BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG pdf

PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau : Bước 1: Biến tính Denature Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

[\

BÀI BÁO CÁO

Chủ đề 27:

CÂY SINH DÒNG VIRUS PRRS

Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện: TS.NGUYỄN NGỌC HẢI LUYỆN THỊ NGÂN

Lớp: DH06SH

MSSV: 06126089

Thành phố Hồ Chí Minh

I.Đặt vấn đề:

-PRRSV (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) gây

hội chứng rối loạn sinh sản ở heo hay còn gọi là bệnh heo tai xanh, gây

thiệt hại nghiêm trọng cho nền kinh tế ở các nước trên thế giới Hiện nay

đã có vaccine, tuy nhiên các vaccine này không có khả năng bảo hộ cho

heo Người ta phát hiện thấy virus PRRS có sự đột biến cao, tạo ra nhiều

chủng có độc lực khác nhau, rất khó để kiểm soát dịch bệnh Do đó, để

hiểu rõ về các chủng virus PRRSV, người ta xây dựng cây sinh dòng cho

virus này,nó cần thiết cho việc xác định nguồn gốc, lan truyền và tiến hóa

của virus PRRS

II Tổng quan

II.1.Giới thiệu về virus PRRS

II.1.1 Lịch sử phát hiện virus PRRS

Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở heo do virus thuộc nhóm

Arterividae có khả năng xâm nhiễm vào đại thực bào vào mô

-Năm 1987 bệnh được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ

, vào thời điểm đó, do chưa xác định được căn nguyên

bệnh nên được gọi là “bệnh bí hiểm ở lợn” (MDS)

Khi bị virus phá hủy, đại thực bào không còn các

"chân giả", mất khả năng bắt giữ và tiêu diệt tác nhân gây bệnh (Nguồn Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH)

Các đại thực bào với các "chân giả" có tác

dụng bắt giữ các tác nhân gây bệnh và như

vi khuẩn, virus tiêu diệt chúng (Nguồn

Boehringer Ingelheim

Vetmedica GmbH)

-Tháng 1 năm 1991 ở Tây Ban Nha phát hiện trường hợp lâm sàng đầu tiên trên đàn heo nhập khẩu Ở Hà Lan bệnh cũng được báo cáo

-Tháng 3 năm 1991 ở Bỉ cũng xuất hiện bệnh

-Tháng 5 năm 1991ở An ghi nhận những trường hợp đầu tiên

-Tháng 10 năm 1991 ở Pháp, những trận dịch đầu tiên xảy ra ở

Britany

-Tháng 3 năm 1992 ở Đan Mạch dịch bệnh xuất hiện

- Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St Paul, Minnesota đã nhất trí dùng tên PRRS và đã được Tổ chức Thú y Thế giới công nhận

-Collin và cộng tác viên (1992) là người đầu tiên xác định căn nguyên của PRRS, ông đã gây được bệnh thực nghiệm bằng cách gây nhiễm trên heo qua đường hô hấp từ các mẫu mô heo bệnh tại địa phương

-Khoảng một năm sau đó, Viện Nghiên cứu Thú Y Trung ương tại Lelystad (Hà Lan) đã phân lập được virus từ đại thực bào phế nang của heo bệnh và gọi đó là virus Lelystad (LV)

-Không lâu sau đó, những nhà nghiên cứu của Mỹ cũng phân lập được virus liên quan đến bệnh này đặt tên VR-2332 Họ cũng phân biệt được sự khác nhau giữa LV và VR-2332 về mặt kiểu gen và kiểu hình Bên cạnh

sự khác biệt quan trọng giữa LV và VR-2332 thì những chủng virus Bắc

Mỹ trên cùng đàn heo và cùng thời điểm cũng có sự khác nhau

-Năm 1994 PRRSV được chính thức phát hiện ở 16 quốc gia thuộc Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Á

-Năm 1997 Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ -Tháng 9 năm 2006 Trung Quốc đã xảy ra đại dịch PRRSV, trên 2 triệu heo mắc bệnh, hơn 400000 heo chết Người ta xác định có sự biến chủng của PRRSV thành chủng độc lực cao, lây lan và gây chết rất nhanh trên heo

