Phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học từ bacillus sp rbd14 nội sinh cây dừa cạn (catharanthus roseus l ) có khả năng kháng staphylococcus aureus kháng methicillin (mrsa) atcc 43300

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được rằng chiết xuất từ vi sinh vật nội sinh cây dược liệu có hoạt tính sinh học có tiềm năng vượt trội, một trong số đó đã chứng minh được tác dụng kháng

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

GVHD: ThS Dương Nhật Linh

ThS Nguyễn Văn Minh

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: Y DƢỢC

được nhiều kinh nghiệm quý báu và giúp bản thân rèn luyện thêm nhiều kỹ

năng trong quá trình làm việc Đề tài của em ngày càng hoàn thiện hơn và

nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía, thầy cô, anh chị, các bạn và gia đình

Lời đầu tiên, em xin được trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô

Dương Nhật Linh, và thầy Nguyễn Văn Minh đã rất tận tình hướng dẫn, chỉ

bảo và luôn sẵn lòng giúp đỡ, động viên em từ lúc hình thành đề tài cho đến

khi hoàn thiện đề tài này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chị Trần Thị Á Ni và chị Nguyễn Thị

Thảo Nguyên và các bạn tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ và giúp

em giải quyết những khó khăn trong quá trình làm đề tài

Vì thời gian và kiến thức còn hạn chế nên không tránh khỏi những sai

sót, kính mong quý thầy, cô có thể hướng dẫn và đóng góp để đề tài của em

được hoàn thiện hơn

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người!

T

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1 Tổng quan về vi sinh vật nội sinh 4

1.1 Khái niệm 4

1.2 Vai trò của vi sinh vật nội sinh 4

1.3 Tình hình nghiên cứu từ vi sinh vật nội sinh cây dược liệu 4

1.4 Tình hình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật nội sinh cây dược liệu 5

2 Tổng quan về cây Dừa cạn (Catharanth us roseus L.) 6

2.1 Sơ lược về cây Dừa cạn (Catharanthus roseus L.) 6

2.2 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học từ cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) 7

2.3 Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh dừa cạn Catharanthus roseus (L.) 8

3 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus 10

3.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu về các hợp chất sinh học có trong Bacillus 11

4 Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) 12

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

1 Vật liệu 14

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

1.2 Đối tượng nghiên cứu 14

1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 14

2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.1 Hoạt hóa các chủng vi khuẩn chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 15

2.2 Thu dịch nội bào và ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 Error! Bookmark not defined.15 2.3 Xác định khả năng kháng khuẩn từ dịch ngoại bào và dịch nội bào chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 16

2.4 Khảo sát khả năng huyết giải của chủng vi khuẩn nội sinh cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) 16

2.5 Thu nhận cao chiết từ các chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 từ các hệ dung môi khác nhau 17

2.6 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch 18

2.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết bằng phương pháp pha loãng 18

T

iv

2.8 Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus

sp RBD14 19

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 21

3.2 Xác định khả năng kháng khuẩn từ dịch ngoại bào và dịch nội bào 22

3.3 Khảo sát khả năng huyết giải của chủng vi khuẩn nội sinh cây dừa cạn 23

3.4 Thu nhận cao chiết từ các chủng vi khuẩn từ các hệ dung môi khác nhau 24

3.5 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch 26 27

3.6 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết bằng phương pháp pha loãng 28

3.7 Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết 29

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30

1 Kết luận 31

2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

Tài liệu tiếng Việt 32

Tài liệu tiếng Anh 32

Nguồn Internet 39

PHỤ LỤC 40

T

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) 6

Hình 1.2: Vi thể của Bacillus được quan sát dưới kính hiển vi 10

Hình 3.1 : Đại thể của Bacillus sp RBD14 trên môi trường NA 21

Hình 3.2: Vi thể của Bacillus sp RBD14 được quan sát dưới kính hiển vi vật kính 100x 21

Hình 3.3: Kết quả kháng MRSA từ dịch ngoại bào của chủng Bacillus sp RBD14 22 Hình 3.4: Khả năng tiêu huyết của chủng Bacillus sp RBD14 23

