i ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Huế[.]
Trang 1i
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
ĐOÀN MẠNH DŨNG
NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Huế - Năm 2020
Trang 2ii
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
ĐOÀN MẠNH DŨNG
NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 9 44 01 18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1 PGS.TS Nguyễn Đình Luyện
2 PGS TS Nguyễn Hữu Tùng
Huế - Năm 2020
Trang 3i
LỜI CAM ĐOAN
Luận án này được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học,
Đại học Huế, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn
Đình Luyện và PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng Tôi xin cam
đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các kết quả trong luận án là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trước đó
Tác giả
Đoàn Mạnh Dũng
Trang 4ii
LỜI CẢM ƠN
Luận án được hoàn thành dưới sự hướng dẫn hết sức tận tình và đầy tâm
huyết của Thầy Nguyễn Đình Luyện và Thầy Nguyễn Hữu Tùng
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS TS Nguyễn Đình
Luyện - Trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế, PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng -
Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu
Đặc biệt tôi xin tỏ lòng kính trọng nhất với GS TS Trần Đình Thắng – Trường Đại học Vinh, người Thầy đã dìu dắt, hỗ trợ mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
trên con đường nghiên cứu khoa học
Nhân dịp này, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, Phòng Sau đại học, Khoa Hóa học cùng quý thầy cô giáo giảng dạy lớp nghiên cứu sinh đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này
Tác giả xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp gần xa đã giúp đỡ, động viên, khích lệ tác giả trong suốt quá trình làm luận án
Cuối cùng, tác giả xin dành tình cảm đặc biệt đến gia đình, người thân và các người bạn của tác giả, những người đã luôn mong mỏi, động viên và tiếp sức cho tác giả để hoàn thành bản luận án này
Tác giả
Đoàn Mạnh Dũng
Trang 5iii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III
KÝ HIỆU VIẾT TẮT V DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VII DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ IX
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 TỔNG QUAN 4
1.1 Giới thiệu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học và một số cây thuốc 4
1.1.1 Giới thiệu chung 4
1.1.2 Các nghiên cứu về tách chiết một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 5
1.1.3 Một số loài cây thuốc chứa các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 6
1.2 Các phương pháp phân tích các hợp chất thiên nhiên 11
1.2.1 Phương pháp sắc ký khí 11
1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng 12
1.3 Một số nghiên cứu liên quan đến luận án 16
Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 22
2.2 Nội dung nghiên cứu 23
2.3 Phương pháp nghiên cứu 25
2.3.1 Thông tin về mẫu 25
2.3.2 Phương pháp chiết tách/phân lập 27
2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc và đặc trưng hóa - lý của HCTN 29
2.3.4 Phương pháp tinh chế hctn để tạo ra chất chuẩn 29
2.3.5 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn và dữ liệu chất chuẩn 30
2.3.6 Phương pháp phân tích các HCTN 30
2.3.7 Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 32
Trang 6iv
2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 34
2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 24
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
3.1 Chiết tách và xác định cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên 35
3.1.1 Chiết tách các HCTN từ cây Diệp hạ châu và đặc trưng cấu trúc 35
3.1.2 Chiết tách các HCTN từ cây Đan sâm và đặc trưng cấu trúc 42
3.1.3 Chiết tách các HCTN từ cây Mật nhân và đặc trưng cấu trúc 49
3.2 Tinh chế hợp chất thiên nhiên để tạo ra chất chuẩn 53
3.2.1 Chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin 54
3.2.2 Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA 55
3.2.3 Chất chuẩn eurycomanone 57
3.3 Quy trình phân tích hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 58
3.4.1 Tính ổn định của hệ thống thiết bị 65
3.4.2 Độ đặc hiệu của phương pháp phân tích 69
3.4.3 Khoảng tuyến tính 72
3.5 Áp dụng thực tế 79
3.5.1 Kiểm soát chất lượng của phương pháp phân tích 79
3.5.2 Hàm lượng các hctn trong các mẫu thực tế 86
3.6 Các hợp chất acetogenin chiết tách từ lá cây Mãng cầu xiêm 92
3.6.1 Xác định phân đoạn giàu hoạt chất acetogenin 94
3.6.2 Định tính các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3 95
3.6.3 Định lượng các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3 97
3.7 Hàm lượng tinh dầu chiết tách từ cây Riềng đuôi nhọn 98
KẾT LUẬN 105
TÀI LIỆU THAM KHẢO 109
Danh mục các công trình công bố kết quả nghiên cứu của luận án 107
