Vì vậy, các biện pháp hóa học đã trở thành biện pháp chủ yếu trong quy trình canh tác các loại rau ở Việt Nam.Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc hóa học vừa gây lãng phí trong sản xuất, làm t
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2021- 02/2022 tại phòng thí nghiệm Động vật học và phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp
HCM, cơ sở 3 Bình Dương số 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ
Dầu Một, tỉnh Bình Dương.
VẬT LIỆU
Thu thập nguồn rệp sáp từ các vườn chuối tại Dầu Tiếng, Bình Dương được chuyển về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương để nghiên cứu Việc xác định loại rệp sáp gây hại cho cây ăn quả dựa trên tài liệu của Cục Bảo vệ Thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
2.2.2 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm:
Nấm ký sinh côn trùng được phân lập từ mẫu côn trùng bị nhiễm trong tự nhiên, bao gồm mẫu tằm bị nấm ký sinh tấn công tại vườn dâu huyện Bảo Lâm, tỉnh Lâm Đồng.
Hình 2.1: Vị trí lấy mấu nấm kí sinh
Mẫu nấm kí sinh sinh côn trùng Beauveria basiana sau khi phân lập và làm thuần sẽ tiến hành giữ giống tại phòng thí nghiệm Động vật học
Sau đó các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Động vật học,
Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở, cơ sở 3 Bình Dương
THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG
- Mẫu nấm kí sinh côn trùng Beauveria basiana đã được phân lập
- Đối tượng thử nghiệm: rệp sáp (Planococcus citri)
- Hóa chất: cồn 70 độ, đường D-Glucose, Nacl, dung dịch TWEEN 80,…
- Các nguyên liệu để tạo chế phẩm: trấu, cám gạo bột đậu nành, bột ngô
- Môi trường: PDA, SDAY, SDAY1, dung dịch TWEEN 80
Các thiết bị và dụng cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm bao gồm tủ cấy vô trùng, đĩa petri, kính hiển vi huỳnh quang, ống nghiệm, que cấy, nồi hấp, tủ lạnh, tủ đông, cân điện tử, hộp nuôi rệp sáp và bình tam giác, đảm bảo quá trình nghiên cứu và phân tích diễn ra hiệu quả, chính xác và an toàn.
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu chính:
- Quá trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp như thống kê, so sánh, khảo sát, quan sát,
- Giữ nấm kí sinh côn trùng Beauveria basiana đã được định danh hình thái và SHPT chủng nấm Beauveria basiana
- Khảo sát các loại môi trường để chọn ra môi trường tối ưu nhất nuôi cấy chủng nấm Beauveria basiana kí sinh côn trùng
- Tiến hành thu mẫu rệp sáp tại các vườn cây ăn trái trong khu vực Tp Thủ
2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm:
- Môi trường: Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
- Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm Lactophenol Control blue (LPCB)
- Hóa chất: Nacl, đường Glucose, cồn 960, cồn 70 0 , Tween 80, pepton, cao nấm men
- Nguyên liệu: cám gạo, đậu tương, trấu, bột ngô, lúa, khoai tây
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
2.4.1 Nhân nuôi nguồn rệp sáp
Thu nhập mẫu như: rau, cà phê, cây ăn trái,…có dấu hiệu bị rệp sáp
Planococcus citri được đem về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương để tiến hành nhân nuôi bằng phương pháp thả rệp kí sinh trên trái bí đỏ vào các hộp nhựa có đục lỗ Rệp sẽ bám vào vỏ ngoài của trái bí đỏ, trải qua các vòng đời và bắt đầu sinh sản Trong quá trình nhân nuôi, cần chú ý theo dõi vệ sinh hộp đựng và giữ bí đỏ sạch sẽ để tránh nhiễm nấm mốc, đảm bảo rệp phát triển khỏe mạnh.