Hình 3.5: Dịch nổi của chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 sau khi ly tâm 24

Hình 3.6: Thiết bị cô quay 25

Hình 3.7: Dịch chiết của chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 sau khi đun 26

Hình 3.8: Khả năng kháng MRSA của cao chiết của chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 từ các loại dung môi trên môi trường MHA 28

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 15

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ thu nhận cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 18

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1:Kết quả khảo sát vòng kháng khuẩn từ dịch ngoại hay nội bào của Bacillus sp RBD14 22

Bảng 3.2: Khối lượng cao chiết thu được từ 50 ml dịch chiết 25

Bảng 3.3: Số đo vòng kháng MRSA của cao chiết của chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 trên môi trường MHA 27

Bảng 3.4:Nồng độ ức chế tối thiểu của 2 loại cao chiết từ chủng Bacillus sp RBD14 kháng MRSA 29

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Số đo vòng kháng MRSA của cao chiết từ các loại dung môi 27

T

vi

DANH MỤC VIẾT TẮT

T

ĐẶT VẤN ĐỀ

Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) là nguyên nhân chính gây

ra các bệnh nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc sức khỏe và cộng đồng trên toàn

thế giới (Köck và cs., 2010) MRSA có khả năng gây tử vong bao gồm viêm phổi đe

dọa tính mạng, viêm cân nang chân hoại tử, viêm nội tâm mạc, viêm tủy xương,

nhiễm trùng huyết nặng và nhiễm độc tố như hội chứng sốc nhiễm độc (Moneck và

cs., 2011) Một vài nghiên cứu đã cho thấy các chủng MRSA gần đây đang có khả

năng kháng các loại kháng sinh mới như: Vacomycin (Okwu và cs., 2019),

daptomycin (Roch và cs., 2017), linezolizd (Caballero và cs., 2015) Vì sự phát triển

kháng thuốc là không thể tránh khỏi đối với tất cả các loại thuốc kháng sinh hiện có,

nên các liệu pháp mới liên tục được phát triển (Vestergaard và cs., 2019)

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được rằng chiết xuất từ vi sinh vật nội sinh

cây dược liệu có hoạt tính sinh học có tiềm năng vượt trội, một trong số đó đã

chứng minh được tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và chống virus (Makuwa và

cs., 2021) Một nghiên cứu gần đây nhất cho thấy chiết xuất từ Bacillus

amyloliquefaciens RD26 nội sinh cây diệp hạ châu đắng có khả năng kháng MRSA

với vòng ức chế là 25 ± 0.57 mm, trong đó, hợp chất BR04 (pyrimidine–2,4-d) được

tinh chế từ chiết xuất Bacillus amyloliquefaciens RD26 có khả năng kháng MRSA

cao nhất (Nguyễn Văn Minh và cs., 2021) Theo Koul và cộng sự (2013), hệ vi sinh

vật nội sinh của cây dừa cạn (Catharanthus roseus) có khả năng tạo các hợp chất có

hoạt tính sinh học như alkanoid, terpenoid, flavonoid, steroid là nguồn cung cấp các

chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị cho y học (Koul và cs., 2013) Năm 2015, Kumar

và cộng sự đã phân lập vi sinh vật nội sinh trên 3 loại dược liệu khác nhau: sầu đau

(Azadirachta indica), trâm bầu (Terminalia arjuna) và dừa cạn (Catharanthus

roseus), kết quả có 14 loại nấm và 7 loại vi khuẩn được phân lập Trong đó, chủng

vi khuẩn NRL2 có khả năng kháng lại S aureus Dịch chiết vi khuẩn NRL2 có hoạt

động kháng khuẩn hiệu quả, dịch chiết này tạo vùng ức chế 33 mm đối với S.aureus

(Kumar và cs., 2015)

Chính vì sự gia tăng và phát triển của Staphylococcus aureus kháng

T

2

methicillin nên việc tìm ra các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật nội sinh có khả năng

chống lại các tác nhân kháng kháng sinh là một điều cần thiết Kế thừa kết quả từ

những công trình nghiên cứu trước về khả năng kháng MRSA của hệ vi sinh vật nội

sinh cây dược liệu, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá sơ bộ khả năng

kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) ATCC 43300 từ cao

tổng chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh cây dừa cạn (Catharanthus

roseus L.)”