II.1.2 Kích thước và hình thái học virus PRRS

-Những nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng, virus PRRS có quan hệ gần về mặt sinh vật học, về cấu trúc, về gen với virus gây viêm động mạch ngựa (equine arteritis virus-EVN ) , virus gây tăng enzyme khử hydro của lactate ( lactate dehydrogenase elevating virus-LDV) ở chuột và virus gây sốt xuất huyết ở khỉ (simian hemorrhagic fever virus-SHFV) Theo nguyên tắc dựa trên những đặc tính chung này , virus PRRS, EVA

và SHFV được xếp chung cùng một nhóm mới thuộc chi Arterivirus , họ

Arrterividae , bộ Nidovirales

-Virus PRRS có vỏ bọc với đường kính 50-60 nm, bề mặt khá nhẵn và

có lõi nucleocapsid hình khối với đường kính 25-35 nm

Hình 1: Hình bộ gen của PRRSV

II.1.3 Tổ chức gen virus PRRS

-Bộ gen của vius PRRS tương tự với những Arterivirus khác Virion

chứa acid nhân RNA 15.1kb, dạng thẳng, một sợi, poly adeny (PolA) ở đầu dương

-Bộ gen chứa tám vùng đọc mở mã hóa cho những protein đặc hiệu của virus ORF1a và ORF1b chiếm 12kb Ở đầu 5’ của gen mã hóa cho protein liên quan đến việc mã hóa RNA và dịch mã, bao gồm RNA

polymerase phụ thuộc RNA, còn lại 3,5kb nằm ở đầu 3’ của bộ gen chứa ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7 được mã hóa cho những protein cấu trúc của virus

GP : protein của màng (glycoprotein)

M : protein gian màng (a membrane-spaining protein)

N : protein của capsid (nucleocapsid protein)

E : protein của vỏ ngoài

Hình 2: Mô hình các protein cấu trúc của PRRSV

II.2 Nguyên lý chung của phương pháp PCR

PCR là phương pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA trong ống nghiệm Đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra hàng triệu đoạn DNA đồng nhất

từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysacharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền Người ta còn gọi đó

là kỹ thuật tạo dòng DNA invitro Ngày nay PCR được dùng rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực về sinh học

PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau :

Bước 1: Biến tính (Denature)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 - 95o C) trong vòng

30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách hoàn toàn thành

2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới

Bước 2: Bắt cặp (Annealing)

Phản ứng của primer tác động lên dây nền, các primer này gắn vào đầu

dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template để có phân tử

DNA mới

Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp đến mức cho phép các primer

bắt cặp được với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 – 70oC,

kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng

chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng

Bước 3: Kéo dài (Extension)

Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ - 3’ của 2

primer nhờ hoạt động của polymerase Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp

cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này tùy

thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây

đến vài phút

Hình 3: Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR

Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gen quan tâm bằng primer chuyên biệt kết hợp với hoạt động của enzym chịu

nhiệt polymerase như Taq DNA polymerase trong một chu trình nhiệt hợp

lý Tác động của primer được xem như yếu tố đánh dấu cho hoạt động của

polymerase khi nó được gắn kết vào DNA mạch đơn làm khuôn trong giai

đoạn bắt cặp Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’ - 5’ còn được gọi

là forward primer, kí hiệu là F Primer bên phải tác động trên dây 5’ - 3’ còn được gọi là reverse primer, kí hiệu là R Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động, theo 3 trình tự đã nói ở trên Tóm lại, khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ

được khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase

II.3 Nguyên lý chung của phương pháp RT-PCR

Về nguyên lý, kỹ thuật RT-PCR cũng giống như kỹ thuật PCR thông thường nhưng nhằm mục đích khuếch đại đoạn gen từ khuôn RNA thay vì DNA Trong kỹ thuật này có hai giai đoạn khuếch đại được thực hiện: giai đoạn đầu là quá trình tổng hợp đoạn cDNA từ khuôn mẫu sợi RNA và giai đoạn sau là quá trình tổng hợp DNA từ khuôn mẫu sợi cDNA vừa được tổng hợp

Khác với kỹ thuật PCR chỉ sử dụng một enzym tổng hợp chuỗi oligonucleotide, trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của hai loại enzym tổng hợp chuỗi oligonucleotide: enzym phiên mã ngược và enzym tổng hợp chuỗi oligonucleotide Do enzym reverse transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã ngược đẻ tổng hợp cDNA thường phải thực hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-45 oC)

II.4.Nguyên lý chung của phương pháp nested PCR

Kỹ thuật nPCR được phát triển nhằm mục đích gia tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR Trong kỹ thuật này, có hai cặp primer khác nhau được sử dụng nhưng chỉ để nhằm khuếch đại đặc hiệu một đoạn gen

và phản ứng PCR phải thực hiện hai lần Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện trong 15-30 chu kỳ, với cặp mồi thứ nhất Cặp mồi thứ nhất, ở lần chạy PCR thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định và đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại lần 1 Sản phẩm của PCR lấn 1, sau đó sẽ là mẫu cho PCR lần 2 Cặp mồi thứ hai sẽ bắt cặp phía trong (nested) của sản phẩm PCR lần 1 Phản ứng PCR lần 2 sau đó sẽ khuếch đại đoạn gen cần xác định

