Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng

f Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng GVHD T S Đỗ Biên Cương Giới thiệu chung về enzyme papain Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng Kết luận Giới thiệu chung[.]

Ứng dụng enzyme

papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng

GVHD: T.S Đỗ Biên Cương

Giới thiệu chung về enzyme papain

Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu

đậu phộng

Kết luận

Giới thiệu chung về enzyme papain

Nguồn gốc

• Papain (EC 3.4.22.3) thuộc họ enzyme

protease thủy phân protein

• Là cysteine protease ( sulfhydryl) được

biết đến nhiều nhất và được phân lập

lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái

đu đủ (Carica papaya)

• Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain

còn có các loại protease khác như

chymopapain, caricain, glycyl

endopeptidase và một số enzyme khác

Cấu tạo hóa học

Cầu đisulfur Phân tử SH tự do

• Là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S

không có chứa methionine.

• Phân tử lượng M= 23 350 Da

• Đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6

gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị

trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng

sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu

trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25.

C u trúc không gian ấu trúc không gian

• Mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt

bởi một khe, trung tâm hoạt động nằm ở khe này

• Phần xoắn anpha chiếm 20% toàn bộ enzyme

+ Phía trái: 3 xoắn anpha + Phía phải : 2 xoắn anpha

• Có hai nhân kị nước

• Dạng hình cầu với kích thước 36.48.36 A

• Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt

động là Cys25 và His159

• Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5

– 8.0) tùy thuộc vào cơ chất

• Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của

papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 570C.

Trung tâm ho t đ ng ạt động ộng

 G m có nhóm –SH c a cysteine 25 vàồm có nhóm –SH của cysteine 25 và ủa cysteine 25 và

nitrogen b c 3 c a histidine 159 Bên ậc 3 của histidine 159 Bên ủa cysteine 25 và

c nh đó nhóm imidazole c a His 159 ạt động ủa cysteine 25 và

cũng liên k t v i Asp 175 b i liên k t ết với Asp 175 bởi liên kết ới Asp 175 bởi liên kết ởi liên kết ết với Asp 175 bởi liên kết

hydrogen

 Vùng tâm ho t đ ng c a papainạt động ộng ủa cysteine 25 và

ch a m ch polypeptide v i cácứa mạch polypeptide với các ạt động ới Asp 175 bởi liên kết

amino acid là:

Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys

Phản ứng hóa học của papain

 Thủy phân protein => polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase

vừa như exopeptidase.

 Thể hiện hoạt tính xúc tác khi –SH ở trạng thái tự do => sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain

sang trạng thái hoạt động

 TTHĐ có tính khử => các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như: cysteine, glytation aicd, hdrocyanic

 Bất hoạt papain:

+ Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác => Chúng tác dụng với –SH ở TTHD => phá vỡ cấu trúc TTHĐ

+ Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp

+ Papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain

 Nhiệt độ: Chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khô papain

không bị biến tính trong 3 giờ ở 1000C Ở dạng dung dịch papain bị mất

hoạt tính sau 30 phút ở 82.50C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>1000C)

thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt

hóa vào dung dịch.

 pH: Hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng (4.5-8.5) nhưng dễ biến

tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm

mạnh có pH > 12 Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất

của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau

 Dung môi: : Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol

50% Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine

hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học

và hoạt tính của papain.

Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng

Bánh dầu đậu phộng là gì?

• Là một loại bánh được làm sau khi ép dầu đậu

phộng, chính xác thì nó là phần bã còn lại thừa ra

nhưng được làm thành từng miếng bánh tròn Sau

khi ép xong thì ở dưới các máy ép thủy lực pitton

hay ở dưới các dụng cụ ép dầu (hay còn gọi là các

bọng gỗ) sẽ gom các phần bã thừa ra để làm thành

các miếng bánh tròn

• Bên trong bánh dầu đậu phộng có chứa nhiều loại

chất khoáng khác nhau, khoảng 40% đạm hữu cơ

và nhiều loại vitamin có ích cho vật nuôi và cây

trồng.

• Tác dụng

+ Dùng làm phân bón hữu cơ để giúp cho cây trồng có

thể phát triển nhanh, đồng đều, an toàn và sạch, cho

năng suất thu hoạch cao.

+ Dùng làm thức ăn cho gia súc là chủ yếu, hoặc cũng

có thể làm thức ăn cho vật nuôi trong nhà như chó,

mèo, chim…

Quy trình

Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành.

