các túi

trans-và bài tiết nó qua quá trình ngoại bào qua màng đỉnh ống tủy trans-vào mật [30]

1.2.4 Đột biến gen ATP7B

Hiện nay, đã có hơn 600 đột biến trải dài trên toàn bộ gen ATP7B đã được công bố

trên các cơ sở dữ liệu Trong đó đột biến thay thế nucleotide chiếm khoảng 79,5% các dạng đột biến gây bệnh [30]

Vùng hotspot (điểm thường xảy ra đột biến) của gen ATP7B thay đổi theo khu vực

địa lý Phần lớn các đột biến gây bệnh nằm ở vùng M và N ở những bệnh nhân không

có triệu chứng hoặc những người có các triệu chứng về gan [26]

Ở người Mỹ đột biến phổ biến trên exon 14 và 18, người Iran đột biến phổ biến trên exon 2, 8, 13, 14 và 18 phổ biến ở người Ấn Độ; khoảng 2/3 số bệnh nhân mang đột biến gen ở Brazil trên exon từ 8 đến 15 [11]

Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai Hương và cộng sự (2018) cho thấy đột biến thường xảy ra trên exon 2 (40,7%), exon 16 (11,6%), exon 8 (9,3%), intron 14 (7%), exon 18 (5,9%) [8] Đỗ Thanh Hương và cộng sự vào năm 2012-2013 đã phát hiện được

10 dạng đột biến trên các exon 1, 2, 3, 10, 16 và 20 trong đó exon 10 chiếm tỉ lệ cao nhất với rất nhiều dạng đột biến khác nhau [2] Năm 2012, Lê Hoàng Phúc phát hiện 8/16 bệnh nhân mang đột biến trên các exon 8, 10, 12, 13, 15, 16 và 20 ở bệnh nhân Wilson tại bệnh viện Nhi Đồng 1, Thành Phố Hồ Chí Minh [4] Vùng thường xảy ra đột

biến trên gen ATP7B tại các nước ở khu vực Châu Á cũng được xác định bao gồm các

exon 8, 12, 13, 14, 16 và 18; ở Trung Quốc bao gồm các exon 8, 12, 13 và 16 [10] Các vùng hotspot nên được ưu tiên sàng lọc đột biến để chuẩn đoán bệnh Wilson được nhanh chóng, tiết kiệm chi phí [1]

1.3 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN

GEN ATP7B GÂY BỆNH WILSON

1.3.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp chuỗi nhờ polymerase) được phát minh bởi Karry B Mullis cùng các cộng sự năm 1985, và được

sử dụng rộng rãi, giúp ông đoạt giải Nobel hóa học 10/12/1993

 Nguyên tắc chung

Dựa vào hoạt tính của các enzyme DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotide DNA polymerase sẽ kéo dài mồi bằng các nucleotide để tạo thành mạch mới theo nguyên tác

bổ sung với mạch DNA đã có Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn

 Các thành phần của một phản ứng PCR điển hình

DNA bản mẫu (template): chứa trình tự DNA cần khuếch đại Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch, không chứa các chết ức chế phản ứng (SDS, heparin, các chất

ức chế từ mẫu như hemoglobin, sắc tố,…)

Mồi (primer): là những đoạn oligonucleotide mạch đơn có trình tự bắt cặp bổ sung chuyên biệt với trình tự DNA cần khuếch đại ở đầu 5’ và 3’ Các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược hiểu theo chiều “xuôi” và “ngược” với chiều phiên mã của gen Đây là thành phần quan trọng của PCR để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và đạt hiệu quả cao

Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động của Taq polymerase Không có quy định chung

cho việc sử dụng nồng độ Mg2+mà nồng độ tối ưu cần phải được xác định cho từng thử nghiệm, thường giao động trong khoảng 1-5 mM Hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh và sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu, quá thấp thì giảm hiệu quả nhân bản của enzyme

Bốn loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP): thành phần được sử dụng bốn loại nucleotide phải cân bằng, thường ở nồng độ 20 – 200 µM/mỗi loại nucleotide

Enzyme DNA polymerase: enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I, không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp Bước ngoặt của phương pháp PCR được tạo ra khi enzyme DNA polymerase được phát hiện và tách

chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng, Thermus quaticus Enzyme này không bị phá hủy

ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác được sử dụng trên thị trường có nhiều tính năng chuyên biệt và hoàn thiện hơn như tính chịu nhiệt cao, có hoạt tính sửa sai 3’ – 5’ exonuclease ( như Pfu DNA polymerase, VentTM DNA polymerase) nên có tính trung thực rất cao

Dung dịch đệm: dung dịch đệm cho phản ứng PCR thường là 10- 50 mM, pH dao động từ 6.8-7.8 Tạo môi trường hóa học thích hợp cho hoạt động tối ưu và ổn định DNA polymerase [5]

Bước 2: Là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40°C - 70°C Trong quá trình bắt cặp, mồi bắt cặp bố sung với trình tự đích Tính toán theo thực nghiệm, một mồi điển hình ở nồng

độ 0.2 𝜇𝑀 sẽ hoàn thành sự bắt cặp trong khoảng vài giây Tuỳ thuộc Tm của các mồi

sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút

Bước 3: Là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng lên 72°C

để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase, ) hoạt động tổng hợp tốt nhất Giúp DNA polymerase thực hiện quá trình tổng hợp mạch DNA mới theo nguyên tắc bổ sung với trình tự mạch đích Thời

mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi Số lượng chu kỳ trong PCR thường không vượt quá 40 Sau mỗi chu kỳ, số sợi DNA tăng gấp đôi Như vậy, saun chu kỳ số lượng sợi DNA là 2 Nhờ vậy, số lượng DNA sẽ có đủ để có thể tách ra khi điện di và phát hiện được sau khi nhuộm, có thể tách dòng hoặc giải trình tự gen [5]

Hình 1.5 : Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR [5]

1.3.2 Phương pháp Sanger

Phương pháp Sanger được đưa ra bởi Frederick Sanger và cộng sự năm 1977 Đây

là phương pháp được sử dụng để xác định trình tự của DNA

 Nguyên tắc chung

Phương pháp Sanger là tổng hợp các đoạn DNA từ mạch DNA khuôn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide, có các đầu tận cùng là dideoxynucleotide (ddNTP) để dừng phản ứng kéo dài mạch của DNA polymerase Và một phân tử triphosphate nhân tạo có cấu trúc tương tụ như phân tử deoxynucleotide (dNTP) nhưng ở carbon số 3 của đường deoxyribose không phải là nhóm hydroxyl (-OH) mà là –H Trong quá trình tổng