Báo cáo công nghệ sinh học bài 1 chọn lọc giống vi sinh vật

BÁO CÁO CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHÓM 2 – SÁNG THỨ TƯ THÀNH VIÊN NGUYỄN CHÍ CÔNG HỒ CHÍ CƯỜNG VŨ HẢI ĐĂNG ĐỖ THỊ KIM KHUYÊN TRẦN HỮU HOÀNG CHƯƠNG ĐẶNG CHÍ CÔNG BÀI 1 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT I) TÓM TẮT LÝ[.]

BÁO CÁO CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHÓM 2 – SÁNG THỨ TƯ

THÀNH VIÊN:

NGUYỄN CHÍ CÔNG

HỒ CHÍ CƯỜNG

VŨ HẢI ĐĂNG

ĐỖ THỊ KIM KHUYÊN

TRẦN HỮU HOÀNG CHƯƠNG

ĐẶNG CHÍ CÔNG

BÀI 1: CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT:

1 Khái quát:

Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn và bảo quản giống Việc phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào:

- Chất chuyển hóa tạo ra: ví dụ kháng sinh, sắc tố

- Enzym ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường

- Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật

- Sự thay đổi hình thái

2 Amylase ngoại bào:

Phát hiện: tráng bề mặt môi trường với 1 ít dung dịch Lugol (iod), khi đó

nền môi trường có màu tím than Nếu chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào thì xung quanh chỗ vi sinh vật mọc sẽ có vòng sáng, trong do tinh bột đã

bị thủy phân nên không tạo màu với iod Đường kính của vòng phân giải tinh bột tỷ lệ với hoạt tính

3 Protease ngoại bào

Phát hiện: tráng bề mặt môi trường 1 ít TCA 50% khi đó nên môi trường sẽ

đục vì gelatin bị kết tủa Nếu chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào thì xung quang chỗ vi sinh vật mọc sẽ có vòng sáng, trong đó gelatin bị thủy phân nên không bị tủa

4 Kháng sinh

Phát hiện vi sinh vật kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của

nó đối với các vi sinh vật khác theo phương pháp vạch thẳng vuông góc và phương pháp khuếch tán

5 Phương pháp bảo quản giống

- Giữ giống trên thạch

- Giữ giống dưới tầng lớp dầu khoáng

- Giữ giống trong cát

- Đông lạnh và đông khô

II) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN:

Phát hiện vi sinh vật có tiềm năng:

Tìm thấy 3 chủng trong mẫu đất:

- Chủng 1: khóm lớn, bìa răng cưa, trắng đục, đường kính 10 mm

- Chủng 2: khóm có màu trắng, tròn, đường kính 2 mm

- Chủng 3: khóm nhỏ, tròn, trong, có đường kính 1 mm

1 Khả năng tiết amylase và protease ngoại bào:

Chủng Amylase ngoại bào Protease ngoại bào

Kết luận:

- Chủng 1: có khả năng sinh amylase (đường kính phân giải là 5 mm) và protease (đường kính phân giải là 3 mm)

- Chủng 2: có khả năng sinh amylase (đường kính phân giải là 1 mm) và protease (đường kính phân giải là 2 mm)

- Chủng 3: có khả năng sinh protease (đường kính phân giải là 1 mm)

2 Khả năng tiết kháng sinh

Phương pháp vạch thẳng vuông góc (khoảng cách ức chế)

Phương pháp khuếch tán (đường kính phân giải)

mm

mm

- Chủng B1: có khả năng tiết kháng sinh ức chế E coli trong phương pháp

khuếch tán

- Chủng B2: không có khả năng tiết kháng sinh ức chế E coli và S aureus

- Chủng B3: có khả năng tiết kháng sinh ức chế E coli và ức chế S aureus trong phương pháp vạch thẳng vuông góc; chỉ thấy ức chế S aureus trong

phương pháp khuếch tán

- Chủng B4: có khả năng tiết kháng sinh ức chế E coli và ức chế S aureus trong phương pháp vạch thẳng vuông góc; không thấy ức chế E coli và S

aureus trong phương pháp khuếch tán

III) CÂU HỎI:

Kể tên và nêu nguyên tắc của một số phương pháp phát hiện các đặc tính mong muốn trong thực nghiệm?

