Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật vùng rễ có khả năng phân giải lân, cố định đạm từ đất trồng cà phê tại tỉnh đắk lắk

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n KỲ 2 TH¸NG 10/2020 67 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI LÂN, CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ ĐẤT TRỒNG CÀ PHÊ TẠI TỈNH ĐẮK LẮK Nguyễn[.]

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI LÂN, CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ ĐẤT TRỒNG CÀ PHÊ TẠI TỈNH ĐẮK LẮK

Nguyễn Khoa Trưởng1, Lê Ngọc Triệu1, Nguyễn Văn Bình1, Nguyễn Thị Bích Liên1, Phan Trung Trực1, Lê Thị Hồng1,

Trần Văn Tiến1, Nguyễn Hắc Hiển2

TÓM TẮT

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi sinh vật vùng rễ có khả năng phân giải lân, cố định đạm cao từ đất trồng cà phê tại Đắk Lắk, nhằm thay thế phân bón hoá học, từ đó có thể sản xuất phân vi sinh giúp nâng cao năng suất cây trồng, đồng thời làm giảm tác hại lên môi trường Kết quả từ 73 mẫu đất trồng cà phê thu tại 2 huyện Cư Kuin và Cư M’gar, tỉnh Đắk Lắk đã tuyển chọn được 3 dòng vi sinh vật có khả năng phân giải lân khó tan cao, lần lượt là QT05B1 thuộc loài Burkholderia ambifaria đạt 790,93 mg/L, ER1 F1 thuộc loài Aspergillus niger đạt 667,00 mg/L và EBD1.1 thuộc loài Klebsiella aerogenes đạt641,13 mg/L sau 96 giờ nuôi cấy Và 3 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm tốt là CF01 K3.1 thuộc loài Rhizobium leguminosarum với hàm lượng nitơ tổng số đạt 86,2 mg/L và đạm amoni đạt 1,1 mg/L; CF01 K3.2 thuộc loài Sphingobium yanoikuyae cóhàm lượng nitơ tổng số đạt 69,7 mg/L và đạm amoni đạt 1,3 mg/L và QT03 K2 thuộc loài Klebsiella pneumoniae có hàm lượng nitơ tổng số đạt 57,4 mg/L và đạm amoni đạt 0,8 mg/L sau

72 giờ nuôi cấy Đây là những chủng vi sinh vật tiềm năng sử dụng trong sản xuất cà phê tại Đắk Lắk

Từ khoá: Cố định đạm, Đắk Lắk, phân giải lân, vi sinh vật

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 9

Trong xu hướng phát triển nông nghiệp hiện nay

là hướng đến sử dụng các giải pháp hữu cơ, hạn chế

tối đa các loại phân bón và các thuốc trừ sâu, bệnh

hóa học Việc sử dụng các chế phẩm sinh học nói

chung và các vi sinh vật hữu ích nói riêng nhằm

phòng, chống sâu, bệnh và sử dụng hiệu quả các

nguồn đạm, lân cũng như sản sinh các chất điều hòa

sinh trưởng trong canh tác nông nghiệp trở nên ngày

càng phổ biến Trong số các vi sinh vật hữu ích được

sử dụng, có nhóm vi sinh vật vùng rễ được quan tâm

Vì trong quá trình sinh trưởng nhóm vi sinh vật này

tiết ra các chất trao đổi thứ cấp kháng các vi sinh vật

có hại, tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây

trồng, kích thích sinh trưởng cây, hòa tan dinh

dưỡng trong đất từ dạng khó tiêu thành dễ tiêu để

cây trồng hấp thụ được (Weller, 1988) Việc sử dụng

các vi sinh vật vùng rễ để đưa vào các chế phẩm vi

sinh hỗ trợ nông nghiệp cũng như cơ sở khoa học

của thực hiện đã được thực hiện tại nhiều nơi trên

thế giới (Vatsyayan và Ghosh, 2013; Olle và Williams,

2013)