Quan sát sự phát triển của rệp sáp theo từng giai đoạn tuổi là bước quan trọng để hiểu rõ về sinh thái của loài này Việc chụp hình các giai đoạn của rệp giúp xác định đặc điểm hình thái và giúp phân loại chính xác Việc xác định loài rệp sáp gây hại cho cây ăn quả dựa trên tài liệu chính thức của Cục Bảo vệ Thực vật, đảm bảo độ chính xác cao trong công tác phòng trị.
Bảo vệ thực vật- Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn
2.4.2 Phương pháp định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa trên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử
2.4.2.1 Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria basiana
Quan sát nấm trên vật chủ
Cấu trúc sinh bào tử
Khuẩn lạc trên môi trường PDA
DNA của nấm kí sinh côn trùng được tách chiết theo hướng dẫn của bộ KIT:
GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit
Sử dụng các đoạn mồi như sau để khuếch đại vùng ITS1- ITS4:
( http://www.fungalbarcoding.org/DefaultInfo.aspx?Page=Primers)
Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích phản ứng là 25 µl, bao gồm các thành phần chủ chốt như 12 µl Master mix, 2 µl DNA mẫu, 1,2 µl mồi xúc tác, và 1,2 µl mồi ngược, đảm bảo quy trình chính xác để phát hiện và khuếch đại trình tự DNA mục tiêu.
8,6àl nước cất Cho vào mỏy PCR và chỉnh thời gian, nhiệt độ theo chu kỡ :
2.4.2.4 Điện di gel chứa sản phẩm PCR.
Sản phẩm DNA của nấm kí sinh côn trùng sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng
PCR sẽ tiếp tục được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1% Sau khi điện di trên gel agarose
Chạy điện di trên gel agarose bắt đầu bằng việc đặt khuôn gel vào bể điện di chứa buffer TAE 1X để ngập đầy các giếng Tiếp theo, load 6µl DNA đã được pha trộn với 1µl loading buffer vào mỗi giếng cùng với thang chuẩn để xác định kích thước DNA Thiết lập nguồn điện với điện áp 70V và chạy trong vòng 40 phút để phân tách DNA Sau khi chạy xong, tắt nguồn và lấy khuôn gel ra khỏi thiết bị điện di, rồi chụp hình gel để phân tích kết quả DNA đã được phân tách trên gel agarose.
Chụp hình gel đã chạy điện di
2.4.2.5 Giải trình tự DNA và xây dựng cây phát sinh loài:
Chúng tôi sử dụng chương trình BLAST và CLUSTAL để so sánh trình tự DNA của nấm với các đoạn DNA trong ngân hàng gen NCBI nhằm xác định loài nấm chính xác Quá trình này giúp phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài nấm, từ đó xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA X Phương pháp này là một bước quan trọng trong định danh vi nấm dựa trên trình tự DNA, đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy cao trong nghiên cứu hệ sinh thái nấm.
- Tiến hành giữ chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria spp và quan sát các đặc điểm hình thái của chủng nấm
- Phương pháp dựng cây bằng 3 phương pháp Maximum Parsimony,
Neighbor-Joining và Maximum Likelihood
Trộn 8g D-glucose + 100ml nước cất
Chia đều vào các bình serum nhỏ
Cấy nấm Beauveria basiana thuần chủng
Bảo quản ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng
Các bước giữ giống chủng nấm Beauveria spp
Nấm kí sinh côn trùng được cấy trên môi trường PDA, ủ ở nhiệt độ phòng Đọc kết quả
Quan sát khóm nấm từ 3- 15 ngày Tùy thuộc vào tốc độ phát triển của chủng
Quan sát lại các đặc điểm của nấm như: hình dáng, kích thước (đường kính, chiều
28 dày), dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm,…), màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới,…
Ghi nhận các đặc điểm của nấm kí sinh côn trùng như sau:
2.4.2.8 Quan sát trên kính hiển vi :
Để thực hiện, bạn cần một lam kính sạch, trong, đã được sấy khô, cùng với một khung giấy lọc hình vuông có kích thước 2cm x 2cm và độ dày cạnh 0.3cm Đặt khung giấy lọc vào giữa lam kính, sau đó bơm dung dịch mẫu PDA vào trong khung giấy lọc với mức khoảng 10ml để đảm bảo mẫu được hòa trộn đều trên lam kính.