Mục tiêu nghiên cứu:

Đánh giá sơ bộ khả năng kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin

(MRSA) ATCC 43300 từ cao tổng chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh cây

dừa cạn (Catharanthus roseus L.)

Nội dung nghiên cứu

 Hoạt hóa chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh cây dừa cạn

(Catharanthus roseus L.)

 Khảo sát khả năng kháng Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA)

từ dịch nội bào và ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội

sinh cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.)

 Thu cao chiết từ dịch nội bào hoặc ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus sp

RBD14

 Xác dịnh sơ bộ khả năng kháng kháng Staphylococcus aureus kháng

Methicillin (MRSA) của cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14

 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

(MBC) của cao chiết chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14

T

PHẦN 1: TỔNG QUAN

T

4

1.1 Khái niệm

Vi sinh vật nội sinh là vi sinh vật (nấm, vi khuẩn và nấm men) sống trong mô

thực vật mà không gây ra bất kỳ điều gì đáng chú ý các triệu chứng của bệnh Vi

sinh vật nội sinh đã được tìm thấy trong tất cả các bộ phận thực vật, bao gồm xylem

và phloem (Kumar và cs., 2015) Một số vi sinh vật nội sinh thường được tìm thấy

là những loài thuộc các chi Enterobacter sp., Colletotrichum sp., Phomopsis sp.,

Phyllosticta sp., Cladosporium sp., V.v Quần thể nội sinh bị ảnh hưởng nhiều bởi

điều kiện khí hậu và vị trí nơi cây ký chủ phát triển Chúng tạo ra một loạt các hợp

chất hữu ích cho thực vật để tăng trưởng, bảo vệ các điều kiện môi trường và tính

bền vững, có lợi cho một nơi ở tốt trong vật chủ (Nair và cs., 2014)

1.2 Vai trò của vi sinh vật nội sinh

Các vi khuẩn nội sinh có khả năng tăng cung cấp chất dinh dưỡng, điều

chỉnh nồng độ hormone và sản xuất vitamin, do đó ảnh hưởng tích cực đến sự sinh

trưởng, phát triển và khả năng chống chịu stress của cây trồng (Santoyo và cs.,

2016) Các loại nấm nội sinh, vi khuẩn và xạ khuẩn đóng một vai trò quan trọng

trong việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học Các hợp chất hoạt tính sinh

học như alkaloid, steroid, terpenoit, peptit, polyketon, flavonoid, quinol và phenol,

và thuốc trừ sâu tự nhiên azadirachtin được sản xuất bởi vi khuẩn nội sinh (Li và

cs., 2008; Kusari và cs., 2012; Molina và cs., 2012) Vi sinh vật nội sinh cũng có thể

sản xuất vitamin hoặc chất điều hòa tăng trưởng trong thực vật, vì vi khuẩn có khả

năng tổng hợp auxin, cytokinin và gibberellin, và có thể phân cắt trực tiếp tiền chất

của etylen (Gustavo Santoyo và cs., 2016) Vi sinh vật nội sinh có thể làm tăng số

lượng rễ của cây tạo ra (Hua Wei Zhang và cs., 2006) và tăng cường sự phát triển

của thực vật có thể cạnh tranh với các tế bào bị nhiễm mầm bệnh (Sanjana Kaul và

cs., 2012)