- Tỷ trọng: dựa trên sự khác nhau về tỷ trọng tế bào để ly tâm tách riêng các chủng

- Thể khuyết dưỡng: một chủng đột biến mất khả năng tổng hợp một chất nào

đó thì nó chỉ phát triển được trên môi trường có sẵn chất đó nên có thể nhận biết khi so sánh hai môi trường có và không có chất đó

- Kháng chất ức chế: chủng kháng được các chất độc, chất ức chế thì mới phát triển được trên môi trường có chất đó

- Nhạy nhiệt: các vi sinh vật phát triển ở các nhiệt độ khác nhau nên có thể phát hiện được chủng cần quan tâm bằng cách ủ hộp thạch ở các nhiệt độ khác nhau

BÀI 3: ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI CỦA VI

KHUẨN PROBIOTIC

I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT:

1 Khái quát:

Bên cạnh các tiêu chuẩn về tính an toàn, tính đề kháng kháng sinh và chức năng, vi sinh vật được lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng được yêu cầu về đặc điểm sinh học như khả năng sống sót khi đi qua ống tiêu hóa của vật chủ

và đặc điểm công nghệ như sự ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa tác động đến probiotic

Khi sử dụng bằng đường uống, hai yếu tố tác động trực tiếp đến dân số probiotic là pH acid của dịch vị và thành phần muối mật của dịch mật

2 Khả năng chịu dịch vị nhân tạo:

Cho chủng vi sinh vật probiotic tiếp xúc với dịch vị nhân tạo có pH khác nhau Đếm số lượng vi sinh vật sống sót sau từng khoảng thời gian quy định

3 Khả năng chịu đựng dịch mật nhân tạo:

Cho chủng vi sinh vật probiotic tiếp xúc với dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật khác nhau Đếm số lượng vi sinh vật sống sót sau từng khoảng thời gian quy định

Số tế bào/ml = Số khóm x 10 số thứ tự hộp + 1

II) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN:

1 Đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo

Nhận xét:

- Sau 90 phút, mật độ tế bào sinh dưỡng sống sót ở môi trường pH 1 là 6% và

ở môi trường pH 3 là 65%

- Sau 90 phút, mật độ bào tử sống sót ở môi trường pH 1 là 15% và ở môi trường pH 3 là 44%

2 Đánh giá khả năng chịu muối mật

Thời gian (giờ) Đối chứng Nồng độ muối mật (%) 0.3 0.5

Nhận xét:

- Sau 90 phút, mật độ tế bào sinh dưỡng sống sót ở nồng độ muối mật 0.3% là 0.8% và ở nồng độ 0.5% là 0.6%

- Sau 90 phút, mật độ bào tử sống sót ở nồng độ muối mật 0.3% là 15% và ở nồng độ 0.5% là 14%

Kết luận:

- Tế bào sinh dưỡng và bào tử B.subtilis BY79 chịu được trong môi trường

dịch vị nhân tạo có pH = 3 tốt hơn khi trong môi trường pH = 1 Và chịu được trong môi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật 0,3% tốt hơn trong môi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật 0,5% Thời gian trong môi trường thí nghiệm càng lâu, tỷ lệ % sống sót càng giảm

- Bào tử B subtilis chịu đựng tốt hơn tế bào sinh dưỡng trong điều kiện khắc

nghiệt của dịch vị và dịch mật Điều này là hợp lý bởi bào tử là một dạng biến đổi của vi sinh vật nhằm chống lại những điều kiện bất lợi từ môi trường

BÀI 4: TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT:

1 Khái quát:

- Enzym amylase có ứng dụng quan trọng trong công nghiệp, thực phẩm, y dược Trong những năm gần đây amylase được sử dụng nhiều và rộng rãi trong y học để sản xuất gluose làm dịch tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược trong bào chế để sản xuất một số thuốc