Đầu tiên, cấy nấm vào giữa môi trường đã chuẩn bị, có thể cấy đơn bào tử hoặc cấy đầu sợi nấm Sau đó, đậy lamen lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ấm, sử dụng đĩa Petri chứa bông gòn ẩm, đặt thẳng chữ U bằng sắt lên trên Quá trình ủ diễn ra trong hai ngày, sau đó lấy lam kính ra, bỏ khung giấy lọc và tiến hành nhuộm mẫu bằng lactophenol để quan sát Quan sát vi thể gồm các đặc điểm như dạng bào tử, tơ nấm, cuống bào tử dưới kính hiển vi ×40 Cuối cùng, chụp hình ảnh khóm nấm trên đĩa Petri và các cấu trúc nấm dưới kính hiển vi để ghi nhận kết quả.
Cần chú ý thao tác vô trùng tránh nhiễm các vi sinh vật khác làm sai lệch kết quả
Buồng ẩm và nước cất bơm vào tạo môi trường ẩm đã được hấp khử trùng ở
2.4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chung nấm Beauveria basiana
2.4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấm Beauveria basiana
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, sử dụng chủng nấm phân lập khác nhau và môi trường dinh dưỡng đa dạng như SDAY, SDAY1, và PDA Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, đảm bảo tính khách quan và chính xác của kết quả, với mỗi lần lặp lại gồm bốn đĩa nấm.
- Điều kiện: nhiệt độ phòng, tối hoàn toàn
- Chuẩn bị chủng nấm Beauveria basiana thuần
- Cấy vào đĩa petri trên 3 môi trường (SDAY, SDAY1, PDA)
- Nuôi trong điều kiện tối, nhiệt độ phòng
- Theo dõi nấm phát triển sau 6,8,10,12 ngày
- Đo đường kính khuẩn lạc và ghi chép số liệu
Bảng 2 1:Bảng thành phần môi trường thạc
Thành phần Đơn vị tính Công thức môi trường
Phương pháp cho thí nghiệm trên:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên nhằm đảm bảo tính khách quan của kết quả Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần để tăng tính chính xác và độ tin cậy của dữ liệu Trong mỗi lần lặp, sử dụng bốn đĩa Petri chứa nấm Các đĩa Petri được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C (1 atm) trong thời gian 30 phút để đảm bảo vô trùng Sau khi hấp, đĩa được sấy khô và đổ môi trường PDA đã chuẩn bị sẵn, giúp đảm bảo môi trường nuôi cấy phù hợp cho quá trình sinh trưởng của nấm.
- Chỉ tiêu theo dõi sự phát triển của nấm Beauveria spp
Tốc độ phát triển trung bình của khuẩn lạc được đo bằng đơn vị mm/ngày, dựa trên chiều dài đường kính trên hai trục của khuẩn lạc sau các ngày nuôi cấy Phương pháp này giúp đánh giá sự phát triển của vi khuẩn theo công thức của Trịnh Xuân Thu và Lê, cung cấp dữ liệu chính xác để phân tích quá trình sinh trưởng của vi sinh vật trong phòng thí nghiệm.