Hình 4: Nguyên tắc cơ bản của phản ứng nested PCR

II.5 Nguyên lý cơ bản của phương pháp RT-nPCR một

ống

Sử dụng một film bằng plastic, nó cho phép phiên mã ngược và nested

PCR trong một ống duy nhất hỗn hợp phản ứng cho phăn ứng khuếch đại

PCR lần hai được cách ly trong cái nắp của ống phăn ứng trong suốt chu

kỳ khuếch đại đầu tiên bằng bộ phận một film bằng plastic và sau đó

được đưa vào trong phản ứng PCR từ chu kỳ phản ứng đầu tiên băng ly

tâm không mở nắp phản ứng Thuận lợi chủ yếu của phương pháp là độ

nhạy cao, độ chuyên biệt cao, đơn giản, hiệu quả, nguy cơ tạp nhiễm thấp

và dễ dàng trong việc thiết lập điều kiện nested PCR Phương pháp này

thích hợp cho việc phát hiện các mục tiêu

III Phương pháp tiến hành:

III.1.Ly trích RNA

-RNA được ly trích từ 250 µl huyết thanh hoặc từ 20-50 mg mô, sử

dụng kit ‘ Total RNA Prep Plus’

Sau khi ly trích, RNA được tách rửa với 100 µl nước không Rnase

-Toàn bộ RNA được sử dụng làm khuôn trong phản ứng RT-nPCR

một ống đặc biệt cho ORF5 của EU-PRRSV

III.2.Thực hiện phản ứng RT-nPCR của ORF5

Bước 1:

5 µl trehalose 22 % được sử dụng để bảo quản và duy trì hỗn hợp bên

dưới trong dung dịch của các ống Eppendorf 0.2 ml: 20pmol cho mỗi mồi

trong (inners)

ORF5F(5'ATGAGATGTTCTCACAAATTGGGGCG3') và ORF5R(5'CTAGGCCTCCCATTGCTCAGCCGAAGT3') (Suarez et al.,

1996 )

1 µl dNTPs (10 mM)

.25 µl Taq Polymerase (1·25 U, Fermentas, Vilnius, Lithuania)

-Để bảo quản thì các ống được sấy khô khoảng 2h nhiệt độ phòng

Bước 2

-Tiến hành phản ứng RT-PCR trong đáy ống chứa chất được làm khô,

sử dụng chất phản ứng được xử lý trehalose trong nắp ống Eppendorf Sự

khuếch đại được thực hiện trong 50 µl thể tích có chứa:

5 µl RNA và những chất phản ứng sau:

III.3.Thực hiện phản ứng RT-nPCR của ORF7

-Từ RNA chọn lọc, ORF7 cũng được khuếch đại

5 µl RNA trộn với 8.25 µl nước, 4 µl của 5X MMLV RT buffer, 1 µl dNTPs( 10mM mỗi loại), 0.5 µl MMLV, 0.25 µl Rnasin và 1 µl

hexanucleotide ngẫu nhiên(100ng)

-Dầu khoáng được thêm vào để hoạt động như một vật cản hơi nước

-Để tiến hành phiên mã ngược, hỗn hợp được ủ ở 370 C trong 10 phút

-5 µl cDNA tổng số được khuếch đại bằng phản ứng RT-PCR trong

thể tích 50 µl : 28.8 µl nước, 10 µl 5x dung dịch đệm phản ứng Taq

polymerase, 5 µl 25 mM MgCl2, 4 µl dNTPs, 1 U Taq Polymerase

(Fermentas) và 20 pmol của mỗi primer:

5' GCCCCTGCCCAICACG 3' và

5' TCGCCCTAATTGAATAGGTGA 3' (Oleksiewicz et al., 1998)

-Chu trình nhiệt được thực hiện trong 35 chu kì với chu trình nhiệt sau:

94 oC trong 15 giây

52oC trong 30 giây

72 oC trong 30 giây

-Một bước kéo dài ở 72 oC trong 10 phút hoàn thành quá trình

khuếch đại Kích thước mong chờ của ORF7 khuếch đại là 637 bp

III.4.Phân tích trình tự nucleotide

Để giải trình tự,những sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agar

1.5% Sau đó nhuộm ethidium bromide và khử muối trong nước siêu

lọc(ultafiltered water)

