Tiểu luận: Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng doc

Sản xuất mAb yêu cầu phải tiến hành gây kích ứng miễn dịch cho thú, thường là một con chuột, sau đó thu nhận các tế bào sản xuất kháng thể từ lách của nó và dung hợp các tế bào này với t

Trường ĐH Nông Lâm tp Hồ Chí Minh

Bộ môn Công Nghệ Sinh Học

-o0o -

CHỦ ĐỀ SEMINAR:

SẢN XUẤT VÀ THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009

B/ ĐẶT VẤN ĐỀ:

Ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội nói chung và của nền y học nói riêng đã đem lại nhiều phương pháp mới trong việc phòng ngừa, phát hiện và chữa trị bệnh cả trên người lẫn trên thú Có rất nhiều phương pháp mới được nghiên cứu, thử nghiệm và đã đem lại nhiều ứng dụng to lớn Một trong những phương pháp mới xuất hiện trong thời gian gần đây là sử dụng kháng thể đơn dòng trong việc chuẩn đoán và điều trị bệnh

Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies-mAb) được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh học cơ bản, trong chẩn đoán bệnh, và trong điều trị các bệnh như bệnh nhiễm trùng và ung thư

Kháng thể đơn dòng là công cụ quan trọng được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng nhiều trong các nghiên cứu của họ và đã mang lại nhiều tiến bộ về mặt y tế

Với vai trò quan trọng như trên và tiềm năng vô cùng to lớn trong việc

chuẩn đoán, điều trị bệnh Kháng thể đơn dòng cần phải được nghiên cứu nhiều hơn, sâu hơn để có thể khai thác hết những lợi ích mà nó đem lại Tuy nhiên, việc hiểu về kháng thể đơn dòng vẫn còn nhiều hạn chế vì đây là một trong những lĩnh vực còn khá mới mẻ đặc biệt là đối với nước ta Trong bài viết này, tôi hy vọng sẽ mang lại cho các bạn một vài thông tin cơ bản về kháng thể đơn dòng, mà cụ thể là

về sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng Thông qua bài viết này, tôi hy vọng

sẽ đem lại cho các bạn cái nhìn cơ bản nhất, tổng quát nhất về kháng thể đơn dòng

Hy vọng rằng bài viết này sẽ là cơ sở, là tiền đề để từ đó thuận lợi hơn trong những bước đi tiếp trong việc tìm hiểu, nghiên cứu về kháng thể đơn dòng của các bạn sau này

C/TỔNG QUAN:

C.I/Khái quát về kháng thể đơn dòng:

C.I.1/Kháng thể (antibody) :

Kháng thể là những phân tử

protein được sản xuất bởi những những

tế bào lympho B khi có sự kích ứng

đáp ứng miễn dịch bởi kháng nguyên

trên cơ thể vật chủ

Có hai loại kháng thể :

- Kháng thể đa dòng: Tập hợp các kháng thể đặc

hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên

cho trước Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp

nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một

kháng nguyên :đáp ứng như vậy gọi là đa dòng. 

- Kháng thể đơn dòng : chỉ nhận biết một epitope trên

một kháng nguyên cho sẵn Tất cả các kháng thể đơn dòng

cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng

một dòng tương bào. 

Các kháng thể có tính kết hợp đặc hiệu với các kháng

nguyên đã kích ứng tạo ra chúng Đây chính là cơ sở của các phản ứng bảo vệ của

cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh và của các kỹ thuật chuẩn đoán miễn dịch Sự tạo thành kháng thể phụ thuộc vào bản chất của kháng nguyên (protein,

polysaccharide, … ), phương pháp gây miễn dịch (chất bổ trợ, đường xâm nhập, số lần xâm nhập,… ) và phụ thuộc vào cơ thể vật chủ (tình trạng sức khỏe, tình trạng miễn dịch, dinh dưỡng, tuổi,… )