1

Trường Đại học Đà Lạt

Email: truongnk@dlu.edu.vn

2

Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Đắk Lắk

Đối với cà phê, nghiên cứu về tính đa dạng của khu hệ vi khuẩn cho thấy cà phê lâu năm có che bóng thành phần hệ vi khuẩn đa dạng hơn cây non, không che bóng; mức độ đa dạng của khu hệ này có

xu hướng tỷ lệ thuận với năng suất cà phê (Evizal et

al., 2012) Do đó, vi khuẩn phân giải lân vùng rễ có khả năng thúc đẩy sinh trưởng cà phê và là đối tượng tiềm năng cho việc sản xuất chế phẩm vi sinh bổ sung vào phân bón (Muleta et al., 2013) Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu tuyển chọn

vi sinh vật tiềm năng để ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học nhằm nâng cao chất lượng cà phê tại Đắk Lắk Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2018) đã phân lập và tuyển chọn được 16 chủng vi sinh vật vùng rễ, trong đó chủng CF19 có hoạt tính phân giải lân và kali mạnh nhất Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, các tác giả chỉ dựa vào đặc điểm hình thái nên chưa định danh được tên các chủng vi sinh vật phân giải lân và kali, cũng như chưa nghiên cứu phân lập

vi sinh vật cố định đạm

Nhằm làm rõ hơn tính đa dạng của nhóm vi sinh vật có ích ở vùng rễ, việc phân lập tuyển chọn vi sinh vật vùng rễ có khả năng phân giải lân và cố định đạm

từ đất trồng cà phê tái canh tại Đắk Lắk được thực hiện Trong nghiên cứu này, bên cạnh đặc điểm hình

thái thì chỉ thị sinh học phân tử được ứng dụng để

định danh các vi sinh vật tiềm năng

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu đất được thu theo đường kính tán cây cà

phê, độ sâu 5 - 20 cm tại các huyện Cư Kuin và huyện

Cư M’gar tỉnh Đắk Lắk Mẫu được ghi thông tin (địa

chỉ, ngày thu mẫu), đựng trong túi nilon buộc kín,

bảo quản trong thùng trữ lạnh và chuyển về Phòng

thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Khoa Sinh học,

Trường Đại học Đà Lạt

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật

Nghiền nhỏ, trộn đều mẫu đất thu được Cân 10

g đất cho vào bình tam giác chứa 90 mL nước muối

sinh lý 0,85% vô trùng và đồng nhất mẫu Tiến hành

pha loãng mẫu đến nồng độ 10-5 Hút 0,1 mL dung

dịch mẫu sau pha loãng ở nồng độ từ 10-3 đến 10-5 cấy

trang đều trên bề mặt các đĩa petri chứa môi trường

thạch NBRIP (Sadiq et al., 2013) để phân lập vi sinh

vật phân giải lân và môi trường Ashby để phân lập vi

sinh vật cố định đạm Nuôi cấy mẫu ở 300C, thời gian

từ 24 - 48 giờ

Sau thời gian nuôi cấy, các chủng vi sinh vật có

khả năng phân giải lân được xác định bằng cách

quan sát vòng phân giải (vòng sáng quanh khuẩn

lạc), đường kính vòng phân giải được tính bằng công

thức D = D2 - D1 trong đó D2 là đường kính vòng

phân giải, D1 là đường kính khuẩn lạc; các chủng vi

sinh vật có khả năng cố định đạm được xác định theo

khuẩn lạc đặc trưng (khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn bóng,

nhầy và gần như trong suốt) trên môi trường Ashby

2.2.2 Phương pháp định lượng khả năng phân

giải lân khó tan và định lượng nitơ tổng số, nitơ dễ

tiêu (amoni)

Hàm lượng lân khó tan được xác định dựa trên

nồng độ PO43- có trong dung dịch nuôi cấy bằng

phương pháp so màu xanh molybdate (Vũ Thị Minh

Đức, 2001) Chủng vi khuẩn và vi nấm được nuôi cấy

trong bình tam giác chứa 50 mL môi trường NBRIP

lỏng, ở nhiệt độ 300C, 150 rpm, mẫu được lấy và định

lượng qua các thời gian từ 24, 48, 72, 96 và 120 giờ; dịch nuôi cấy được ly tâm ở 4.000 rpm trong 20 phút, hút 5 mL dịch nổi sau ly tâm, bổ sung 2 mL dung dịch Amonium molybdate 2,5% và SnCl2 2,5%, xử lý và

so màu ở bước sóng λ = 720 nm

Hàm lượng nitơ tổng số trong dung dịch nuôi cấy được định lượng theo TCVN 8557: 2010 và hàm