Trong đó: d1 và d2 là độ dài 2 đường kính chéo phần khuẩn lạc phân bố trên đĩa petri
Mật độ bào tử/ml mẫu được tính ở thời điểm 6, 8, 10, 12 ngày sau khi nuôi cấy theo phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm Thoma:
Trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ ( V=1/4000 mm 3 )
4000= số qui đổi từ 1/4000 mm 3 thành 1mm 3
1000= số qui đổi từ 1mm 3 thành 1ml ( 1ml00mm 3 )
H= hệ số pha loãng ( ví dụ: H -2 )
Trường hợp 1: 1 khung có 16 ô lớn, 1 ô lớn có 25 ô nhỏ Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ
Trường hợp 2: 1 khung có 25 ô lớn, 1 ô lớn có 16 ô nhỏ Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ
Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm 2 Vậy V ô nhỏ = 0.1mm x 1/400 mm 2 =1/4000mm 3
2.4.4 Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Beauveria spp ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ phòng với nguồn dinh dưỡng tối ưu tại Điều 2.1, sử dụng ba nồng độ dịch bào tử nấm khác nhau, mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần để đảm bảo tính lặp lại và độ chính xác của kết quả Trong nghiên cứu này, đối chứng được thực hiện bằng cách phun nước để so sánh hiệu quả của các nồng độ dịch bào tử nấm Đối với rệp, mỗi nghiệm thức се́ có 20 con, nhằm đánh giá tác động của các nồng độ dịch bào tử nấm trên mật độ rệp và hiệu quả kiểm soát dịch hại.
- Nghiệm thức 1: NT1 - phun với nồng độ 10 7 bào tử/ml
- Nghiệm thức 2: NT2 - phun với nồng độ 10 8 bào tử/ml
- Nghiệm thức 3: NT3 - phun với nồng độ 10 9 bào tử/ml
- Tỷ lệ sống chết của rệp sáp qua các ngày Đánh giá hiệu quả tiêu diệt rệp sáp của chế phẩm theo công Abbot:
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG Beauveria spp DỰA TRÊN HÌNH THÁI VÀ BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
HÌNH THÁI VÀ BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm ký sinh côn trùng Beauveria spp.
Hình 3.1 Hình thái của nấm Beauveria spp
Theo Nguyễn Ngọc Tú - Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), “Nấm
Beauveria bassiana gồm các bào tử trần hình cầu (đường kính 1-4 μm) đến hình trứng (1,5-5,5 x 1,3 μm), giúp xác định đặc điểm nhận dạng của nấm Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3-5 μm, phát triển dày đặc trên môi trường nuôi cấy, chứa nhiều cuống sinh bào tử và bào tử, đồng thời mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng Khi mọc trên côn trùng, nấm thường có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề mặt trơn và phủ nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi, giúp phân biệt nấm Beauveria bassiana với các loại nấm khác.
Nấm Beauveria bassiana thường có màu trắng khi mọc trên môi trường thạch, với viền khuẩn lạc thường mang màu kem hoặc vàng nhạt Đôi khi, nấm còn xuất hiện màu đỏ nhạt, tạo đặc điểm nhận biết dễ dàng trong quá trình nghiên cứu (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Beauveria bassiana sản sinh ra nhiều bào tử có hình dạng đa dạng như cầu, trứng hoặc lưỡi liềm, kích thước dài tới 20 μm và rộng phù hợp Các sợi nấm mang các giỏ bào tử trần ngắn, phồng to, có kích thước khoảng 3-5 x 3-6 μm Các giỏ bào tử này có thể phát triển thành các nhánh ở đầu hoặc trực tiếp tạo thành tế bào sinh bào tử trần, góp phần vào quá trình phát triển và phân chia của loại nấm này.
Các tế bào sinh bào tử trần thường hình thành thành cụm, xuất phát từ giá hoặc nhánh của giá, hoặc trực tiếp từ sợi nấm khí sinh, nhánh ngang hoặc ngắn của sợi nấm Phần gốc của tế bào sinh bào tử trần có hình cầu hoặc hình chai có kích thước 2,5 – 3,5 x 3 – 6 micromet, trong khi phần ngọn của tế bào có dạng cuống hẹp và ngoằn ngoèo, hình chữ chi hoặc không đều, có răng cưa giúp phân biệt rõ với các loại tế bào khác.
