TIỂU LUẬN:CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO (INFECTIUOS BURSAL DISEASE) BẰNG KỸ THUẬT GEN                                        docx

Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỚP DH06SH

SERMINA

CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO

(INFECTIUOS BURSAL DISEASE)

BẰNG KỸ THUẬT GEN

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TS Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Thu Thanh

MSSV: 06126133

10/2009

I MỤC LỤC

II ĐẶT VẤN ĐỀ 3

III TỔNG QUAN……… 4

III.1 Virus Gumboro (IBDV)……… 7

III.2 Bệnh Gumboro………7

III.2.1 Sơ lược về túi Fabricius………8

III.2.2 Lịch sử phát hiện……… 9

III.2.3 Cơ chế……… 9

III.2.4 Triệu chứng……… 11

III.2.5 Bệnh tích……….11

III.3 Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro………14

III.3.1 RT-PCR……… 14

III.3.2 RFLP……… 17

IV KẾT LUẬN……… 20

V TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 20

II ĐẶT VẤN ĐỀ

Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức

độ phân tử Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với các ngành khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này

Kỹ thuật gen ngày càng có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và y học bảo vệ sức khoẻ con người Nguyên lí kỹ thuật gen và các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong công nghệ sinh học phân tử là những kiến thức cần thiết cho các nhà sinh học và kỹ sư công nghệ sinh học Các thành tựu nghiên cứu bộ gen người, bộ gen cây lúa, và nhân bản động vật … đã mở ra một thời kỳ mới trong sinh học, giúp con người hiểu biết rõ bản chất của nhiều loại bệnh di truyền, bệnh truyền nhiễm, chẩn đoán bệnh sớm, góp phần điều trị có hiệu quả và bảo vệ sức khoẻ con người cũng như gia súc và gia cầm

Kỹ thuật gen đã được áp dụng nhiều trong chẩn đoán virus, cho phép xác định kết quả chỉ trong vòng 24 giờ Những phương pháp chẩn đoán này

có những ưu điểm cơ bản như: nhanh chóng, đơn giản, nhạy, chính xác và chi phí thấp…

Hiện nay, việc chăn nuôi gia cầm ở nước ta đang gặp nhiều khó khăn Nguyên nhân là do có nhiều dịch bệnh xuất hiện trên gia cầm gây thiệt hại nặng nề cho nhà chăn nuôi như H5N1, bệnh Gumboro…

Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật gen vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh trên gia cầm hiện nay là một tất yếu

III TỔNG QUAN III.1 Virus Gumboro (IBDV)

Virus Gumboro hay còn gọi là Infectious Bursal Disease Virus

(IBDV)

IBDV có dạng hình khối, nhiều góc cạnh, kích thước: 55-65 nm, phân

tử khối: 2.106 Dalton (Nick, 1976)

IBDV là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài

IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2

đoạn riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et

al., 2000) Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid) Lớp capsid này được hợp

thành bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái) Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral ProteinVP)

IBDV genome chứa hai mạch, A và B Mạch B (2.9kb) mã hóa cho

VP1 (VP1: 95kDa), người ta vẫn cho nó là một enzyme RNA polimerase

phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991;

Macreadie & Azad, 1993; Spies et al., 1987) Polipeptide này hiện diện dưới

dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào chủ (virion), mang bản chất của một protein

tự do và của một protein liên kết genome (còn được gọi là VPg) VPg được

cố định vào đuôi 5’ của sợi dương của 2 mạch trong genome (Dobos, 1993;

Spies & Muller, 1990) Mạch A lớn hơn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở

thành phần (overlapping open reading frame-ORF) ORF nhỏ sẽ mã hóa cho

protein không cấu trúc VP5, không cần thiết cho quá trình sao chép virus in

vitro nhưng lại quan trọng đối với khả năng gây bệnh của virus (Mundt et

al., 1997; Yao et al., 1998) ORF lớn hơn mã hóa cho 1 polyprotein 110

kDa, tự xúc tác phân cắt hình thành 3 loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3

(32 kDa) và VP4 (28 kDa) VP4, một loại enzyme protease phân cắt

serine-lysine (Birghan et al., 2000), nó còn tham gia quá trình tự tách RNA dư thừa

(Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez, 1999) pVP2 sẽ được tách thêm

những RNA dư thừa tại những Carbon cuối cùng để trở thành VP2 (40 kDa)

(Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000) VP2 và VP3 là những protein cấu

trúc Trong đó, VP2 chứa những vị trí kháng nguyên quan trọng và hệ thống

đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993)