- Kích thước băng mong muốn được cắt bỏ từ gel, sử dụng dụng cụ

máy lọc quay tròn 0.45 µm Ultrafree-MC để phục hồi DNA, những sản

phẩm PCR tinh sạch đươc giải trình tự bằng kit BigDye Terminator Cycle

Sequencing và một máy giải trình tự ABI310

-Trình tự từ hai sợi ORF5 của sản phẩm PCR được xác định với những

mồi giống như mồi dùng cho phản ứng khuếch đại nestedPCR

-Trình tự ORF7 được xác định bằng mồi R133(5'

TCGCCCTAATTGAATAGGTGACTC 3') và F132 (5'

GTGCTGGGCGGCAAACGAGCTGGT 3'),(Drew et al.1997 )

Những trình tự được tập hợp bằng việc sử dụng SeqMan (Lasergene

program package DNASTAR Inc) Phản ứng RT-nPCR và chiến lược giải

trình tự được mô tả ở trên đã cho phép việc xác định một phần trình tự

ORF5 (432 nucleotid tương ứng từ vị trí 97-528 của ORF5) và toàn bộ

trình tự ORF7 Tất cả những trình tự được ghi nhận trong nghiên cứu này

được đưa vào ngân hàng gen

Table 1 Sequence summary

-CLUSTAL X được dùng để sắp xếp trình tự và tỉ lệ đồng hóa/dị hóa được ước lượng với TREE-PUZZLE 5.0(tỉ lệ biểu diễn sự biến đổi qua lại giữa các nucleotide trong trình tự) Những tỉ lệ này được sử dụng để đưa vào chương trình DNADIST của gói (package) PHYLIP để thành lập khoảng cách di truyền, nó là một sự ước lượng cho số lượng nucleotide thay thế cho mỗi vị trí, giữa cặp trình tự Những sự tính toán DNADIST được dựa vào mô hình thay thế F48, đồng hóa và dị hoá xuất hiện những

tỉ lệ khác nhau Dựa vào khoảng cách chất nền (matrix), cây sinh dòng được xây dựng phù hợp với phương pháp Fitch-Margoliash, dùng chương trình DNADIST của gói PHYLIP.Độ tin cậy của việc lấy mẫu được thực hiện trong 100 bản sao bộ dữ liệu để đánh giá những giới hạn tin cậy của

mô hình nhánh

IV Kết quả

IV.1.Cơ sở địa lý cho sự đa dạng của PRRSV ở Châu

Âu

-Tổng số 22 trình tự ORF5 không hoàn chỉnh đại diện cho dòng

PRRSV gây bệnh đã được xác định: 15 từ Ba Lan, 2 từ Đức, 1 từ Anh và

4 từ Lithuania Hơn nữa, hiện nay hai vaccin nhược độc chủng Châu Âu

có thể được dùng , Porcilis PRRS (Porcilis PRRS > 86-98%,) và

Pyrsvac-183 đã được giải trình tự Dựa vào 24 trình tự mới ORF5, và những trình

tự ORF5 chủng Châu Âu được chọn lọc có sẵn trong ngân hàng gen, một cây sinh dòng được xây dựng Cây sinh dòng cho thấy một nhóm kín của những trình tự từ Netherland, Anh, Pháp và Belgium gần trình tự ORF5 Lelystad nguyên thủy Nó đại diện một dòng của Hà Lan phân lập từ năm

1991 Tất cả những trình tự trong nhóm kín giống Lelystad (Lelystad-like) thì có thể từ năm 1991-1992 Một vài nhóm nhỏ khác trong cây sinh dòng

có thể được giải thích bởi dịch tể học:

Ví dụ: PL9 và PL11 từ những nông trại có sự trao đổi những con heo LT2 và LT4 từ hai nông trại gần nhau về mặt địa lý

PL2,PL7 và PL15 từ một nông trại nhưng khác biệt về thời gian

-Một vài nhóm không có sự giải thích rõ ràng về mặt địa lý cũng

không về mặt thời gian cũng như về mặt dịch tễ học

Ví dụ: nhóm có chứa ES1 (Tây Ban Nha, 1992) và PL12 (Ba Lan, 2000)

Fig 5:Phylogenetic tree of EU-type ORF5 sequences The tree was made with the FITCH program of the PHYLIP package

-Những trình tự từ Tây Ban Nha, nhưng nhất là Đan Mạch, Cộng Hòa Czech và Ý thì khá khác biệt từ nhóm kín giống Lelystad, như đã được ghi nhận trước đây Bởi vì một vài trình tự củaTây Ban Nha, và hơn nữa trình tự đơn của Đan Mạch và của Ý đã thu được trong năm 1991-1992, điều này đã chỉ ra rằng những nước khác nhau có thể chứa những chủng PRRS khá khác nhau tại mọi thời điểm Tuy nhiên, việc xác định những