PHỤ LỤC 122
Trang 7v
KÝ HIỆU VIẾT TẮT
ACRS Chất chuẩn đối chiếu hóa
học của ASEAN
Asean Chemical Reference Substance AOAC Hiệp hội các nhà khoa
học Phân tích Hoa Kỳ
Association of Official Analytical Chemists ASEAN Hiệp hội các nước Đông
Nam Á
Association of Southeast Asian Nations
CCĐC Chất chuẩn đối chiếu
CE Điện di mao quản Capillary Electrophoresis DAD Detector chuỗi diot Diot Array Detector ESI-MS Khối phổ - ion hóa phun
mù electron
Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry
FLD Detector huỳnh quang Fluorescence Detector
GC-MS Sắc ký lỏng ghép nối
khối phổ
Gas Chromatography – Mass Spectrometry
HCTN Hợp chất thiên nhiên HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid
Chromatography HPLC-MS Sắc kí lỏng - khối phổ High Performance Liquid
Chromatography– Mass Spectrometry
HTSH Hoạt tính sinh học Bioactive HCTN Hợp chất thiên nhiên Natural compounds
Trang 8vi
LC-MS/MS Sắc ký lỏng ghép 2 lần
khối phổ
Liquid Chromatograph
Spectrometer LOD Giới hạn phát hiện Limit of detection LOQ Giới hạn định lượng Limit of quantity
NMR Cộng hưởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic
Resonance NPLC Sắc ký lỏng pha thuận Normal Phase Liquid
Chromatography PPPT Phương pháp phân tích Analysis method PTN Phòng thí nghiệm Laboratory RPLC Sắc ký lỏng pha đảo Reversed Phase Liquid
Chromatography RSD Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard
Deviation SKĐ Sắc kí đồ
SPE Chiết pha rắn Solid Phase Extraction TCCL Tiêu chuẩn chất lượng
Chromatography UV-Vis Tử ngoại – khả kiến Ultraviolet – Visible VQG Vườn quốc gia
Trang 9vii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu 17
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của PU-1 và so sánh với công bố ở tài liệu 39
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của PU-2 và so sánh với công bố ở tài liệu 41
Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của SM-1 và so sánh với công bố ở tài liệu 46
Bảng 3 4 Dữ liệu phổ NMR của SM-2 và so sánh với công bố ở tài liệu 47
Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR của SM-3 và so sánh với công bố ở tài liệu 48
Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR của EL-1 và so sánh với công bố ở tài liệu 52
Bảng 3.7 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin 54
Bảng 3.8 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn tanshinone I, cryptotashinone và tanshinone IIA 56
Bảng 3.9 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn eurycomanone 57
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin 67
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA 68
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích Eurycomanone 69
Bảng 3.13 Kiểm tra độ lặp lại của phương pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, và phân tích Eurycomanone 80 Bảng 3.14 Kết quả đánh giá độ lặp lại của các PP LC-MS/MS và UPLC-DAD 81
Bảng 3.15 Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp LC-MS/MS đối với hypophyllanthin và phyllanthin 83
Bảng 3.16 Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp LC-MS/MS đối với tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA 84
Bảng 3.17 Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất hypophyllanthin, phyllanthin và eurycomanone 86
Bảng 3.18 Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA 86
Trang 10viii
Bảng 3.19 Hàm lượng (mg/g) hypophyllanthin và phyllanthin trong các mẫu thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu 88 Bảng 3.20 Hàm lượng (mg/g) tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone trong các mẫu cây Đan sâm 90 Bảng 3.21 Hàm lượng (mg/g) eurycomanone trong cây Mật nhân ở các địa phương khác nhau 91 Bảng 3.22 Phương trình đường thêm chuẩn và LOD, LOQ của phương pháp phân tích 98 Bảng 3.23 Hàm lượng (%) các cấu tử và các nhóm hợp chất có mặt trong tinh dầu chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn 102
Trang 11ix
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 3.1 Công thức cấu tạo của hypophyllanthin 38
Hình 3.2 Công thức cấu tạo của phyllanthin 40
Hình 3.3 Công thức cấu tạo của cryptotanshinone 45
Hình 3.4 Công thức cấu tạo của tanshinon IIA 47
Hình 3.5 Công thức cấu tạo của Tanshinon I 48
Hình 3.6 Công thức cấu tạo của Eurycomanone 52
Hình 3.7 Sắc đồ xác định độ tinh khiết của hypophyllanthin: 55
Hình 3.8 Sắc đồ xác định độ tinh khiết của phyllanthin: 55
Hình 3.9 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone I: 56
Hình 3.10 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của cryptotanshinone: 56
Hình 3.11 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone IIA 57
Hình 3.12 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất eurycomanone: 58
Hình 3.13 Phổ ESI-MS của hợp chất hypophyllanthin 59
Hình 3.14 Phổ ESI-MS của hợp chất phyllanthin 59
