TIỂU LUẬN:CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT GEN pptx

Đây là một loại bệnh thực sự nguy hiểm vì nó có thể dẫn đến tử vong, đặc biệt là đối với những người có hệ miễn dịch yếu như phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh, người già yếu.. Mặc khác Listeri

Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Bộ môn Công Nghệ Sinh Học

Lớp DH06SH

Tiểu luận:

CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC GIA CẦM

CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LISTERIA BẰNG KỸ

THUẬT GEN

GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Phạm Ngọc Hà

MSSV: 06126033

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong số sáu loại Listeria được biết đến thì Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii là những tác nhân gây bệnh Nhưng Listeria ivanovii rất hiếm khi gây bệnh cho người và động vật, trái lại Listeria monocytogenes lại gây bệnh Listeriosis rất phổ biến ở cả

người và động vật Đây là một loại bệnh thực sự nguy hiểm vì nó có thể dẫn đến tử vong, đặc biệt là đối với những người có hệ miễn dịch yếu như phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh, người

già yếu Mặc khác Listeria monocytogenes lại tồn tại trong thực phẩm nên rất dễ lây nhiễm

cho người đòi hỏi phải có công tác kiểm nghiệm thực phẩm khắt khe đối với vi khuẩn này Thông thường trong chuẩn đoán vi khuẩn thường áp dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập trên một số môi trường chuyên biệt và xác định vi khuẩn thông qua các phản ứng sinh hóa… Nhưng do đối tượng thao thác là trên thực phẩm nên sử dụng phương pháp truyền thống là rất khó khăn, tốn kém và mất thời gian Nhờ vậy mà các kỹ thuật gene với những ưu điểm

nổi trội như nhanh, nhạy, chính xác đã được sử dụng để chuẩn đoán Listeria monocytogenes

II TỔNG QUAN:

II.1 Đôi nét về Listeria:

Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae gồm những trực khuẩn nhỏ,

không sinh bào tử, có lông ở một đầu nên có thể di động, gam dương, có phản ứng catalase dương tính, oxydase âm tính Hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý và có khả năng lên men đường

Giống này gồm nhiều loài gây bệnh cho gia súc và người, trong đó có loài Listeria monocytogenes là loài gây bệnh sảy thai truyền nhiễm ở cừu và làm tăng số bạch cầu đơn

nhân trong máu của nhiều loài động vật như bò, ngựa, dê, cừu, heo, chuột, kể cả người

II.1.1 Phân loại: giống Listeria bao gồm 6 loài

II.2.1 Đồng nghĩa và lịch sử

Listeria monocytogenes đã được phân lập từ mẫu bệnh phẩm động vật năm

1926 bởi Prior, nhưng lúc đó chưa có đủ đặc tính chính xác để xác định nó Cũng trong

năm đó L monocytogenes đã được khám phá bởi E.G.D Murray, Wenn và Swam năm

1926 từ chuột lang và thỏ bị viêm gan hoại tử và có tên là Bacterium monocytogenes.Năm

1927, vi sinh vật này cũng được Pirie phân lập từ gan bi bệnh của chuột nhảy (tatera

tobengulae) tại nam Châu Phi, và được đặt tên là Listeria hepalolytica Khi sự tồn tại của vi sinh vật này được xác minh, L monocytogenes chính thức được Bergay đặt tên vào năm

1957

II.2.2 Phân bố và cách lây lan

L monocytogenes được phân bố rất rộng rãi, nó có trong đất, nước, phân, dịch

tiết đường sinh dục và niêm mạc mũi của động vật khỏe…Rau củ có thể nhiễm khuẩn từ đất hoặc từ phân bón Súc vật ở nông trại có thể nhiễm khuẩn mà không có triệu chứng gì

và thực phẩm từ động vật như thịt, thịt gia cầm và các sản phẩm sữa có thể bị nhiễm khuẩn Theo Sở giám sát và an toàn thực phẩm thuộc Bộ nông nghiệp, những trường hợp

bệnh Listeriosis ở Mĩ đều liên quan đến thực phẩm xúc xích nhỏ xông khói, thịt hộp tươi

ngon, patê lạnh, xúc xích Ý, pho phát mềm của Pháp, pho mát mềm kiểu Mêhicô, tôm, bơ, rau quả tươi và sữa chưa tiệt trùng Trận dịch bệnh bùng phát có thể liên quan đến sò hến tôm cua, cá tươi, thủy sản xông khói, lưỡi heo, kem, xà lách gạo, xà lách cải bắp và patê thịt