2.2.3 Định danh các dòng vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Tách chiết DNA theo phương pháp CTAB có cải tiến bằng cách bổ sung 7% thể tích SDS 10% vào đệm chiết, phá mẫu bằng máy nghiền sử dụng chày tefflon Đối với vi khuẩn, DNA sau khi tách chiết được, tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên vùng 16S-rRNA bằng cặp mồi 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3’); 1492R (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3’) (Gardes et al., 1993) Đối với vi nấm, sử dụng mồi ITS1F (5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3′); ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3′) (White et al., 1990) trên vùng ITS1 –5.8S – ITS2 Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit tinh sạch HI–412 PCR Purification của ABT và giải trình tự tại Công ty PHUSA BIOCHEMICAL (Việt Nam) Định danh vi khuẩn bằng cách sử dụng công cụ BLAST để

so sánh trình tự DNA của các dòng vi khuẩn với dữ liệu trong ngân hàng gen NCBI

2.2.4 Xử lý thống kê

Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel và kiểm định ý nghĩa thống kê theo phép thử Tukey HSD R 4.0.2

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải lân khó tan

Từ 73 mẫu đất phân lập được 30 dòng vi sinh vật, bao gồm 6 dòng vi nấm, 2 dòng xạ khuẩn và 22 dòng

vi khuẩn Dựa vào đường kính vòng phân giải, tuyển chọn được 8 dòng vi khuẩn và 1 dòng vi nấm có đường kính vòng phân giải đạt từ 0,5 – 15,6 mm Kết quả được thể hiện ở bảng 1

Bảng 1 Đường kính vòng phân giải lân khó tan trên môi trường NBRIP

(Đơn vị tính: mm)

4 CF01 B7 1,2 ± 0,00fg 2,1 ± 0,10eh 3,0 ± 0,173ij 3,5 ± 0,27i

Ghi chú: Trong cùng một ngày, các số trung bình theo sau bởi một hoặc những chữ cái giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% (theo phép thử Tukey HSD)

Bảng 1 cho thấy các dòng vi sinh vật có khả

năng phân giải lân tăng từ ngày thứ 3, phân giải

nhanh qua các ngày thứ 4 và thứ 5 Trong đó, ba

dòng vi sinh vật có khả năng phân giải lân mạnh nhất

là dòng QT05 B1 đạt 15,6 mm, dòng EBD1.1 đạt 10,8

mm và dòng ER1 F1 đạt 15,4 mm

Dựa trên kết quả định tính khả năng phân giải lân khó tan, tiến hành định lượng hàm lượng PO43- Kết quả thể hiện ở bảng 2

Bảng 2 Định lượng hàm lượng PO43- của các dòng vi sinh vật đã tuyển chọn (mg/L)

Thời gian Dòng vi sinh

Ghi chú: Trong cùng một ngày, các số trung bình theo sau bởi một hoặc những chữ cái giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% (theo phép thử Tukey HSD)