1.3 Tình hình nghiên cứu từ vi sinh vật nội sinh cây dược liệu

Năm 2013, Idris và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ nấm nội

sinh phân lập từ cây thuốc Kigelia africana có khả năng kháng lại B subtilis, S

aureus, E coli Kuan và cộng sự (2019) đã cho thấy Saccharomyces cerevisiae sinh

T

flavonoid có khả năng kháng E coli ATCC 25922 và Staphylococcus aureus ATCC

29213

Theo Tang và cộng sự (2014) dựa vào kết quả phân tích GC/MS, chứng

minh sự hiện diện của các hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau trong Streptomyces

sp RS-9 và Streptomyces sp MS-26 Hai hợp chất được phân lập từ Streptomyces

sp MS-26 có hoạt tính chống MRSA mạnh đối với tất cả các chủng MRSA và

MRCoNS (Tang và cs., 2014)

Năm 2017, Pitri và sộng sự đã phân lập được tám dòng vi khuẩn có hoạt tính

kháng lại MRSA từ cỏ biển Enhalus acoroides, Thalassia hemprichii, và

Cymodocea rotundata ở các Bãi biển Litianak và Oeseli, Rote Ndao Đường kính

của vùng ức chế nằm trong khoảng 0,65-18,27 mm Tám loại vi khuẩn nội sinh tiềm

năng được xác định là Bacillaceae E2M1, Bacillaceae E2M3, Bacillus E2M4,

Bacillus E2M7, Bacillaceae E2M8, Pseudomonadaceae C1M7, Shewanellaceae

C2M3, và Rhodobacteraceae T1M3 (Pitri và cs., 2017)

Huỳnh Văn Trương và cộng sự (2018) đã khảo sát khả năng kháng khuẩn

của những dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá với Staphylococcus aureus bằng

phương pháp tẩm vi khuẩn nội sinh trên giấy lọc và định danh bằng phương pháp

giải trình tự gen 16S rRNA Kết quả cho thấy từ 60 dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp

cá được phân lập trên môi trường PDA có 14 dòng có khả năng kháng được vi

khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người với vòng vô khuẩn từ 10-40

mm

Theo Nguyễn Hồng Ái Vy và cộng sự (2019) đã khảo sát hoạt tính kháng

khuẩn của chủng Bacillus subtilis NBT15 và Bacillus megaterium S1 phân lập từ

cây chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) có khả năng kháng A hydrophila, E coli,

S aureus

1.4 Tình hình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật nội

sinh cây dược liệu

Theo Mishra và Kumar (2000) Catharanthus roseus có ý nghĩa quan trọng

trong y học hiện đại do có các alkaloid bisindole chống ung thư đặc hiệu ở chồi

Vinblastine và vincristin đều bao gồm các alkaloid đơn chất như terpenoid indole,

T

6

catharanthine và vindoline Catharanthine xuất hiện trong các cơ quan trên không

cũng như dưới đất của cây, sinh tổng hợp vindoline trong lá, mặt khác, serpentine

được tạo ra trong rễ cây được sử dụng làm thuốc hạ huyết áp (Mishra và Kumar,

2000)

Một số chất chuyển hóa thứ cấp là alkaloid, steroid, terpenoit, peptit,

polyketon, flavonoid, quinol và phenol Các hợp chất này cũng có vai trò quan trọng

trong các ứng dụng điều trị như chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống

viêm và ức chế miễn dịch (Korkina 2007)

Vi khuẩn nội sinh sản xuất alkaloid là chất chuyển hóa thứ cấp có tiềm năng

sinh học đa dạng như tác nhân chống nấm, chống ung thư và chống virus (Silva và

cs., 2007)

Các vi khuẩn nội sinh có một số tiềm năng trong ứng dụng vào dược phẩm

và thuốc (Strobel 2006; Guo và cs., 2008) Các vi khuẩn nội sinh cây dược liệu

đóng vai trò như một nguồn sản phẩm tự nhiên có tiềm năng ứng dụng trong việc

cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và các gốc tự do, cũng đóng vai trò như các

tác nhân hoạt tính sinh học mới (Nongkhlaw và Joshi., 2015)

2.1 Sơ lược về cây Dừa cạn (Catharanthus roseus L.)

H nh 1.1 Cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.)