Hình 3.15 Quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin bằng phương pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD 60
Hình 3.16 Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone I 62
Hình 3.17 Phổ ESI-MS của hợp chất cryptotanshinone 62
Hình 3.18 Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone IIA 62
Hình 3.19 Quy trình phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA bằng phương pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD 63
Hình 3.20 Quy trình phân tích eurycomanone bằng phương pháp LC-MS/MS 64
Hình 3.21 Phổ ESI-MS của hợp chất eurycomanone 65
Hình 3.22 Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) hypophyllanthin, ứng với các nồng độ khác nhau (b) phyllanthin, ứng với các nồng độ khác nhau và (c) hypophyllanthin và phyllanthin 70
Hình 3.23 Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) tanshinone I, ứng với các nồng độ khác nhau; (b) cryptotanshinone, ứng với các nồng độ khác nhau; (c) tanshinone IIA, ứng với các nồng độ khác nhau; và (d) tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA 71 Hình 3.24 Sắc đồ LC-MS/MS đối vơi dung dịch chuẩn chứa: eurycomanone, ứng
Trang 12x
với các nồng độ khác nhau 72
Hình 3.25 Đường hồi quy tuyến tính đối với hypophyllanthin trong phương pháp LC-MS/MS 74
Hình 3.26 Đường hồi quy tuyến tính đối với phyllanthin trong phương pháp LC-MS/MS 74
Hình 3.27 Đường hồi quy tuyến tính đối với (a) hypophyllanthin và (b) phyllanthin trong phương pháp UPLC-DAD 74
Hình 3.28 Đường hồi quy tuyến tính đối với tanshinone I trong phương pháp LC-MS/MS 76
Hình 3.29 Đường hồi quy tuyến tính đối với cryptotanshinone trong phương pháp LC-MS/MS 77
Hình 3.30 Đường hồi quy tuyến tính đối với tanshinone IIA trong phương pháp LC-MS/MS 77
Hình 3.31 Đường hồi quy tuyến tính đối với (a) tanshinone I (b) cryptotanshinone và (c) tanshinone IIA trong phương pháp UPLC-DAD 78
Hình 3.32 Đường hồi quy tuyến tính đối với eurycomanone trong phương pháp LC-MS/MS 78
Hình 3.33 Sắc đồ của mẫu DHC-VX 87
Hình 3.34 Sắc đồ của mẫu lá Diệp hạ châu 89
Hình 3.35 Sắc đồ của mẫu Đan sâm ở Sapa 89
Hình 3.36 Sắc đồ của (a) mẫu Mật nhân ở Hà Giang; (b) mẫu Mật nhân ở Bắc Giang 91
Hình 3.37 Quy trình phân tích định tính, định lượng các hợp chất acetogenin từ dịch chiết của cây Mãng cầu xiêm 93
Hình 3.38 Phổ 1H-NMR của phân đoạn AMF-3 trong dung môi CDCl3 95
Hình 3.39 Sắc đồ HPLC-PDA đối với phân đoạn AMF-3 96
Hình 3.40 Phổ MALDI-TOF-HRMS của các hợp chất acetogenin trong phân đoạn AMF-3 97
Hình 3.41 Quy trình phân tích định tính, bán định lượng các hợp chất trong tinh dầu chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn 100
Trang 13
1
MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm ở một trong những khu hệ thực vật phong phú nhất trên thế giới, khu vực rừng nhiệt đới Đông Nam Á Với bờ biển dài 3200 km và đường biên giới trên đất liền dài tới 4630 km, rừng núi chiếm 3/4 diện tích cả nước, đất nước ta
sở hữu một nguồn tài nguyên động thực vật vô cùng phong phú Theo các tài liệu đã công bố, hiện nay có khoảng trên 12000 loài thực vật hiện hữu ở Việt Nam [6], [7], [10], [20], [24] Theo thống kê của Phan Kế Lộc thì đã có 10386 loài thực vật bậc cao có mạch thuộc 2257 chi và 305 họ (trong đó có 733 loài chỉ gặp trong trồng trọt) [26] Những nghiên cứu phát hiện thuốc từ nguồn thảo dược Việt Nam nhằm giúp chủ động nguồn nguyên liệu sẵn có cũng đã được chú ý thực hiện Một phần các thuốc hiện đại là các hợp chất thiên nhiên hoặc các dẫn xuất của chúng được sử dụng trực tiếp trong công nghiệp dược và chúng được phát triển và ứng dụng rất nhanh ở châu Âu và Bắc Mỹ Các chương trình sử dụng thuốc cổ truyền tại các nước đang phát triển như Mexico, Trung Quốc và Nigeria đang được xúc tiến mạnh
mẽ đặc biệt là sử dụng chúng để hỗ trợ điều trị bệnh bằng các thực phẩm chức năng [8], [10], [21]
Các nội dung chính trong những nghiên cứu về các HCTN có hoạt tính sinh
học là (i) Xây dựng các quy trình tách chiết thích hợp để thu được các hợp chất có HTSH có giá trị cho các ngành dược, công nghệ sinh học, y sinh ; (ii) Tách chiết
và tinh chế để thu được các HCTN có HTSH làm chất chuẩn để định lượng chúng
trong các loài cây thuốc (thực vật nói chung) khác nhau; (iii) Xây dựng quy trình
phân tích (định tính và định lượng) các HCTN có HTSH trong các đối tượng mẫu
khác nhau; (iv) Phân tích cấu trúc và xác định HTSH của các hợp chất mới; (v)
Nghiên cứu xác định HTSH của các hợp chất thiên nhiên và ứng dụng chúng vào các lĩnh vực khác nhau
Nhiều nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về tách các HCTN có HTSH từ cây Diệp hạ châu, Đan sâm, Mật nhân bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và phân tích hàm lượng bằng HPLC [18], [27], [31] Một số nghiên cứu đã xây dựng quy trình phân tích HCTN có HTSH như acetogenin [46], [51], [90], tinh dầu bằng