Các tế bào lympho B là các tế bào sản xuất kháng thể Mỗi dòng tế bào lympho B chỉ có thể sản xuất một loại kháng thể tương ứng với yếu tố kháng

nguyên mà chúng nhận diện được Do mỗi kháng nguyên có nhiều yếu tố kháng nguyên khác nhau nên đáp ứng miễn dịch sẽ tạo thành nhiều loại kháng thể khác nhau, trong trường hợp này ta có kháng thể đa dòng (polyclonal antibody)

C.I.2/Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody):

Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody – mAb ) là kháng thể được tạo thành từ những tế bào lympho B có nguồn gốc từ một dòng tế bào lympho B

Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh học cơ bản, trong chẩn đoán bệnh, và trong điều trị các bệnh như bệnh nhiễm trùng và ung thư

Sản xuất mAb yêu cầu phải tiến hành gây kích ứng miễn dịch cho thú,

thường là một con chuột, sau đó thu nhận các tế bào sản xuất kháng thể từ lách của

nó và dung hợp các tế bào này với tế bào ung thư (như từ các tế bào u tủy myeloma ) để làm cho chúng trở nên bất tử giống như đặc điểm của các tế bào u tủy, điều này có nghĩa là chúng sẽ phát triển và phân chia vô hạn định Một khối các tế bào hợp nhất được gọi là khối tế bào lai (hybridoma), và các tế bào này sản xuất ra mAb Sự phát triển của hybridoma bất tử đòi hỏi việc sử dụng động vật.Việc thay thế không dùng động vật không được phổ biến Một nhà nghiên cứu, người muốn nghiên cứu một protein đặc biệt hoặc những phân tử khác, đã chọn một dòng tế bào hybridoma để sản xuất mAb mà phản ứng một cách mạnh mẽ với protein hoặc phân tử đó Các tế bào phải phát triển và nhân lên để tạo thành một dòng tế bào mà

sẽ sản xuất ra mAb mong muốn Có hai phương pháp để phát triển các tế bào này: tiêm chúng vào khoang màng bụng của một con chuột hoặc dùng trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro Khi tiêm vào một con chuột, các tế bào hybridoma sẽ nhân lên và sản xuất ra dịch lỏng (bệnh cổ trướng) ở bụng của nó Dịch lỏng này có chứa một nồng độ cao kháng thể Sản xuất kháng thể bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột thì rẻ tiền, dễ thực hiện, và quen thuộc Tuy nhiên, nếu tích tụ quá nhiều dịch lỏng hoặc nếu hybridoma là một bệnh ung thư độc, chuột sẽ trải qua đau đớn hoặc nguy hiểm Nếu một quy trình sản xuất gây đau đớn hoặc nguy hiểm với động vật, thì nên điều chỉnh để tìm kiếm các lựa chọn thay thế Một trong những giải pháp thay thế là gia tăng số lượng những tế bào hybridoma trong môi trường nuôi cấy tế bào Kĩ thuật này yêu cầu một số kiến thức chuyên môn, những phương tiện, thiết bị đặc biệt, có thể tốn kém về mặt tiền bạc và mất nhiều thời gian Hiện

đã có một số nghiên cứu đáng kể trong kĩ thuật nuôi cấy tế bào in vitro cho sự phát triển hybridoma, và những phương pháp mới hơn này ít tốn kém hơn, nhanh hơn,

và sản xuất kháng thể ở một nồng độ cao hơn so với những phương pháp trước đây

C.II/ Quá trình sản xuất kháng thể đơn dòng:

Quy trình sản xuất kháng thể được tóm tắt ở sơ đồ bên dưới :

Trước khi sản xuất kháng thể bằng phương pháp in vivo hoặc in vitro, những

tế bào lai mà sẽ làm nhiệm vụ sản xuất kháng thể được tạo ra

Các bước sản xuất những tế bào lai này được mô tả ở sơ đồ bên dưới Sản xuất kháng thể đơn dòng-những tế bào sản xuất được sử dụng đối với động vật, thường sử dụng chuột Phương pháp này cung cấp một dòng tế bào có khả năng sản xuất một loại kháng thể trong một giai đoạn dài Một khối u từ dòng tế bào”bất tử” thì được gọi là một hybridoma