T Giới: Plantae

Angiospermae Eudicots Asterids

Chi: Catharanthus

Loài: C roseus Catharanthus roseus (L.) G Don (họ Trúc đào) là một loài cây bụi trang trí

cao tới 30-100 cm Trước đây nó được gọi là Vinca rosea (L.) và thường được gọi

là cây dừa cạn Madagascar Mặc dù loài thực vật này có nguồn gốc từ Madagascar,

nó được phân bố rộng rãi trên khắp Thế giới do khả năng sống sót cao trong nhiều

loại môi trường sống và được sử dụng làm cây cảnh (Van Bergen và cs., 1996)

Loại cây này có lịch sử lâu đời như một loại thuốc dân gian ở nhiều nước (Tiong và

cs., 2013) như Nam Phi, Trung Quốc, Ấn Độ Mexico (Patel và cs., 2012) và

Malaysia (Ong và cs., 2011)

2.2 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học từ cây dừa cạn Catharanthus

roseus (L.)

Các ankaloid chủ yếu hiện diện trong các bộ phận trên không của cây bao

gồm actineo plastidemeric, vinblastine, vincristine, vindesine, vindeline và

tabersonine Trong khi đó, ajmalicine, vinceine, rượu nho, raubasin, reserpine và

cathatanthine thường được tìm thấy ở rễ và thân gốc trong khi sắc tố anthocyanin

như rosindin có trong phấn hoa của C roseus (Sain và cs., 2013)

Một trong những chiết xuất từ thực vật với rất nhiều chất kháng khuẩn có

chứa các hợp chất là Catharanthus roseus L hoặc thường được gọi là cây dừa cạn

Madagascar Loài thực vật thuộc họ Trúc đào này tạo ra một hỗn hợp phức tạp của

các chất chuyển hóa thứ cấp chứa 120 alkaloid, trong đó 70 được biết là có dược lý

mạnh các đặc tính như acid chlorogenic, acid oleanolic, acid loganic, vindolicine,

vindoline, vinblastine, vincristine, ajmalicine, và catharanthine (Barrales và cs.,

2019; Taher và cs., 2019)

T

8

Vinblastine và vincristine được phân lập từ cây dừa cạn Catharanthus roseus

(L.) là những chất chống ung thư có nguồn gốc từ thực vật đầu tiên được triển khai

sử dụng trong lâm sàng (Pham Hong Ngọc Thuy và cs.,2020)

2.3 Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh dừa cạn Catharanthus roseus

(L.)

 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 2015, Roy và cộng sự thực hiện nghiên cứu trên chủng Streptomyces

thermoviolaceus NT1 nội sinh cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.), kết quả cho

thấy S thermoviolaceus NT1 có khả năng đối kháng với một số mầm bệnh vi khuẩn

Gram dương và Gram âm cùng với Staphylococcus aureus kháng thuốc (Roy và cs.,

2015)

Năm 2015, Arun K G và cộng sự đã phân lập các chủng vi khuẩn và vi

nấm từ Terminalia arjuna (marutham), Catharanthus roseus (nithyakalyani) và

Azadirachta indica (vembu), trong đó chủng vi khuẩn NRL2 có hoạt tính kháng cao

đối với chủng S aureus và dịch chiết thô từ chủng vi khuẩn NRL2 cũng có khả

năng kháng MRSA (Arun và cs., 2015)

Theo Mukhopadhyay và cộng sự (2020) đã tiến hành phân lập các chủng vi

khuẩn và vi nấm nội sinh từ cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) Bằng phương

pháp khuếch tán giếng thạch, nhóm đã xác định dịch chiết của 5 trong tổng số 13

dòng phân lập được có hoạt tính kháng khuẩn chống lại 3 tác nhân gây bệnh: E

coli, Staphylococcus sp và Vibrio sp (Mukhopadhyay và cs., 2020)

Myo và cộng sự (2020) đã phân lập một chủng vi khuẩn nội sinh từ

Catharanthus roseus và hai chủng vi khuẩn từ Boscia variabilis Collett & Hemsl

(Capparaceae) Các chủng vi khuẩn này không chỉ có hoạt tính kháng vi khuẩn P

aeruginosa, S aureus, S typhi và B cereus mà còn có hoạt tính kháng nấm gây

bệnh ở thực vật (Myo và cs., 2020)