- Enzym amylase có thể thu nhận từ động vât, vi sinh vật và thực vật, tuy nhiên enzym để có thể ứng dụng trong y dược cần trải qua các bước tinh chế từ enzym thô

2 Nội dung công việc:

- Thu enzym amylase từ khoai lang

- Tinh chế amylase

- Xác định hoạt lực của enzym thu được bằng phương pháp Heinkel: Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iode Một đơn vị hoạt độ tương ứng với khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 15 phút ở 300C

II) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Hàm lượng protein bằng OD280:

Enzym Thô Enzym Tinh

chế

Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase

(Độ pha loãng là 100)

Tinh bột

(mg)

Đồ thị:

Ta có đường chuẩn: ∆OD= (U/ml)x9.64-0.0018

Đinh lượng hoạt tính amylase

Ống thử Ống chuẩn Ống thử Ổng chuẩn

Dựa vào đường chuẩn: ∆OD= (U/ml)x9.64-0.0018, ta xác định giá trị hoạt tính enzym amylase:

Enzym thô: U/ml = 0.024 x Độ pha loãng= 0.024 x 40000 = 960

Enzym tinh chế: U/ml = 0.080 x Độ pha loãng= 0.08 x 2000 = 160

y = 9.64x - 0.0018 R² = 0.9958

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

U/ml

OD

Thông số

quy trình

tinh chế

Tổng protein (A280nm)

Tổng hoạt tính (U)

Hoạt tính chuyên biệt (U/A280nm)

Hiệu suất (%)

Mức tinh chế (lần) Dịch thô

(V=10ml)

Enzym

sau tinh

chế

(V=45ml)

Nhận xét:

- Hiệu suất sau quá trình tinh chế enzyme đạt 75% là rất cao

- Mức tinh chế là 2.1 nên hiệu quả của quá trình tinh chế là cao

III) CÂU HỎI:

Vẽ quy trình tinh chế enzym?

dd Alginat Natri 2% (1:3), ủ 1 giờ

đệm CH3COOH 0,2M pH 4.8

Calci clorid Lọc lấy tủa

dd glucose 2%(30ml) để thôi enzym

Lọc lấy dịch 4oC trong 12 giờ

enzym alginat Na

Tủa enzym alginat Ca Enzym Tinh

chế

BÀI 5: CỐ ĐỊNH CGTASE LÊN ALGINAT

I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT:

- Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzym duy nhất có khả năng chuyển hóa tinh bột và các chất tự thành hỗn hợp cyclodextrin ở các mức độ polymer hóa từ 6, 7 và 8 đơn vị glucose (ứng với α-CD, β-CD và γ-CD) Việc cố định sẽ tận dụng được khả năng tái sử dụng của các CGTase đắt tiền, và tăng cường tính ổn định cũng như hoạt tính enzym

- Dựa vào bản chất các liên kết giữa chất mang và enzym, người ta phân loại các phương pháp cố định enzym sau:

❖ Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion…

❖ Phương pháp liên kết cộng hóa trị: dựa vào ái lực giữa enzym và chất mang để tạo phức giữa enzym-chất mang bằng liên kết cộng hóa trị

❖ Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel: dựa trên nguyên tắc sự bắt giữ của enzym vào một mạng lưới mà cơ chất và sản phẩm đi qua được nhưng không cho enzym khuếch tán vào môi trường

❖ Phương pháp tạo vi nang: enzym được giữ trong các bao vi thể có màng bán thẩm dày 200 Å (cellulose, polysaccarid)

II) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN:

Xây dựng đường chuẩn định lượng protein:

Nồng độ

BSA(µg/ml)

Ta có đồ thị:

OD= -0.0002C2 + 0.0232C – 0.0268

y = -0.0002x 2 + 0.0232x - 0.0268

R² = 0.9868

-0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

0 10 20 30 40 50 60

Nồng độ BSA(µg/ml)

Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin:

Ta có đồ thị:

∆OD=0.1093CCD + 0.0745

1 Cố định bằng phương pháp bắt giữ

- Hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase:

- Hàm lượng protein cố định:

Hàm lượng protein không cố định (mg) 0.395

Hàm lượng protein cố định (mg) 0.209

y = 0.1093x + 0.0745 R² = 0.973

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 2 4 6 8 10 12

Nồng độ CD (mg/ml)