Không có phương pháp sản xuất tế bào lai hybridima nào mà không sử dụng động vật Gần đây, kỹ thuật in vitro cho phép sản xuất những phần kháng thể gắn

kháng nguyên bên trong tế bào, nhưng kỹ thuật này vẫn đang được thử nghiệm và kết quả, và chức năng chưa chắc chắn (Frenken và cộng sự 1998) Nó cũng có thể thay đổi nhiều về mặt di truyền của kháng thể đơn dòng chuột sản xuất với trình tự gen người, giảm tính sinh miễn dịch của kháng thể đơn dòng đã định trước cho việc điều trị bệnh trên người Trước khi đến phương pháp hybridoma, các nhà nghiên cứu chỉ có thể sản xuất huyết thanh kháng thể đa dòng Một số lương lớn những nhu cầu về động vật được chủng ngừa và không làm bất tử tế bào sản xuất kháng thể, vì vậy nó yêu cầu phải lặp đi lặp lại trên động vật dùng để thu được nhiều kháng thể hơn Phát triển kỹ thuật tế bào lai hybridoma làm giảm một số lượng lớn động vật (chuột, thỏ, …) cần thiết để sản suất kháng thể

Bước 1: gây miễn dịch trên chuột và lựa chọn những con chuột hiến để sản xuất tế bào lai hybridoma

Chuột được gây miễn dịch với một kháng nguyên đã được chuẩn bị cho việc tiêm hoặc nhũ hóa kháng nguyên với tá chất Freund hoặc những tá chất khác hoặc bằng một miếng mỏng dạng gel đồng nhất có chứa kháng nguyên Những tế bào nguyên vẹn, bao gồm cả màng và những vi sinh vật thì thường được dùng như là những kháng nguyên Ở hầu hết tất cả các phòng thí nghiệm, chuột được sử dụng

để sản xuất kháng thể mong muốn Thường thì, chuột được gây miễn dịch 2-3 tuần một lần nhưng phương pháp gây miễn dịch biến đổi giữa các nhà nghiên cứu Khi hàm lượng kháng thể tạo ra đủ lớn Chuột đã có đáp ứng miễn dịch mạnh sẽ được gây mê và thu lấy lách để chọn lọc dòng tế bào lympho chuyên biệt dùng cho việc lai với tế bào ung thư myeloma

Bước 2: sự lựa chọn chuột để sản xuất kháng thể

Sau một vài tuần gây miễn dịch, mẫu máu thu được từ chuột để đo lượng kháng thể huyết thanh Một vài kỹ thuật nhân đạo được phát triển để thu tập một thể tích nhỏ máu từ chuột (Loeb and Quimby 1999) Độ chuẩn của kháng thể huyết thanh được xác định bởi nhiều kỹ thuật khác nhau, như enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA) và phép chẩn đoán số lượng DNA trong tế bào( flow cytometry) Nếu độ chuẩn của kháng thể cao, sự hợp nhất có thể được thực hiện Nếu độ chuẩn của kháng thể thấp, chuột có thể tăng lên cho tới khi phản ứng

đủ là được, vì vậy việc xác định mẫu máu được lặp đi lặp lại nhiều lần Khi độ chuẩn của kháng thể đủ cao, chuột thường tăng bằng cách tiêm kháng nguyên không có tá dược trong màng bụng hoặc trong tĩnh mạch (theo tĩnh mạch đuôi) 3 ngày trước khi hợp nhất nhưng 2 tuần sau lần gây miễn dịch đầu tiên Sau đó, chuột bị giết và lách của chúng được lấy ra để sản xuất tế bào lai hybridoma bằng phương pháp in vitro

Bước 3: Chuẩn bị tế bào ung thư tủy xương Myeloma

Sự dung hợp những tế bào lách sản xuất kháng thể, mà có thời gian tồn tại giới hạn, với những tế bào ung thư tủy bất tử (myeloma), kết quả là trong tế bào lai hybridoma có khả năng phát trển không giới han

Tế bào ung thư tủy xương myeloma là những tế bào bất tử mà được nuôi cấy với azaguanine để đảm bảo tính nhạy cảm của chúng với hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) môi trường chọn lọc được dùng sau khi dung hợp tế bào