 1 Thu nh n enzyme papain t nh a trái đu đậc 3 của histidine 159 Bên ừ nhựa trái đu đủ ựa trái đu đủ ủa cysteine 25 và

- Kh o sát các đi u ki n thu nh n enzyme papainảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ều kiện thu nhận enzyme papain ện thu nhận enzyme papain ậc 3 của histidine 159 Bên

- Đ nh lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế.ng và ho t tính c a enzyme papain sau m i giai đo n tinh ch ạt động ủa cysteine 25 và ỗi giai đoạn tinh chế ạt động ết với Asp 175 bởi liên kết

- Kh o sát s bi n đ i lảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ựa trái đu đủ ết với Asp 175 bởi liên kết ổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian ượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế.ng và ho t tính enzyme papain theo th i gian.ạt động ời gian

- Kh o sát các y u t nh hảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ết với Asp 175 bởi liên kết ố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain ảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ưởi liên kết ng đ n ho t tính enzyme papain.ết với Asp 175 bởi liên kết ạt động

 2 Kh o sát ph n ng th y phân bánh d u đ u ph ngảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ứa mạch polypeptide với các ủa cysteine 25 và ầu đậu phộng ậc 3 của histidine 159 Bên ộng

- Xác đ nh hàm lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế.ng đ m formol và đ m amoniac theo th i gian ph n ngạt động ạt động ời gian ảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ứa mạch polypeptide với các

- Kh o sát s thay đ i hàm lảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ựa trái đu đủ ổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian ượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế.ng xúc tác, pH và nhi t đ nh hện thu nhận enzyme papain ộng ảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ưởi liên kết ng đ n hi u ết với Asp 175 bởi liên kết ện thu nhận enzyme papain

su t ph n ng th y phân.ấu trúc không gian ảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ứa mạch polypeptide với các ủa cysteine 25 và

Phương pháp nghiên cứu

 Vật liệu thí nghiệm:

 Bánh dầu đậu phộng: Mua ở các cửa hàng thức ăn gia súc

 Mủ đu đủ: Thu nhận ở nhà vườn

 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với các nhân tố: pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất và thời gian thủy phân

• Khảo sát pH tối ưu từ 8-10

• Khảo sát nhiệt độ tối ưu

• Khảo sát tương tác giữa nhiệt độ và pH lên quá trình thủy phân

• Khảo sát tương tác giữa nồng độ cơ chất và thời gian lên quá trình thủy phân

• Khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung enzym vào các giai đoạn khác nhau lên hiệu suất thủy phân

Kết quả và thảo luận

1 Kết quả khảo sát pH tối ưu

=> Cơ chất bánh dầu đậu nành papain hoạt động mạnh trong khoảng pH 6-7, thể hiện hoạt tính thủy phân mạnh nhất ở pH 7,0, tương ứng với hàm lượng đạm amin và hiệu suất thủy phân nhận được là 11,60 mgN/g và 15,67 %N Hoạt tính của enzim thấp ở các pH 4, 5, 8, 9, 10

=> Có thể xem pH tối thích cho hoạt động của papain trên cơ chất bánh dầu đậu phộng là 7,0

2 Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu

Þ Đ b n nhi t c a enzyme papain khá r ng trong kho ng 45ºC - 65ºC, ộng ều kiện thu nhận enzyme papain ện thu nhận enzyme papain ủa cysteine 25 và ộng ảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain

hi u su t th y phân cao và khác bi t không ý nghĩa gi a các nhi t ện thu nhận enzyme papain ấu trúc không gian ủa cysteine 25 và ện thu nhận enzyme papain ữa các nhiệt ện thu nhận enzyme papain

đ này các nhi t đ th p 4ºC và 25ºC enzyme ho t đ ng y u h n ộng Ở các nhiệt độ thấp 4ºC và 25ºC enzyme hoạt động yếu hơn ện thu nhận enzyme papain ộng ấu trúc không gian ạt động ộng ết với Asp 175 bởi liên kết ơn

so v i 75ºC và 85ºC=> Papain là enzyme r t b n nhi t.ới Asp 175 bởi liên kết ởi liên kết ấu trúc không gian ều kiện thu nhận enzyme papain ện thu nhận enzyme papain