Do đó, con người có nguy cơ nhiễm khuẩn L monocytogenes cực kỳ cao với các loại thực phẩm chưa nấu chín kỹ trước khi ăn và các loại thức ăn làm sẵn Bệnh thể hiện ở nhiều dạng và sự lây truyền của vi khuẩn có khác nhau Nếu như ở dạng phủ tạng, sự lây nhiễm qua đường ăn uống Nếu như ở dạng thần kinh chủ yếu lây nhiễm qua đường mắt và mũi

II.2.3 Hình thái và nhuộm màu

L monocytogenes gồm những trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, Gram dương Trong môi trường nuôi cấy, khi tế bào còn non L.monocytogenes được tìm thấy ở dạng trực khuẩn

Nhưng trễ hơn dạng hình cầu (0,5µm×1-2 µm) lại chiếm ưu thế, đôi khi vi khuẩn xếp thành

chuỗi ngắn(dễ nhầm với Streptococcus), lúc này chiêm mao dài 6-20 µm Vi khuẩn không

sinh bào tử, không tạo giáp mô, có khả năng di động Ở 20-250C vi khuẩn di động mạnh nhất Ở 370C vi khuẩn di động nhờ một chiêm mao ở đầu

Khi nhuộm từ mô bệnh hoặc dịch nuôi cấy, đôi khi vi khuẩn có dạng hình cầu xếp

chuỗi dễ nhầm với Streptococci Trong trường hợp này có thể dùng phản ứng Catalase để

phân biệt Trong canh 3-6 giờ ở 370C vi khuẩn có dạng trực, nuôi cấy 3-5 ngày vi khuẩn có

dạng dài 6-20 µm hay hơn(đặc biệt chủng R) Sự di động của Listeria dùng để phân biệt với Erysipelothrix

II.2.4 Đặc tính nuôi cấy và yêu cầu tăng trưởng

Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiệm yếm khí Nhiệt độ thích hợp 30-370C,

pH 7,2-7,4 phát triển trên môi trường nhưng thường sử dụng môi trường thạch máu trong điều kiện 5-10% CO2 cho khuẩn lạc tròn bóng, màu trắng, đường kính 0,5-1mm và gây dung huyết

Trên môi trường Trytose agar tạo khóm sáng, trắng mờ và có màu xanh lam (màu green) khi quan sát dưới ánh sáng nghiêng

blue-Trên môi trường LSA (Listeria selective agar) tạo vòng đen quanh khóm do sự phân giải Esculin sau 24-48 giờ

Môi trường Gelatin không gây tan chảy

II.2.5 Đặc tính sinh hóa

Lên men chậm các loại đường như glucose, rhamnose, salicin, levulose Không lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose Phản ứng Catalaza dương tính

II.2.6 Sức đề kháng

Khi tiến hành phân tích chẩn đoán Listeriosis và khảo sát nguồn nhiễm khuẩn thì thấy rằng

vi khuẩn này có thể tồn tại trong thời gian dài lâu có thể là 90 ngày từ khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn và xuất hiện triệu chứng Thời gian trung bình từ khi nhiễm khuẩn vào

cơ thể đến khi phát bệnh khoảng 30 ngày

Vi khuẩn này rất bền Nó kháng nhiệt (mặc dầu nhiệt độ không cao, dưới 600C), muối, nitrite và acid, sống sót ở điều kiện lạnh đông và thậm chí có thể sinh sôi phát triển chậm chạp trong tủ lạnh(ở khoảng 40C)

Vi khuẩn bị diệt ở 600C trong 30 phút và 720C trong 15 giây Vi khuẩn đề kháng với sự khô hạn Có thể sống sót trong thực phẩm và đất nhưng bị diệt bởi những chất sát trùng thông thường