 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh cây dược liệu, và hợp

chất có hoạt tính sinh học của chúng còn rất ít Một số những nghiên cứu tiêu biểu

T như:

Trương Hoàng Nguyên và cộng sự (2020) đã nghiên cứu về độc tính tế bào

của Streptomyces sp SS1-1 – chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ cây dừa cạn

ở Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Kết quả cho thấy chủng này có tác dụng gây

độc tế bào trên dòng tế bào A549 ung thư phổi ở người

Tuy nhiên, trong những năm vừa qua, hoạt động nghiên cứu khả năng kháng

MRSA tập trung chủ yếu vào các đối tượng là vi nấm nội sinh và xạ khuẩn, những

nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong cây dược liệu bị hạn chế Nghiên cứu về vi

khuẩn nội sinh trong cây dừa cạn (Catharanthus roseus L) có khả năng kháng lại vi

khuẩn gây bệnh MRSA hầu như không có hoặc rất ít kể cả trong và ngoài nước

T

3.1 Tổng quan về h nh thái và lịch sử nghiên cứu của vi khuẩn Bacillus

H nh 1.2 Vi thể của Bacillus được quan sát dưới kính hiển vi

Phân loại khoa học

Bộ (ordo): Bacillales Chi (genus): Bacillus; Cohn 1872 Giới (regnum): Bacteria

Họ (familia): Bacillaceae Lớp (class): Bacilli Ngành (divisio): Firmicutes

Bacillus có dạng hình que, hình thành nội bào tử hiếu khí hoặc kỵ khí đa

dạng, vi khuẩn gram dương; ở một số loài nuôi cấy có thể chuyển sang Gram âm

theo tuổi Chỉ có một nội bào tử được hình thành trên mỗi tế bào Các bào tử có khả

năng chống nóng, lạnh, bức xạ, hút ẩm và chất khử trùng (Turnbul và cs., 1996)

Mickymaray và cộng sự (2018) đã có một phát hiện quan trọng đó là hợp

chất Bac-SM01 được sản xuất bởi B subtilis SM01 có khả năng ức chế các chủng

vi khuẩn Gram âm sản xuất ESBL như A baumannii, P aeruginosa, và E coli, và

chủng MRSA Gram dương Có thể kết luận rằng hợp chất Bac-SM01 có thể được

sử dụng như một tác nhân kháng khuẩn thay thế trong các sản phẩm dược phẩm để

kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc

Năm 2016, Jeyanthi và cộng sự đã chỉ ratrong số 324 chủng vi sinh vật phân

T lập từ đất mặn, chủng MHB1 cho thấy hoạt tính kháng MRSA mạnh với vùng ức

chế 14 ± 1 mm MHB1 được xác định là Bacillus amyloliquefaciens dựa trên các

đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân tích trình tự rRNA 16S

3.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu về các hợp chất sinh học có

trong Bacillus

Một số hợp chất chống MRSA đã được phân lập từ Bacillus sp bao gồm

Bogorol A, một kháng sinh nhóm peptit cation từ Bacillus laterosporus PNG276

(Basrby và cs.,2001) và Loloatins A, B, C và D từ Bacillus sp MK-PNG-276A

(Gerard và cs.,1999)

Năm 2013, Hianna Almeida Câmara Leite và cộng sự đã nghiên cứu chủng

Bacillus subtilis được phân lập từ cây cacao có khả năng sản sinh ra các hợp chất

giúp thúc trưởng cho cây trồng

Trong một nghiên cứu của Wang và cộng sự (2015), Chlorotetaine được tìm

thấy từ Bacillus amyloliquefaciens có khả năng ức chế được các chủng nấm

Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida krusei và Polymorphic candida