Các dòng vi sinh vật có khả năng phân giải lân

tăng mạnh từ ngày nuôi cấy thứ 3 và cao nhất vào

ngày thứ 4, sau đó giảm dần vào ngày thứ 5 trong

quá trình nuôi cấy (Bảng 2) Việc giảm khả năng

phân giải lân sau 5 ngày nuôi cấy cho thấy môi

trường đã cạn kiệt chất dinh dưỡng và bắt đầu xuất

hiện các chất độc hại ức chế sự sinh trưởng của vi

sinh vật

Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2018) đã

phân lập được 6 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải

lân với hàm lượng dao động từ 107,25 mg/L đến

145,55 mg/L Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh và Nguyễn

Hữu Hiệp (2019) cũng đã phân lập được 9 dòng vi

khuẩn có khả năng phân giải lân với hàm lượng từ

191,6 đến 241,3 mg/L Từ dẫn liệu trên, kết quả

nghiên cứu đã tuyển chọn được 3 dòng vi sinh vật từ

vùng đất trồng cà phê ở Đắk Lắk với hiệu quả phân

giải lân từ 641,13 mg/L đến 790,93 mg/L sau 4 ngày nuôi cấy

Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của ba dòng vi sinh vật trên như sau: dòng QT05 B1 có khuẩn lạc tròn đều, trắng mờ, nhầy nhớt, trực khuẩn gram âm (Hình 1); dòng EBD1.1 có khuẩn lạc hình tròn, màu trắng đục, bề mặt nhẵn bóng, có chấm tròn ở giữa, viền khuẩn lạc đều, trực khuẩn gram âm (Hình 2); dòng ER1 F1 có khuẩn lạc tròn, hệ sợi màu trắng sinh bào tử màu đen, mọc nhô lên mặt thạch, viền khuẩn lạc mỏng, đều; sợi nấm phân nhánh có vách ngăn, cuống bào từ dài, thể bọng hình cầu lớn, thể bình dạng hình chai, đính bào tử hình cầu, kết thành chuỗi (Hình 3)

3.2 Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng cố định đạm

Hình 4 Định tính khả năng cố định đạm của các

dòng vi khuẩn

Từ 73 mẫu đất đã phân lập được 19 dòng vi

khuẩn có khả năng cố định đạm trên môi trường

Ashby Kiểm tra khả năng bắt màu của khuẩn lạc

trên môi trường Ashby bổ sung 1% Congo đỏ (khuẩn

lạc chuyển màu xám đến đen), chọn lọc được 9 dòng

vi khuẩn có khả năng cố định đạm trên đất trồng cà

phê tại tỉnh Đắk Lắk được phân lập với mật độ đạt từ

6 x 104 đến 1 x 105 CFU/g Tiến hành định tính khả

năng cố định đạm của 9 dòng vi khuẩn phân lập được

trên môi trường Ashbyl lỏng với thuốc thử Nessler,

kết quả thu nhận được 3 dòng có khả năng cố định

đạm mạnh (dựa theo màu sắc của phản ứng tạo màu)

lần lượt là CF01 K3.1, CF01 K3.2 và QT03 K2 (Hình

4)

Kết quả xác định hàm lượng nitơ tổng số và hàm

lượng đạm amoni (NH4) trong dung dịch nuôi cấy

của 3 dòng CF01 K3.1, CF01 K3.2 và QT03 K2 cho

thấy, hàm lượng nitơ tổng số từ 57,4 - 86,2 mg/L và

hàm lượng nitơ dưới dạng amoni (NH4) từ 0,8 -1,3 mg/L (Bảng 3)

Bảng 3 Hàm lượng nitơ tổng số và nitơ dưới dạng amoni (NH4) cố định được của các dòng vi sinh vật Chủng vi

+ (mg/L)

Ghi chú: Trong cùng một ngày, các số trung bình theo sau bởi một hoặc những chữ cái giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

ở mức ý nghĩa 5% (theo phép thử Tukey HSD)

Như vậy, cả 3 dòng CF01 K3.1, CF01 K3.2 và QT03 K2 phân lập được đều cho thấy khả năng tổng hợp N-NH4 (từ 0,8 - 1,3 mg/L NH4) cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh và

Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của ba dòng vi khuẩn trên, được mô tả như sau: CF01 K3.1 khuẩn lạc tròn, nhỏ, hơi nhô lên so với mặt thạch, màu trắng trong suốt, nhầy nhớt, trực khuẩn gram

âm (Hình 5); dòng CF01 K3.2 có khuẩn lạc tròn, nhô thấp so với thạch, màu vàng, trực khuẩn gram âm (Hình 6); dòng QT03 K2 có khuẩn lạc tròn đều, hơi vàng, bề mặt bóng nhẵn, nhô thấp so với thạch, trực khuẩn gram âm (Hình 7)