Nhay cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng tetracycline cho kết quả tốt nhất Người ta có thể kết hợp giữa Trimethoprim với Sulphamethazol trong điều trị, vi khuẩn kháng lại với Quinolones Erythromycine, ampicillin được dùng trong điều trị bệnh cho người

II.2.7 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố

Cấu trúc kháng nguyên của L.monocytogenes phức tạp, được chia thành 16 serotype căn

bản dựa trên kháng nguyên O và H

Kháng nguyên O: Bền với nhiệt được chia thành 14 loại, ký hiệu 1-14

Kháng nguyên H: Không bền với nhiệt, chia làm 4 loại:a, b, c, d Hiện nay có 3 chủng

là nguyên nhân gây bệnh chính có cấu trúc kháng nguyên là: 1/2a; 1/2b; 4b

(III), VI, VIII (III), V, VI, VIII, IX)

II.2.8 Khả năng lây bệnh

Trong tự nhiên vi khuẩn gây bệnh Listeriosis và ở dạng thần kinh đôi khi được gọi là

bệnh quay mòng(circling disease) phổ biến nhất đối với động vật nhai lại như bò, cừu đặc biệt vào mùa đông và đầu mùa xuân với mọi lứa tuổi Đối với dạng phủ tạng thường gặp ở động vật dạ dày đơn Bệnh có thể gây sảy thai ở ngựa Ngoài ra vi khuẩn còn gây bệnh cho gia cầm và cá Ở người thường gặp sảy thai, thai chết và viêm não Ở vài động vật thể hiện

sự gia tăng bạch cầu đơn nhân

Trong phòng thí nghiệm: Dùng thỏ và chuột lang Chuột nhạy cảm, chết sau khi tiêm nhiễm 48 giờ với bệnh tích hoại tử gan Dùng test ANTON gây viêm kết mạc mắt

Một bệnh do L.monocytogenes

Viêm màng não mủ, hay viêm màng não nhiễm khuẩn, là hiện tượng viêm của các màng

bao bọc quanh hệ thần kinh trung ương (não và tủy sống) do sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh trong khoang dịch não tủy Sự viêm nhiễm này sẽ gây nên tình trạng sinh mủ bên trong hệ thống thần kinh trung ương

Những bệnh nhân suy giảm miễn dịch như người già, trẻ sơ sinh, bệnh nhân điều trị thuốc

ức chế miễn dịch, AIDS thường có nguy cơ bị bệnh Viêm màng não mủ sơ sinh do tác nhân này thường nằm trong bối cảnh nhiễm trùng huyết nặng Các dấu hiệu nghi ngờ trên lâm sàng là: mẹ thường có sốt, sinh non không rõ nguyên nhân, nhau thai có tổn thương hạt

II.2.9 Cơ chế gây bệnh

Từ lâu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng vi khuẩn Listeria lây lan từ tế bào này

sang tế bào khác trong cơ thể con người Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóng tạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và đẩy sang tế bào liền kề Khi đó vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề đó

Hamon et al Nature Reviews Microbiology 4, 423–434 (June 2006) |

doi:10.1038/nrmicro1413

a | L monocytogenes đi vào tế bào như thể thực bào b | Vi khuẩn bên trong không bào

(Được biết như là thể thực bào) c,d | Màng của không bào bị phá vỡ bởi sự tiết ra hai loại

phospholipases: PlcA và PlcB, and độc tố listeriolysin O Vi khuẩn được giải phóng trong

tế bào chất, nơi chúng được nhân lên nhiều lần và bắt đầu với sự trùng hợp actin) e | Sự

trùng hợp actin cho phép vi khuẩn tạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế

bào và vào tế bào chất tế bào liền kề f |Trong tế bào bên cạnh, vi khuẩn hiện diện ở màng

kép không bào từ đó chúng có thể thoát khỏi sự duy trì của chu kỳ

Giáo sư Ireton và nhóm của ông đã phát hiện ra một quá trình thứ hai hỗ trợ việc lây

lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh mà trước đây chưa từng được biết đến