8-Một tuần trước khi dung hợp tế bào, những tế bào ung thư tủy xương myeloma được cho phát triển trong 8-azaguanine Các tế bào phải có khả năng sống cao và phát triển nhanh chóng Môi trường HAT chỉ cho phép những tế dung hợp tồn tại trong một thời gian dài trong môi trường nuôi cấy

Bước 4: Sự hợp nhất giữa tế bào ung thư tủy xương myeloma với tế bào lách của chuột đã được gây miễn dịch:

những tế bào lách đơn từ chuột đã gây miễn dịch được hợp nhất với các tế bào ung thư tủy xương myeloma đã được chuẩn bị trước đây

Sự dung hợp được hoàn thành bởi polyethylene glycol, là chất có khả năng làm tan màng tế bào, tạo điều kiện cho tế bào lympho sản xuất kháng thể với tế bào myolema có thể kết hợp lại với nhau và tạo thành tế bào lai hybridoma bất tử Một chú ý trong bước thứ 3 này là chỉ có những tế bào dung hợp mới phát triển được trong môi trường chọn lọc đặc biệt Những tế bào này sau đó được phân phối tới đĩa có 96 giếng chứa đựng những tế bào tiếp liệu thu được từ việc rửa màng bụng chuột trong nước muối Tế bào tiếp liệu được tin rằng để cung cấp các yếu tố phát triển để đẩy mạnh sự phát triển của tế bào lai hybridoma (Quinlan and Kennedy 1994) Việc chuẩn bị thương mại là kết quả từ việc thu gom môi trường giúp cho phát triển trong nuôi cấy tế bào và chứa đựng các yếu tố phát triển có sẵn để có thể

sử dụng thay cho các tế bào tiếp liệu thu được từ chuột Nó cũng có thể được sử dụng cho đại thực bào xuất phát từ tủy xương chuột như những tế bào tiếp liệu (Hoffman and others 1996)

Bước 5: Tạo dòng dòng tế bào lai hybridoma bằng “pha loãng có giới hạn” hoặc phát triển và ổn định dòng bằng sản xuất dịch tràn ổ bụng

Điểm mới ở bước này, một nhóm nhỏ các tế bào lai hybridoma từ đĩa 96 giếng có thể phát triển trong nuôi cấy mô theo sau bởi sự lựa chọn cho việc gắn kết kháng nguyên hoặc phát triển bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột với việc tạo dòng ở thời gian trễ hơn Tạo dòng bằng “ pha loãng có giới hạn” ở thời điểm đảm bảo phần lớn mỗi giếng chứa tối đa một dòng đơn Phần lớn các đánh giá là cần thiết ở giai đoạn này lựa chọn tế bào lai hybridoma có khả năng phát triển chống lại tất cả các tế bào dung hợp không thành công nhờ vào sự thưa thớt hoặc không phù hợp trong nuôi cấy in vitro ở nồng độ pha loãng cao Trong một vài trường hợp, kháng thể tiết ra độc tố để những tế bào yếu ớt được duy trì trong môi trường in vitro Việc tối ưu hóa phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột ở giai đoạn này có thể cứu vãn tế bào Ngoài ra , nó cũng trải qua nhiều giai đoạn ngắn của quá trình phát triển bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột sản xuất dòng tế bào trễ hơn in vitro và những giai đoạn của phương pháp in vivo chứng tỏ sức mạnh được gia tăng (enhanced hardiness) và tối ưu sự sản xuất kháng thể (Ishaque and Al-

Rubeai 1998) Theo nguyên tắc đã đề ra đã công bố đến các cộng sự nghiên cứu trong việc sử dụng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột trong những cách đó (Jackson anh Fox 1995)

Việc lựa chọn môi trường phát triển có chứa chất ức chế aminopterin, là trở ngại trong con đường tổng hợp nhân tạo Vì vậy, những tế bào phải sử dụng con đường vòng để tổng hợp acid nucleic, một con đường mà có khuyết điểm trong dòng tế bào ung thư tủy xương để những tế bào sản xuất kháng thể đơn dòng bình thường là dung hợp