3.3 Định danh các dòng vi sinh vật đã tuyển

chọn dựa trên dữ liệu phân tử

Giải trình tự gene vùng ITS1 - 5.8S - ITS2 của vi

nấm thu được kích thước là 575 bp, có độ tương đồng

100% với dòng vi nấm trong ngân hàng gene NCBI

Trình tự gene vùng 16S của các chủng vi khuẩn với

kích thước dao động từ 1.406 đến 1.456 bp và có độ

tương đồng cao, từ 98,95 - 99,93% so với 5 dòng vi

khuẩn trong ngân hàng gene NCBI (Bảng 4)

Dòng vi khuẩn Burkholderia ambifaria ngoài

khả năng phân giải lân đã được chứng minh trong

nghiên cứu này còn có khả năng phân hủy độc tố nấm mốc Fusaricacid và ức chế sự phát triển của chủng nấm Fusarium spp (Simonetti et al., 2018) Dòng nấm Aspergillus niger phân lập từ các mẫu đất

ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới đã được chứng minh có khả năng phân giải lân qua nghiên cứu của Chuang et al (2007) với nồng độ hòa tan AlPO4 dao động từ 67,5 đến 237 µg/mL Một số loài thuộc chi

Klebsiella cũng đã được phân lập từ tầng sinh quyển cây trồng tại Hàn Quốc và được chứng minh là có khả năng phân giải lân khó tan với khả năng phân

giải Ca3(PO4)2 dao động từ 107,7 đến 126,9 µg/mL

(Chung et al., 2005)

Dòng vi khuẩn Rhizobium leguminosarum là

một trong các dòng vi sinh vật cộng sinh nốt sần cây

họ đậu phổ biến, ngoài ra chúng còn được tìm thấy ở

rất nhiều nơi khác nhau và chúng đã xâm chiếm rễ

cỏ Ba lá trắng (Gutiérrez et al., 2017; Iriarri et al.,

2019) Dòng vi khuẩn Sphingobium yanoikuyae đã

được chứng minh là có khả năng cố định nitơ trong

nghiên cứu của Rodrigues et al (2018) với hai chủng

có ký hiệu là BU32 và BU92 Đối với dòng vi khuẩn

Klebsiella pneumoniae, đây là một dòng vi khuẩn đã được chứng minh là có khả năng cố định đạm rất tốt thông qua rất nhiều nghiên cứu về nó từ việc phân lập, tuyển chọn trong nghiên cứu của Shah et al

(1986), các nghiên cứu về thay đổi cơ chất molybdate ảnh hưởng đến khả năng cố định nitơ của Kahn et al

(1982) đến các nghiên cứu về phân tích, giải trình tự gen của chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae cố định nitơ trên ruộng mía ở Colombia (Medina-Cordoba et al., 2019)

Bảng 4 Kết quả so sánh trình tự tương đồng các dòng vi sinh vật tuyển chọn với cơ sở dữ liệu NCBI

Vùng bảo thủ dùng để định

Căn cứ định danh Dòng vi

sinh vật

Mức độ tương đồng cao nhất (%)

Mã truy cập trên Genbank

Burkholderia ambifaria

(Palleroni and Holmes) Coenye et al

99,79% với dòng

Aspergillus niger van Tieghem 100% với dòng

Klebsiella aerogenes

(Hormaeche and Edwards)

Tindall et al

Rhizobium leguminosarum

(Frank) Frank (Approved

Lists)