Quá trình này dần dần đã làm suy yếu khả năng tự vệ khỏi việc nhiễm bệnh của tế bào thứ hai và đã xuất hiện trong lần xuất bản tuần này của tạp chí khoa học Nature Cell Biology

Vi khuẩn Listeria di chuyển qua tế bào chất của tế

bào trong cơ thể người sử dụng một phần của

khung tế bào gọi là các sợi actin, Vi khuấn Listeria

có mày xanh và sợi actin màu đỏ Qua ảnh có thể nhận thấy rằng sợi actin hình thành một cấu trúc dạng đuôi phía sau vi khuẩn Những sợi actin này

có tác dụng đẩy Vi khuẩn Listeria qua tế bào chất

của tế bào trong cơ thể người Những mũi tên trong ảnh cho thấy một con vi khuẩn đang chuyển động

trong tế bào chất (Ảnh: Keith Ireton )

Màng tế bào, hay lớp ngoài cùng của những tế bào khỏe mạnh thông thường căng ra Tình trạng căng đó được kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton

phát hiện ra rằng một loại pro-tê-in trong vi khuẩn Listeria gọi là InIC xuất hiện làm giảm

đi độ căng của màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn để xuyên thủng màng tế bào và sau đó lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng hơn

Phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton cũng đưa ra bản báo cáo cho thấy cách mà InIC làm giảm độ căng là ngăn chặn chức năng của protein Tuba trong cơ thể người Thông thường, chức năng của Tuba trong tế bào người không nhiễm bệnh là tạo ra độ căng của

màng tế bào Protein InIC trong vi khuẩn Listeria đã khống chế sự hoạt động của Tuba,

làm giảm độ căng và giúp vi khuẩn lây lan sang các tế bào liền kề

II.2.10 Miễn dịch

Cơ thể thú có thể hình thành miễn dịch sau khi nhiễm Miễn dịch trung gian tế bào là chủ yếu Hiện nay có hai loại vaccine chết và nhược độc có thể đem lại kết quả Vaccine thường sử dụng: 1a và 4b đạt kết quả phòng bệnh trên cừu

II.2.11 Chẩn đoán bằng phương pháp truyền thống

Như chúng ta đã biết sử dụng phương pháp trên rất mất thời gian( ít nhất 10 ngày), đặc biệt đối với công tác phòng chống dịch bệnh hay trong xác định nguyên nhân gây bệnh ở người khi dịch bệnh bùng phát Măc khác L monocytogenes rất dễ nhầm lẫn với Erysipelothrix,

do đó để xác đinh chính xác vi khuẩn này phải tiếp tục sử dung các phản ứng sinh hóa như:

- +

-

-

-

- +

- +

Vào những năm 1990, Bộ Nông nghiệp Mĩ cho biết có một trận dịch bệnh này từ bánh

mì kẹp xúc xích nóng và có thể là các cửa hàng bán thịt ngon dẫn đến ít nhất 101 người bị bệnh khiến 15 người lớn tử vong và 6 thai nhi bị sinh non

Năm 1999, loài L monocytogenes đặc biệt cực độc đã tiến triển báo động các viên chức

y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm phải giải quyết vấn đề

Nuôi cấy trên môi trường LSA

Bệnh phẩm: gan, lách, não, thai bi sảy…

Nhuộm Gram

Chọn khuẩn lạc

Test ANTON Tiêm não thỏ (chết sau 2-3 ngày)

Kiểm tra máu thỏ(Bạch cầu đơn nhân tăng 420-820/mm3) Thỏ bị nhiễm Listeria

Năm 2002, đợt bùng phát dịch bệnh Listeriosis ở nhiều bang ở Mỹ – một căn bệnh nguy hiểm do vi khuẩn Listeria gây ra -đã xác nhận có 46 ca nhiễm bệnh, 7 ca tử vong và 3 ca

hỏng bào thai

Mặc dù “quy định tạm thời” đối với các sản phẩm thịt và thịt gia cầm chế biến sẵn phát hành năm 2003 giúp kiểm soát sự bùng phát vi khuẩn, nhưng rõ ràng đã không thể loại bỏ được bệnh hoàn toàn Theo Trung tâm y tế dự phòng CDC, ước tính 2.500 người bị bệnh