20 àm Bào tử trần khụng cú vỏch ngăn, hỡnh cầu hoặc elip, đụi khi cú gốc nhọn, nhẵn 2 – 3 x 2 – 4 àm, màu trắng hay vàng nhạt (Nguyễn Ngọc Tỳ và
Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)
Hình 3.3 mô tả đặc điểm khuẩn lạc của chủng nấm Beauveria spp trên mặt trên (A) và mặt dưới (B) của đĩa Petri, giúp xác định hình thái và sự phân bố của nấm Đồng thời, Hình 3.2 thể hiện kích thước của bào tử, bao gồm chiều ngang và chiều dọc của khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy, cung cấp thông tin quan trọng về đặc điểm sinh học của nấm Beauveria spp trong quá trình nghiên cứu.
PDA sau 15 ngày nuôi cấy
3.1.2 Kết quả hỗ trợ đinh danh chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria spp bằng phương pháp sinh học phân tử:
Phản ứng PCR của chủng nấm ký sinh côn trùng Beauveria spp sử dụng cặp mồi chuyên biệt ITS1 và ITS4 cho kết quả định danh chính xác Hình 3.4 thể hiện kết quả điện di sản phẩm PCR, trong đó băng DNA của Beauveria spp có khối lượng phân tử khoảng 600bp, xác nhận sự hiện diện của nấm này trong mẫu nghiên cứu.
Hình 3.4: Phổ điện di DNA của chủng nấm ký sinh côn trùng Beauveria spp
Dựa trên kết quả phản ứng PCR và điện di trên gel agarose 1%, các sản phẩm PCR sẽ được tiến hành giải trình tự để xác định chính xác dòng nấm ký sinh côn trùng Bb-T4 Quá trình này nhằm nhận diện chính xác dòng nấm và đảm bảo độ chính xác trong chẩn đoán, góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh trên côn trùng.
Trình tự gen này sẽ được hiệu chỉnh để loại bỏ các biên độ không ổn định, đảm bảo tính chính xác trước khi so sánh với trình tự tương đồng trong ngân hàng gen Quá trình này giúp xác định các đoạn gen chính xác và phù hợp để phân tích di truyền Việc so sánh trình tự gen với cơ sở dữ liệu gen lớn đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả nghiên cứu Đây là bước quan trọng trong quá trình phát hiện và xác định các biến thể di truyền liên quan đến các bệnh lý hoặc đặc điểm sinh học.
Hình 3.5 Cây phả hệ phân tử vùng gen RPB1 xây dựng bằng phương pháp NJ
Hình 3.6 Cây phả hệ phân tử vùng gen RPPB1 xây dựng bằng phương pháp ML
Hình 3.7 Cây phả hệ phân tử ITS xây dựng bằng phương pháp MP (Maximum
Hình 3.8 Cây phả hệ phân tử xây dựng bằng phương pháp Phylogentic tree
TIẾN HÀNH GIỮ CHỦNG NẤM Beauveria Spp TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM
Nấm sau khi được cấy vào các bình serum sau khoảng thời gian khoảng
2 ngày, quan sát thấy nấm phát triển và phủ đều bề mặt giá thể lúa và có phát sinh bào tử
Hình 3.6 Chủng nấm Beauveria spp được giữ giống trong giá thể lúa
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Beauveria spp
3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấm Beauveria spp khi nuôi cấy ở ba môi trường khác nhau
Dưới đây là các điểm chính của bài viết nhằm đảm bảo tính mạch lạc và tối ưu hóa SEO: Bảng 2 thể hiện mật số bào tử (bt/ml) trên 3 loại môi trường thạch tại các thời điểm 6, 8, 10 và 12 ngày sau cấy (NSC) Kết quả cho thấy, đối với chủng nấm, các số mẫu tự có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê rõ rệt ở mức ý nghĩa p