với giá trị MIC là 0,81 µg/ ml và 1,63 µg/ ml đối với nấm mốc Aspergillus niger

Một nghiên cứu gần đây nhất cho thấy chiết xuất từ Bacillus

amyloliquefaciens RD26 nội sinh cây diệp hạ châu đắng có khả năng kháng MRSA

với vòng ức chế là 25 ± 0.57 mm, trong đó, hợp chất BR04 (pyrimidine–2,4-d) được

tinh chế từ chiết xuất Bacillus amyloliquefaciens RD26 có khả năng kháng MRSA

cao nhất (Nguyễn Văn Minh và cs., 2021)

kết hợp lại với nhau thành tụ cầu Trên bề mặt môi trường thạch, khuẩn lạc S

aureus có màu vàng nên được gọi là tụ cầu vàng Tụ cầu vàng có khả năng gây ra

rất nhiều bệnh nguy hiểm khác nhau đe dọa nghiêm trọng tính mạng của con người

(Balaban và cs., 2000) Sự xuất hiện của các biến thể kháng thuốc của S aureus

hiện nay đang là một vấn đề được báo động đối với ngành y tế Việt Nam cũng như

một số nước khác trên thế giới, như Staphylococcus aureus kháng methicillin

(MRSA) (Hiramatsu và cs., 1997) và Staphylococcus aureus kháng vancomycin

(VRSA) (Bozdogan và cs., 2003)

Một vài nghiên cứu đã cho thấy các chủng MRSA gần đây đang có khả năng

kháng các loại kháng sinh mới như: Vacomycin (Okwu và cs., 2019), daptomycin

(Roch và cs., 2017), linezolizd (Caballero và cs., 2015) Vì sự phát triển kháng

thuốc là không thể tránh khỏi đối với tất cả các loại thuốc kháng sinh hiện có, nên

các liệu pháp mới liên tục được phát triển (Vestergaard và cs., 2019)

T

T

1 Vật liệu

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2020 đến tháng 03 năm 2021 tại

phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – cơ sở III, Trường Đại học Mở Tp Hồ chí

Minh

1.2 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 nội sinh dừa cạn (Catharanthus roseus L.)

trong bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh cây dược liệu được cung cấp bởi phòng thí

nghiệm Công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Thành phố

Hồ Chí Minh

Chủng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA)

ATCC 43300 được mua tại công ty TNHH Dịch vụ và thương mại Nam Khoa, Việt

Nam

1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường

 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: tủ lạnh, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy vortex, kính hiển vi

Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, becher, que cấy, đũa cấy, đèn cồn, …

 Hóa chất

Thuốc nhuộm, cồn 960, cồn 700, Ống Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1

- 1,5 x 108 CFU/mL, etyl axetat, methanol, chlorofrom, dichlomethane, hexan,…

 Môi trường:

Nước muối sinh lý 0,85%, NA, NB, MHA, MHB

2 Phương pháp nghiên cứu

Bố trí thí nghiệm

 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

T

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

 Phương pháp nghiên cứu chính

2.1 Hoạt hóa các chủng vi khuẩn chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14

- Chủng vi khuẩn thử nghiệm được hoạt hóa trong 20 mL môi trường NB, ủ ở

37±2 oC/ 24 giờ

- Nhân giống: 10 % thể tích dịch khuẩn sau khi hoạt hóa được bổ sung vào 100

mL môi trường NB chứa chủng vi khuẩn thử nghiệm (tỉ lệ 1/20), nuôi lắc 200

vòng/ phút ở 37±2 oC/ 36 giờ

- Lên men: bổ sung 10 % thể tích dịch khuẩn giống cấp 2 vào môi trường NB với

chủng vi khuẩn thử nghiệm trong 37±2 oC/ 36 giờ

Khảo sát kháng MRSA

bằng phương pháp khuếch

tán giếng thạch

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)

Hoạt hóa chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14

Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào và nội bào chủng vi

khuẩn Bacillus sp RBD14

Chiết dịch vi khuẩn Bacillus sp RBD14 với các hệ dung môi khác nhau

Thu cao chiết

Khảo sát khả năng tiêu huyết của chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14