Nồng độ CD

(mg/ml)

- Xác định hoạt tính của CGTase:

OD thử = 1.664

OD chứng = 1.890

∆OD = OD chứng – OD thử = 1.890-1.664 = 0.226

Từ ∆OD , dựa vào đồ thị ta có: CD= 1.386 mg/ml= 1386 µg/ml

- Hoạt tính CGTase trong mỗi ml dung dịch CGTase được tính theo công thức: A= 𝐶𝐷 × 10 × 𝑛

𝑀 × 𝑡 = 1386×10×40

1135×15 = 32.56 (U/ml)

- Hoạt tính riêng của CGTase:

HTR enzyme tự do = 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜

𝐻𝐿 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 = 32.56

0.604 = 53.91 (U/mg protein)

- Xác định hoạt tính enzyme cố định:

OD thử = 0.938

OD chứng = 1.782

∆OD = OD chứng – OD thử = 1.782-0.938 = 0.844

Từ ∆OD , dựa vào đồ thị ta có: CD = 7.040 mg/ml = 7040 µg/ml

Hoạt tính của enzym cố định: với enzyme tham gia phản ứng: 600mg và tổng lượng enzym cố định trong gel: 10g

ACĐ=𝐶𝐷 × 10000 × 𝑛

𝑀 × 𝑡 × 600 = 7040×10000

1135×15×600 = 6.892 (U/ml)

- Hoạt tính riêng enzyme cố định:

HTR enzyme CĐ= 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝐶Đ

𝐻𝐿 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝐶Đ = 6.892

0.209 = 32.98 (U/mg protein)

- Tỷ lệ hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự do:

TLHL= 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝐶Đ

𝐻𝐿 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 (%)=32.98

53.91×100% = 61.2%

2 Cố định bằng phương pháp hấp phụ

- Hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase:

- Hàm lượng protein cố định:

Hàm lượng protein không cố định (mg) 1.0052

Hàm lượng protein cố định (mg) 0.1178

- Xác định hoạt tính của CGTase:

∆OD = OD chứng – OD thử = 0.432

Từ ∆OD , dựa vào đồ thị ta có: CD =3.271 mg/ml =3271 µg/ml

- Hoạt tính CGTase trong mỗi ml dung dịch CGTase được tính theo công thức: A= 𝐶𝐷 × 10 × 𝑛

𝑀 × 𝑡 =3271×10×40

1135×15 = 76.83 (U/ml)

- Hoạt tính riêng của CGTase:

HTR enzyme tự do = 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜

𝐻𝐿 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 = 76.83

1.123 = 68.41 (U/mg protein)

- Xác định hoạt tính enzyme cố định:

∆OD = OD chứng – OD thử = 0.547

Từ ∆OD , dựa vào đồ thị ta có: CD=4.323 mg/ml=4323µg/ml

Hoạt tính của enzym cố định: với enzyme tham gia phản ứng: 600mg và tổng lượng enzym cố định trong gel: 10g

ACĐ=𝐶𝐷 × 10000 × 𝑛

𝑀 × 𝑡 × 600 = 4323

0.06 × 1135 × 15 =4.232 (U/ml)

- Hoạt tính riêng enzyme cố định:

HTR enzyme CĐ= 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝐶Đ

𝐻𝐿 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝐶Đ =4.232

0.1178 = 35.92 (U/mg protein)

- Tỷ lệ hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự do:

TLHL= 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝐶Đ

𝐻𝐿 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 (%)=35.92

68.41×100% = 52,5%

Nhận xét:

- Hàm lượng protein cố định trong phương pháp bắt giữ cao hơn phương pháp hấp phụ

- Hoạt tính protein cố định trong phương pháp bắt giữ cao hơn phương pháp hấp phụ

III) CÂU HỎI:

1 Nguyên tắc của phương pháp xác định hoạt tính CGTase:

Hoạt tính của CGTase được đánh giá thông qua lượng cyclodextrin do CGTase tạo ra trong điều kiện xác định Dựa vào khả năng hấp phụ và làm mất màu phenolphthalein của cyclodextrin, ta có thể xác định được cyclodextrin tạo thành