Yabuuchi et al

(Schroeter) Trevisan

4 KẾT LUẬN

Từ 73 mẫu đất trồng cà phê tại tỉnh Đắk Lắk đã

tuyển chọn được 3 dòng vi sinh vật có khả năng phân

giải lân khó tan cao, lần lượt là QT05B1 thuộc loài

Burkholderia ambifaria đạt 790.93 (mg/L), ER1 F1

thuộc loài Aspergillus niger đạt 667.00 mg/L và

EBD1.1 thuộc loài Klebsiella aerogenes đạt 641,13

mg/L sau 96 giờ nuôi cấy Và 3 dòng vi khuẩn có khả

năng cố định đạm tốt là CF01 K3.1 thuộc loài

Rhizobium leguminosarum với hàm lượng nitơ tổng

số đạt 86,2 mg/L và đạm amoni đạt 1,1 mg/L; CF01

lượng nitơ tổng số đạt 69,7 mg/L và đạm amoni đạt

pneumoniae có hàm lượng nitơ tổng số đạt 57,4

mg/L và đạm amoni đạt 0,8 mg/L sau 72 giờ nuôi cấy Đây là những chủng vi sinh vật tiềm năng sử dụng trong sản xuất cà phê tại Đắk Lắk

LỜI CẢM ƠN

Công trình này là sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu, ứng dụng vi sinh vật nội sinh và vi sinh vật vùng

rễ góp phần phát triển cà phê bền vững” do Trường Đại học Đà Lạt chủ trì Các tác giả xin chân thành cảm ơn UBND tỉnh Đắk Lắk, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Đắk Lắk đã cung cấp kinh phí nghiên cứu

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Chuang, C C., Kuo, Y L., Chao, C C., Chao,

W L., 2007 Solubilization of inorganic phosphates

and plant growth promotion by Aspergillus niger

Biology and Fertility of Soils, 43(5): 575-584

2 Chung, H., Park, M., Madhaiyan, M.,

Seshadri, S., Song, J., Cho, H., Sa, T., 2005 Isolation

and characterization of phosphate solubilizing

bacteria from the rhizosphere of crop plants of

Korea Soil Biology and Biochemistry, 37 (10): 1970 -

1974

3 Evizal, R., Tohari I D., Prijambada, I D.,

Widada J., Widianto D., 2012 Soil Bacterial Diversity

and Productivity of Coffee - Shade Tree

Agro-ecosystems Journal Tropical Soils, 17 (2): 181 - 187

4 Gardes, M., T D., 1993 Bruns, ITS primers

with enhanced specificity for

basidiomycetes-application to the identification of mycorrhizae and

rusts Molecular Ecology, 2 (2): 113 - 118

5 Gutiérrez, S P., 2017 Evaluación de rizobios

para el desarrollo de un inoculante eficiente y

competitivo de Trifolium repens Tesisde maestria

Montevideo: Udelar FA

6 Irisarri, P., Cardozo, G., Tartaglia, C., Reyno,

R., Gutiérrez, P., Lattanzi, F A., Rebuffo, M., Monza,

J., 2019 Selection of competitive and efficient

rhizobia strains for white clover Frontiers in

microbiology, 10: 768

7 Kahn, D., Hawkins, M., Fady, R R., 1982

nitrogenase levels and the effect of added molybdate

on nitrogenase derepressed under molybdenum

deprivation Microbiology, 128 (4): 779 - 787

8 Medina - Cordoba, L K., Chande, A T.,

Rishishwar, L., Mayer, L W., Valderrama-Aguirre, L

C., Valderrama - Aguirre, A., Gaby, J C., Kostka, J

E., Jordan, I K., 2019 Genomic characterization and

bacteria isolated from Colombian sugarcane fields

BioRxiv: 780809

9 Muleta D., Assefa F., Borjesson E., Granhall

U., 2013 Phosphate - solubilizing Rhizobacteria

associated with Coffea arabica L in natural coffee

forests of southwestern Ethiopia Journal of the Saudi

Society of Agricultural Sciences, 12: 73 - 84

10 Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh và Nguyễn Hữu

Hiệp, 2019 Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng cố

định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA nội sinh trong

cây cà phê vối (Coffea canephora Pierre ex A

Fronehner) trồng tại tỉnh Đắk Lắk Tạp chí Khoa học

- Trường Đại học Cần Thơ, 55 (2): 34 - 40

11 Nguyễn Thị Thanh Mai, Chu Đức Hà, Phạm Phương Thu và Nguyễn Văn Giang, 2018 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân, kali khó tan từ đất trồng cà phê tại khu vực Tây Nguyên Tạp chí Khoa học Nông nghiệp 60 (5): 34 - 38