T

2.2 Thu dịch nội bào và ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14

 Thu dịch ngoại bào

- Chủng vi khuẩn sau khi được lên men đem ly tâm 10.000 vòng/ phút ở nhiệt độ

4±2 oC/ 30 phút, thu dịch nổi, điều chỉnh pH 6,5 và lọc dịch nổi qua màng lọc

0,2 µm Tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA của dịch ngoại bào (Cao Thị

Thúy Hằng và cs., 2020)

 Thu dịch nội bào

- Thu sinh khối sau khi ly tâm ở 10.000 vòng/phút, ở 4±2 oC/ 30 phút

- Phần sinh khối tế bào được hòa với đệm 10 mM Tris HCl 0,02 M, pH 7,5 Phá

vỡ tế bào bằng sóng siêu âm với tần số 20 Hz trong 2 phút

- Dịch chiết thu sau khi ly tâm với tốc độ 9.000 vòng/phút, ở 4±2 °C/ 30 phút,

dịch nội bào được sử dụng để thử nghiệm khả năng kháng MRSA (Cao Thị

Thúy Hằng và cs., 2020)

2.3 Xác định khả năng kháng khuẩn từ dịch ngoại bào và dịch nội

bào chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14

- Sau khi đã có dịch ngoại bào và dịch nội bào, tiến hành xác định khả năng

kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Millette và cs., 2006)

- Pha dịch huyền phù vi khuẩn MRSA trong nước muối sinh lí NaCl 0.85 % đạt

mật độ 1 - 2 x 108

CFU/mL

- Tiến hành trải dịch trên mặt thạch MHA bằng tăm bông vô trùng cho đến khi

khô mặt thạch

- Đục lỗ (6 mm) bằng dụng cụ vô trùng trên thạch Bơm 100 µl dịch nội bào và

ngoại bào vào các vị trí đã được đục lỗ, ủ ở 37±2 oC/ 24 giờ Kiểm tra sự tạo

vòng vô khuẩn và đo đường kính vòng vô khuẩn

- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.4 Khảo sát khả năng huyết giải của chủng vi khuẩn nội sinh cây

dừa cạn Catharanthus roseus (L.)

 Mục tiêu

− Để xác định rằng đây là một chủng vi khuẩn có tiền năng trong việc sủng

dụng làm thuốc kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin thì phải không

T được có khả năng tan huyết Vì vậy, muốn khảo sát hoạt tính sinh học về khả năng

tan huyết của chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 ta phải tiến hành những bước như

 Đọc kết quả dựa trên sự tan huyết của môi trường trong vòng 24h

- Tiêu huyết α (tiêu huyết không hoàn toàn): hồng cầu bị ly giải không hoàn

toàn, tạo nên vùng tiêu huyết nhỏ, mờ, hơi màu xanh

- Tiêu huyết β (tiêu huyết hoàn toàn) : hồng cầu bị ly giải hoàn toàn, tạo nên

vòng tiêu huyết rộng, sáng và trong bao quang khóm vi khuẩn trên thạch

máu

- Tiêu huyết γ (không tiêu huyết): hồng cầu không bị ly giải nên không tạo ra

vòng tiêu huyết

2.5 Thu nhận cao chiết từ chủng vi khuẩn Bacillus sp RBD14 từ các

hệ dung môi khác nhau

- Dựa vào kết quả của mục 2.3, ta xác định được khả năng kháng từ dịch nội bào

hay ngoại bào, từ đó tiến hành thu cao chiết

- Sau thời gian lên men các chủng vi khuẩn, tiến hành ly tâm ở 4000 vòng/ phút

trong 30 phút để thu lấy dịch nổi

- Lấy 100 mL dịch khuẩn tiến hành chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi

khác nhau theo thứ tự: hexan, chloroform, dichlomethane, etyl axetat và

methanol tỉ lệ 1:1 Thu dung môi với các hoạt chất kháng khuẩn trong đó Việc

chiết được thực hiện nhiều lần

- Sau đó, tiến hành cô quay dịch chiết và dung môi ta sẽ thu được cao chiết thô

Nhiệt độ cô quay điều chỉnh theo nhiệt độ sôi của từng loại dung môi (Nguyễn

Kim Phi Phụng, 2007)