Bởi vì cả tế bào ung thư tủy xương myeloma và tế bào sản xuất kháng thể đều sẽ không phát triển một mình, chỉ có tế bào lai là có thể phát triển

Sơ đồ quy trình tạo tế bào lai hybridoma

C.II.2/ Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro:

Một thuận lợi chính trong việc sử dụng kháng thể đơn dòng hơn là huyết thanh miễn dịch đa dòng là những tiềm năng sẵn có gồm: hầu hết số lượng lớn các kháng thể đơn dòng đặc hiệu đối với một epitope riêng biệt (một phần của phân tử antigen mà có nhiệm vụ tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể) Thông thường, kháng thể đơn dòng được tìm thấy trong môi trường phát triển của nuôi cấy tế bào lai hybridoma bằng phương pháp in vitro hoặc trong dịch tràn ổ bụng từ chuột được tiêm tế bào lai hybridoma Kháng thể đơn dòng có thể được làm tinh khiết từ cả hai nguồn trên nhưng thường sử dụng trong môi trường hoặc trong dịch tràn ổ bụng Trong phương pháp in vitro nên sử dụng cho mục đích sản xuất kháng thể đơn dòng khi việc này là có lý do và thiết thực Nhiều dụng cụ sẵn

có trên thị trường làm phát triển cho sự nuôi cấy in vitro Những dụng cụ này cần thiết phải thay đổi để tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt động của chúng, một số lượng những người trực tiếp sử dụng máy cần thiết phải được đào tạo, sự phức tạp trong quy trình hoạt động, nồng độ cuối cùng của kháng thể đạt được, chi phí, sự điều tiết thể tích dịch Chi phí của trang thiết bị nên được xem xét trong giá thành của phương pháp sản xuất in vitro

Mỗi dòng tế bào lai hybridoma phản ứng khác nhau đối với môi trường sản xuất in vitro Trong phần này mô tả phương pháp sản xuất in vitro có sẵn và thảo luận về lợi ích và sự hạn chế của mỗi phương pháp

Sơ đồ tóm tắt các bước trong sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro:

C.II.2.1/Phương pháp nuôi cấy khối mô:

Phương pháp đơn giản nhất để tiếp cận sản xuất kháng thể đơn dòng bằng

phương pháp in vitro là gia tăng nuôi cấy tế bào lai hybridoma thành những khối

và làm sạch kháng thể đơn dòng từ môi trường nuôi cấy Huyết thanh của bò cái

đang mang thai đươc sử dụng trong hầu hết môi trường nuôi cấy mô và có chứa

khoảng 50 µg/ml globulin miễn dịch của bò Việc sử dụng huyết thanh trong môi

trường nuôi cấy tế bào lai hybridoma có thể giải thích cho một lượng lớn globulin

miễn dịch hiện diện trong dịch nuôi cấy (Darby and cộng tác viên 1993) Để tránh

sự gây bẩn với globulin miễn dịch của bò, một vài công ty đã phát triển công thức

môi trường không có huyết thanh để làm nguồn phát triển của dòng tế bào lai

hybridoma (Federspiel và cộng tác viên 1991, Tarleton và Beyer 1991, Velez và

cộng tác viên 1986) Trong hầu hết các trường hợp, tế bào lai hybridoma phát triển

trong 10% huyết thanh thai bê (FCS) có thể thích nghi trong khooảng thời gian bốn giai đoạn ( 8-12 ngày) để phát triển trong ít hơn 1% FCS hoặc trong môi trường

không có FCS Tuy nhiên, sự thích nghi này có thể kéo dài hơn và trong 3-5%

trường hợp tế bào lai hybrydoma sẽ không bao giờ thích nghi với môi trường FCS

thấp Sau khi thích nghi, việc nuôi cấy tế bào cho phép nuôi theo thông thường, sử

dụng bình thót cổ nuôi cấy mô dưới điều kiện phát triển chuẩn khoảng 10 ngày