12 Olle, M., Williams, I H., 2013 Effective microorganisms and their influence on vegetable production - a review Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 88 (4): 380 - 386

13 Rodrigures, A A., Arauro, M V F., Soares,

R S., Oliveira, B F D., Ribeiro, I D., Sibov, S T., Vieira, J D G., 2018 Isolation and prospection of diazotrophic rhizobacteria associated with sugarcane under organic management Anais da Academia Brasileira de Ciências, 90 (4): 3813 - 3829

14 Sadiq, H M., Jahangir, G Z., Nasir, I A., Iqtidar, M., Iqbal, M., 2013 Isolation and characterization of phosphate - solubilizing bacteria

Biotechnological Equipment, 27 (6): 4248 - 4255

15 Simonetti, E., Roberts, I N., Montecchia, M S., Gutierrez - Boem, F H., Gomez, F M., Ruiz, J A.,

2018 A novel Burkholderia ambifaria strain able to degrade the mycotoxin fusaric acid and to inhibit

Fusarium spp growth Microbiological Research, 206: 50 - 59

characterization of nitrogenase from Klebsiella pneumoniae Methods in enzymology Elsevier: 511 –

519

17 TCVN 5988: 1995 (ISO 5664: 1984) về chất lượng nước - xác định amoni - phương pháp chưng cất và chuẩn độ

18 TCVN 8557: 2010 về phân bón - Phương pháp xác định nitơ tổng số

19 Vatsyayan, N., Ghosh, A K., 2013 Isolation and Characterization of Microbes with Biofertilizer Potential IOSR Journal of Environmental Science, Toxicology and Food Technology, 7 (4): 5 - 9

20.Vũ Thị Minh Đức., 2001 Thực tập vi sinh vật học, Đại học Quốc gia Hà Nội

21 Weller, D M., 1988 Biological control of soilborne plant pathogens in the rhizosphere with

22 White, T J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J.,

1990 Amplification and direct sequencing of fungal

ribosomal RNA genes for phylogenetics PCR

protocols: a guide to methods and applications, 18 (1): 315 - 322

ISOLATION, SELECTION OF PHOSPHATE AND NITROGEN FIXING SOLUBILISING

RHIZOSPHERE MICROORGANISMS FROM COFFEE CULTIVATED IN DAK LAK PROVINCE

Nguyen Khoa Truong1, Le Ngoc Trieu1, Nguyen Van Binh1, Nguyen Thi Bich Lien1,

Phan Trung Truc1, Le Thi Hong1, Tran Van Tien1, Nguyen Hac Hien2

1Dalat University

2Department of Cultivation and Plant Protection, Dak Lak province

Email: truongnk@dlu.edu.vn

Summary The isolation and selection of phosphate and nitrogen-fixing solubilizing rhizosphere microorganism from coffee cultivated are necessary, which is the application of biofertilizer to replace inorganic fertilizer It could support high yield and keep a healthy environment In this study, 30 phosphates and 9 N2-fixing were isolated from the rhizosphere of coffee cultivated in Cư Kuin and Cư M’gar district from Dak Lak province Among them, QT05B1 (Burkholderia ambifaria), ER1 F1 (Aspergillus niger) and EBD1.1 (Klebsiella aerogenes) were determined to exhibited the highest phosphate solubilization (790.93 (mg/L), 790.93 (mg/L), 641.13 mg/L; CF01 K3.1 (Rhizobium leguminosarum), CF01 K3.2 (Sphingobium yanoikuyae), QT03 K2 (Klebsiella pneumoniae) were determined to exhibited the highest ability of N2-fixing with 86.2

, 69.7 mg/L of 1.3 mg/L NH4 +

and 57.4 mg/L of 0.8 mg/L NH4 +

after 72 hours of culture These are potential strains of microorganisms to be used for coffee production in Dak Lak province Keywords: N2-fixing, Dak Lak, phosphate solubilization, microorganisms

Người phản biện: PGS.TS Lê Như Kiểu

Ngày nhận bài: 9/9/2020

Ngày thông qua phản biện: 9/10/2020

Ngày duyệt đăng: 16/10/2020