Hoạt tính của enzyme được định nghĩa là số µg được tạo thành trong 1 phút

ở điều kiện thí nghiệm

Từ đưa vào đồ thị để tính được số µg cyclodextrin tương ứng được tạo ra do CGTase

Hoạt tính CGTase trong mỗi ml dung dịch CGTase được tính theo công thức:

A= 𝐶𝐷 × 10 × 𝑛

𝑀 × 𝑡 (U/ml)

2 Sơ đồ quy trình cố định CGTase:

Cố định bằng phương pháp bắt giữ

Enzym

Dịch rửa

Dịch lọc Gel Ca-alginate-enzym

Nhỏ từ từ vào 30ml CaCl 2 0.2M

Gel

+ 15ml dung dịch alginate 2%

Rửa Đệm Tris-HCl 2 lần

Cố định bằng phương pháp hấp phụ

15ml alginate 2%

Gel enym-alginat-Ca

Rửa Đệm Tris-HCl 2

+20 ml đệm Tris HCl pH8 +2 ml enzyme CGTase

45 phút Gel

Dịch rửa

BÀI 10: TINH CHẾ ENZYM LYSOZYM BẰNG SẮC KÝ

TRAO ĐỔI ION

I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT:

1 Khái quát:

- Mỗi protein có một giá trị pH mà tại đó tổng điện tích âm và dương của nó bằng nhau, pH này gọi là pI (điểm đẳng điện) Khi pH của dung dịch lớn hơn

pI protein sẽ tích điện âm và ngược lại

- Nhựa sắc ký trao đổi ion gồm một chất nền rắn không tan được gắn các nhóm mang điện tích bằng liên kết cộng hóa trị, các nhóm mang điện tích này sẽ liên kết với các đối ion có điện tích trái dấu một cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện

- Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch của các điện tích trên protein với các điện tích trái dấu của pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân bằng ion

và pH trong dung dịch mà protein sẽ được gắn vào nhựa hay bị đẩy ra khỏi nhựa

2 Nguyên tắc:

Dựa vào sự khác biệt về pI của lysozym (pI=10) so với các protein khác trong lòng trắng trứng(pI ≤ 6), do đó tại pH 8 trên nhựa trao đổi cation lysozym

có pI > pH sẽ tích điện dương và bị giữ lại trong cột còn các protein khác có

pI <pH nên tích điện âm và không trao đổi được với cột và do đó đi ra ngoài Lysozym trong cột sau đó có thể được thôi ra bằng cách tăng nồng độ ion trong dung dịch lên để cạnh tranh và đẩy lysozym ra

II) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN:

Bảng kết quả đo OD ở bước sóng 595 nm:

Nạp lên cột

Rửa cột bằng đệm chạy

Thôi lysozym bằng đệm thôi

Ly tâm

Áp dụng đường chuẩn trong bài 5: OD= -0.0002C2 + 0.0232C – 0.0268 ta tính toán được như sau:

Nhận xét:

Hiệu suất tinh chế thấp Nguyên nhân có thể do:

- Rửa cột nhiều lần với đệm chạy, mỗi lần rửa ion H+ trong đệm chạy cạnh tranh với lysozym để gắn trên nhựa trao đổi cation, làm một phần lysozym

bị đẩy ra ngoài

- Thao tác chưa chuẩn, ví dụ như khi cho dịch lòng trắng trứng hay đệm chạy vào cột sắc ký cần phải nhẹ nhàng để tránh làm tung sepharose lên

III) CÂU HỎI:

Vẽ sơ đồ quá trình tinh chế?

Hàm lượng

protein(mcg/

ml)

252.2 87.0 23.9 15.9 10.5 8.6 7.9 7.1 6.7 5.3 18.6 8.0

Lượng(mcg) 252.2 87.0 59.8 15.9 10.5 4.3 4.0 3.6 3.4 2.7 9.3 4.0

Dịch lòng trắng trứng

Dịch B Dịch nổi

Dịch C

Dịch D