Sử dụng enzyme laccase tái tổ hợp để khử màu và khử độc thuốc nhuộm vải

PowerPoint Presentation Sử dụng enzyme laccase tái tổ hợp để khử màu và khử độc thuốc nhuộm vải GVHD T S Đỗ Biên Cương Tổng quan 1 Laccase Là 1 enzyme có tính OXH mạnh, phân hủy các hợp chất thơm đa v[.]

Sử dụng enzyme laccase tái tổ hợp

để khử màu và khử độc thuốc

nhuộm vải

GVHD: T.S Đỗ Biên Cương

Tổng quan

1 Laccase

- Là 1 enzyme có tính OXH mạnh, phân

hủy các hợp chất thơm đa vòng

- Nguồn thu: nấm mốc , thực vật, vi khuẩn,

côn trùng

- Liên quan đến quá trình phân hủy và

tổng hợp lignin

- Ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: tẩy trắng

bột giấy và tẩy màu thuốc nhuộm vải,chế

biến thực phẩm

2 Ngành thuốc nhuộm dệt vải

- Có hơn 1000 loại thuốc nhuộm tổng hợp

- Do sai số của hệ thống, 90% thuốc nhuộm còn lại các nhà máy nước thải và thải ra ngoài môi trường

- Sử dụng quy trình: xử lí ô nhiễm + thiếu khí

Þ Không hiệu quả: tạo hợp chất gây ung thư

Þ Laccase rất quan trọng trong ngành dệt Đặc biệt là các loại laccse từ nấm và vi

khuẩn

Sử dụng chủng vi khuẩn sinh laccase tái tổ hợp khử màu khử độc cho thuốc nhuộm(Streptomyces ipomoeae CECT 3341 )

Nội dung

1.Sản xuất enzyme laccase tái tổ hợp ( SilA)

- chủng : Streptomyces ipomoeae CECT 3341

- Môi trường nuôi cấy: LB bổ sung Kanamycin 50µg/ml

- Dùng Ecoli BL21 được biến nạp với plasmid pET28

- Ly tâm và phá vỡ tế bào thu dịch nổi

- Tinh sạch eyme bằng sắc kí cột HisTrap HP

+ Cột: đệm phosphat 20 mM+ NaCl 5M+ imidazole 10 mM

+ Mẫu được trộn với thể tích tương đương của pha động

+ Protein được rửa giải bằng dung dịch đệm có bổ sung imidazole 0,75 M

- Xác định hoạt tính của SilA: đo độ OXH 5 mM 2,2 -azino-bis (3-′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) trong đệm axetat 50 mM (pH 4,5) và 5 mM 2, 6-dimethoxyphenol (DMP) trong dung dịch đệm phosphat 100 mM (pH 8)

- Tính ổn định nhiệt động học: laccase

là enzyme ổn định nhiệt vừa phải với

Tm = 60± 6 oC

- Tính ổn định hóa học: Cấu trúc bậc ba

mở ra ở khoảng GdnHCl 2,2 M

- SilA có thể điều chỉnh nhiệt

- Và giá trị bán hủy ở 95 oC kéo dài 1,3 h

- Độ ổn định nhiệt: xác định bằng huỳnh quang

+ Kích thích: 280 nm và 296 nm

+ Phát xạ : 340 nm

- Độ ổn định hóa học: Kết hợp giữa tăng nồng

độ GdnHCl ( tạo protein)+ đo huỳnh quang

- Thực hiện:

+ ủ enzyme 95oC trong dung dịch đệm

phosphate 10mM, pH=7

+ Ở các thời gian cố định, các phần mẫu lấy ra

để hoạt động ở 25oC

+ Xác định hoạt tính bằng phương pháp

Bradford dung abumin làm mẫu chuẩn và ABTS

làm cơ chất

2 Thử nghiệm tính ổn định của Enzyme

3 Chuẩn độ OXH-K

- Điều kiện: 25oC, pH 7, kỵ khí

- Hỗn hợp gồm: E và chất trung gian

- Các chất trung gian:

- + dimethyl- p -phenylenediamine 10 µM

- + natri ferrocyanide

- + monocarboxylic acid ferrocene

- + 1,1 -đicacboxylic axit ferrocene′-azino-bis

(3 + Fe (II / III) tris(3 (1,10(3 phenantrolin)

- Chất OXH: Kali hexachloroiridat

- Chất khử :  natri dithionite 

- Dụng cụ đo: máy đo quang phổ

với độ quang phổ khả kiến

300-700nm

- Đo : 600 nm

Laccase của Vi khuẩn

có khả năng OXH-K thấp hơn so với laccase ở nấm

Khảo sát thấy điện thế khử màu tốt nhất là ở 337mV

4 Khử màu thuốc nhuộm

Sử dụng kết hợp với các sản phẩm chất trung gian để tăng khả năng OXH của E:

+ 3,5-dimethoxy-4-hydroxyacetophenone (acetosyringone, AS)

+ 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde (syringaldehyde, SA)

+ methyl 4-hydroxy-3,5 -dimethoxybenzoate (methyl syringate, MeS)

Cách thực hiện:

- Kết hợp : Laccase 0,4 U/ml + thuốc nhuộm 50 µM ủ trong photphat 50 mM

- Điều kiện: pH = 8 , T= 35oC, t= 24h

- Đo độ hấp thu bằng máy đo quang phổ Shimadzu UV- 160A

Kiểm tra các điều kiện khử màu của 2 loại thuốc nhuộm: Acid Orange 63 ( AO63) và tartrazine (TART)

- Sử dụng thêm chất trung gian : 0,1 và 0,5 mM

- Nhiệt độ 35oC và 60 oC

- Bước sóng: 418 và 425 nm

5 Đánh giá độc tính của thuốc nhuộm

- Phương thức thực hiện: Xét nghiệm

Pseudokirchneriella subcapitata, theo hướng

dẫn của OECD số 201

- Vật liệu: tảo inoula ( nuôi cấy ở t =24oC, chiếu sáng), mật độ 106 tế bào/ml

- Phương pháp:

+ Cấy các mẫu thuốc nhuộm đã được pha loãng vào huyền phù tảo

+ thực hiện trong 72h, V= 25ml

+ Kiểm tra sự phát triển của tảo : sử dụng các giá trị độ hấp thụ liên quan đến đường cong chuẩn do Microbiotests BE cung cấp

Kết quả tính khử màu và khử độc

Decolorization percentages of the dyes y the laccase SilA in the

presence or absence of the three mediators

Phân tích thống kê sự khử màu của tartrazine (TART)

và Axit Orange 63 (AO63) liên quan đến nhiệt độ (35

và 60 ° C), loại chất trung gian (acetosyringone, AS; syringaldehyde, SA; methyl syringate, MeS) và nồng

độ chất trung gian (0,1 và 0,5 mM)

Kết quả tính khử màu và khử độc

Toxicity of the degradation products of AO63 (A) and TART (B) before (grey bars) and after 24 h of SilA-mediator (0.1 mM acetosyringone, AS or methyl syringate, MeS)

system treatment at 35 °C (white bars) and 60 °C (striped bars)

Kết quả tính khử màu và khử độc

Kết luận

- Các loại thuốc nhuộm có pH trung tính và axit=> dùng laccase của vi khuẩn (

pH kiềm)

- Với mỗi loại thuốc nhuộm khác nhau thì khả năng khử màu và khử động

của SilA là khác nhau

- Cần kết hợp thêm các chất trung gian có mức oxy hóa khử cao và / hoặc các

hợp chất không phải phenolic

- Mức độ khử màu cao ở phạm vi pH trung tính đến kiềm và ở nhiệt độ cao

(60 ° C) là thuận lợi cho các xử lí nước thải có chứa thuốc nhuộm tránh gây

biến tính enzyme( ảnh hưởng đến tính thương mại của Ngành CNSH)

tính ổn định của nó với nhiệt độ cao, pH kiềm và tính kháng muối cao, khả năng tăng cường hoạt động oxy hóa của nó thông qua việc

sử dụng các chất trung gian tự nhiên, làm cho enzyme này trở thành ứng cử viên tốt cho quá trình xử lý sinh học các ứng dụng

Tài liệu tham khảo