Listeriosis nặng mỗi năm, trong số đó có 500 người tử vong Người có nguy cơ cao có thể

mắc bệnh này sau khi ăn thực phẩm thậm chí chỉ nhiễm vài con vi khuẩn

Năm 2008 ổ dịch Listeriosis ở Canada nguyên nhân từ nhà máy Maple Leaf Foods ở

Toronto, Ontario làm hai mươi hai người chết và có tổng số 57 trường hợp nhiễm bệnh

III CÁC KỸ THUẬT THƯỜNG SỬ DỤNG ĐỂ CHUẨN ĐOÁN

L.MONOCYTOGENES

III.3.1 Giới thiệu kỹ thuật PCR , Real-Time PCR và Multiplex PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm trong test tube

K. Mullis đã phát minh ra PCR vào năm 1985 

Ch  8 năm sau, K. Mullis đã nhân gi i Noben cho phát minh này 

Nguyên tắc: PCR là kỹ thuật invitro dùng để khuếch đại một trình tự DNA dựa trên

nguyên tắc của một phản ứng sinh hóa nhờ hoạt động của enzyme polymerse

Nguyên liệu:DNA quan tâm, enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt, 2 đoạn mồi nucleotide, 4

loại dNTP, dung dịch đệm cho phản ứng, Mg2+

Các bước thực hiện:

- Giai đoạn 1: biến tính (denateration), nhiệt độ 94-950C trong 30-60s

- Giai đoạn 2: bắt cặp (annealation), nhiệt độ 40-700C

- Giai đoạn 3: kéo dài (elongation), nhiệt độ 720C trong 1-2 phút

Qui trình th c hi n xét nghi m PCR 

và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành

Chọn chương trình chu kỳ nhiệt

Điện di,quan sát và chụp ảnh

Quang phổ huỳnh quang

Máy luân nhiệt

Máy vi tính

Qui trình th c hi n Real‐ time PCR 

Melt-curve: đường cong nóng chảy

Bằng cách nào để có tín hiệu Real- Time PCR, để biết phản ứng PCR đang xảy ra:

Phẩm nhuộm khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang mạnh hơn khhi ở trạng thái

SYBR GREEN 1 Là thuốc nhuộm liên kết DNA được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay,liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi SYBR Green I chỉ phóng thích một lượng nhỏ tín hiệu huỳnh quang khi nó ở trong dung dịch, nhưng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng gấng 1000 lần khi nó liên kết với DNA mạch đôi Như vậy, tín hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng sẽ

tỷ lệ với lượng DNA mạch đôi hiện diện, và gia tăng khi trình tự mục tiêu được khuếch đại

Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng Real-Time PCR Tín hiệu huỳnh quang gia tăng rõ rệt khi phân tử thuốc nhuộm liên kết với DNA mạch đôi

Những ưu điểm về khoa học và thực tiễn sẽ thúc đẩy bạn cố gắng thực hiện phản ứng multiplex, phản ứng khuếch đại nhiều hơn một mục tiêu trong ống phản ứng đơn Hiện nay, ta có thể khuếch đại và định lượng nhiều nhất là 5 mục tiêu trong cùng 1 ống phản ứng với những ưu điểm là:

9 Giảm lượng mẫu cần thiết ban đầu, điều này quan trọng khi lượng mẫu ban đầu hạn chế

9 Giảm hiện tượng âm tính giả, nếu một mẫu đối chứng được khuếch đại trong mỗi mẫu

9 Gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện đồng thời giảm tiêu tốn hóa chất phản ứng

9 Giảm đếm mức thấp nhất việc tác động đến mẫu và nguy cơ lây nhiễm trong phòng thí nghiệm

III.3.2 Giới thiệu về kỹ thuật miễn dịch từ phân tách (Immunomagnetic separation-IMS) Nguyên tắc của phương pháp IMS:

Các hạt nhựa đồng dạng, siêu thuận từ, phân tán riêng rẽ được bao bọc với 1 phối tử đặc hiệu với 1 mục tiêu đặc biệt Ví dụ như kháng thể với bề mặt kháng nguyên