Þ Nhi t đ 55ºC là nhi t đ t i u cho ho t đ ng th y phân c a ện thu nhận enzyme papain ộng ện thu nhận enzyme papain ộng ố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain ư ạt động ộng ủa cysteine 25 và ủa cysteine 25 và

papain trên protein bánh d u đ u ph ng.ầu đậu phộng ậc 3 của histidine 159 Bên ộng

3 K t qu kh o sát s t ả khảo sát sự tương tác giữa pH và nhiệt độ lên hiệu suất thủy ả khảo sát sự tương tác giữa pH và nhiệt độ lên hiệu suất thủy ự tương tác giữa pH và nhiệt độ lên hiệu suất thủy ương tác giữa pH và nhiệt độ lên hiệu suất thủy ng tác gi a pH và nhi t đ lên hi u su t th y ữa pH và nhiệt độ lên hiệu suất thủy ệt độ lên hiệu suất thủy ộ lên hiệu suất thủy ệt độ lên hiệu suất thủy ất thủy ủy phân protein bánh d u đ u ph ng ầu đậu phộng ậu phộng ộ lên hiệu suất thủy

=> H s tện thu nhận enzyme papain ố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain ươn ng quan = 99,0365%

Þ Có th kh ng đ nh các đi u ki n pH 7,0 và nhi t đ 55ºC là đi u ki n ẳng định các điều kiện pH 7,0 và nhiệt độ 55ºC là điều kiện ều kiện thu nhận enzyme papain ện thu nhận enzyme papain ện thu nhận enzyme papain ộng ều kiện thu nhận enzyme papain ện thu nhận enzyme papain

t i u cho ho t đ ng th y phân c a enzyme papain lên protein trong ố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain ư ạt động ộng ủa cysteine 25 và ủa cysteine 25 và

bánh d u đ u ph ngầu đậu phộng ậc 3 của histidine 159 Bên ộng

4 Kết quả khảo sát tương tác giữa cơ chất và thời gian lên quá trình thủy phân

5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung enzym vào các giai đoạn khác nhau lên hiệu suất thủy phân.

Þ Không có s khác bi t gi a vi c cho enzyme vào cùng m t lúc hay b sung ựa trái đu đủ ện thu nhận enzyme papain ữa các nhiệt ện thu nhận enzyme papain ộng ổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian

enzyme vào t ng th i đi m khác nhau trong quá trình th y phân.ừ nhựa trái đu đủ ời gian ủa cysteine 25 và

Þ Hi u su t th y phân tính theo ph n trăm thu h i v t ch t khô sau 6 gam không ện thu nhận enzyme papain ấu trúc không gian ủa cysteine 25 và ầu đậu phộng ồm có nhóm –SH của cysteine 25 và ậc 3 của histidine 159 Bên ấu trúc không gian tăng n a cho th y ph n ng th y phân đã k t thúc, tuy nhiên hàm lữa các nhiệt ấu trúc không gian ảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain ứa mạch polypeptide với các ủa cysteine 25 và ết với Asp 175 bởi liên kết ượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế.ng đ m ạt động amin v n còn tăng tuy không cao do các peptid hòa tan v n đượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế.c ti p t c th y ết với Asp 175 bởi liên kết ục thủy ủa cysteine 25 và phân thành các acid amin n u kéo dài th i gian, nh ng t ng ph n trăm ch t khô ết với Asp 175 bởi liên kết ời gian ư ổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian ầu đậu phộng ấu trúc không gian hòa tan nhìn chung là không đ i ổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian

Kết luận

 Papain hoạt động mạnh trên cơ chất bánh dầu phộng ở điều kiện tối ưu là nhiệt độ 55oC và pH 7,0.

 Sản phẩm thủy phân nhận được ngoài các axit amin còn có các polypeptit có trọng lượng phân tử từ 14,4-25,0 kDa Để thủy phân triệt để hơn các polypeptit còn lại cần khảo sát thêm các điều kiện như xử lý mẫu trong điều kiện acid hay kiềm hay bổ sung các enzim exoproteaz

Tài li u tham kh o ện thu nhận enzyme papain ảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain

“Nghiên cứu sử dụng enzyme papain thô từ nhựa đu đủ để thủy phân protein trong bánh dầu đậu nành”, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, Số 5, Trang 115 – 122.

Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục, Hà Nội, Trang 9 – 28.

(2008), “Enzymatic hydrolysis of rawhide using papain and neutrase”, Journal

of Industrial and Engineering Chemistry, 14, pp 202 – 206.