Về miễn dịch: IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, nhưng chỉ có

loại serotype 1 mới có khả năng gây bệnh trên gia cầm

Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà Có ít nhất khoảng 6 loại kháng nguyên phụ của serotype 1 được xác định bằng các thử nghiệm trung hòa trong ống nghiệm Những virus thuộc một trong những loại kháng nguyên phụ này thường được biết dưới dạng những biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong trên gà từ 60-100% Có sự khác nhau về kháng nguyên giữa các chủng cổ điển và biến thể Miễn dịch chéo giữa những biến chủng rất nhỏ (Mc Ferran và Cs 1980)

Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây Về phương diện miễn dịch, giữa hai serotype không có khả năng miễn dịch chéo với nhau Tuy nhiên gà và gà tây có thể bị nhiễm các chủng virus của nhau mà không phát bệnh

Sức đề kháng:

IBDV có sức đề kháng cao với các tác nhân lý, hóa và môi trường Chịu đựng được pH từ 2-12 (Benton và cs, 1967) Ở 56oC, IBDV tồn tại trong 5h, ở 70oC thì bị tiêu diệt sau 30 phút, ở -50oC trong 18 tháng độc lực không suy giảm (Landgraf và cs, 1967)

Trong chất thải, phân, nước tiểu, IBDV vẫn giữ nguyên tính gây nhiễm và gây bệnh trong vòng ít nhất là 52 ngày

IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform Trong phenol 0.5%

và timerosal 1.125% ở 50oC trong 1h, formalin 0.5% trong 6h, chloramin 0.5% trong 10 phút Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng độ cao, có thể diệt được IBDV

Chất chứa mầm bệnh: thận và túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus nhất

Ngoài ra, trong các chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng cũng chứa virus

Đường xâm nhiễm: trong tự nhiên, lây truyền qua đường tiêu hóa là

phổ biến nhất, việc lây nhiễm qua không khí ít quan trọng Trong phòng thí nghiệm, có thể dùng đường mũi và mắt

III.2.1 Sơ lược về túi Fabricius

Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho, nằm gần hậu môn Trong quá trình phát triển của bào thai, nó xuất hiện sau tuyến ức và giống như tuyến

ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô

Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho trung ương, quá trình biệt hóa trong túi diễn ra không bị ảnh hưởng bởi kích thích kháng nguyên từ bên

material over glands

Chia túi ra thành các đơn vị cấu trúc gọi là các nang (Foliculum) Mỗi nang gồm có một vùng vỏ giàu lympho bào và một vùng tủy ít tế bào hơn nhưng có chứa tương bào

Đây còn là nơi biệt hóa dòng lympho B

III.2.2 Lịch sử phát hiện

Năm 1962, Cosgrove đã phát hiện và mô tả một bệnh mới, xuất hiện ở thành phố Gumboro, vùng Dalaware ở Hoa Kỳ Bệnh thường thấy trên gà

con với bệnh tích thường gặp chủ yếu ở thận và túi Fabricius

Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh là biến thể của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) vì bệnh tích ở thận tương đối giống nhau

Sau này, Winterfield và Hitchner đã chứng minh rằng những con gà

đã miễn dịch với IB rồi vẫn nhiễm bệnh viêm túi Fabricius

Cuối năm 1962, Winterfield đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh tích ở túi Fabricius và thận)

Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được công bố

Năm 1987, sự nguy hiểm của IBDV lần đầu tiên được công bố tại Belgium và The Netherlands

Năm 1970, Hitchner đề nghị tên chính thức cho bệnh này là Infectious Bursal Disease (IBD) hay còn gọi là Gumboro Virus gây bệnh là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV)

III.2.3 Cơ chế

IBDV tấn công chủ yếu vào mô lympho Tế bào lympho B của túi Fabricius bị phá hủy Tế bào lympho T của tuyến Thymus bị tổn thương Sau 2 ngày xâm nhập vào cơ thể, thấy xuất hiện những biến đổi viêm túi Fabricius Đặc biệt đến ngày 3-4 ở túi Fabricius, thấy xung huyết, xuất huyết, phù thủng và sự thâm nhiễm của các tế bào viêm đạt ở độ cực đại Cùng với sự phóng virus, thân nhiệt cũng tăng đột ngột; sau đó, gây hoại tử tiến triển ở các nang (Foliculu) của túi, phá hủy tất cả các mô lympho và cuối cùng sau 5-7 ngày túi teo nhanh Những thay đổi suy thoái phát triển ở

những nơi tế bào lympho B hay tụ tập

III.2.4 Triệu chứng

Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày

- Sau khi nhiễm bệnh gà biểu hiện triệu chứng đầu tiên là cắn mổ vào hậu môn của nhau, giảm ăn, lông xù, lờ đờ, đi run rẩy, giảm cân, phân tiêu chảy màu trắng, loãng còn nhiều chất nhầy sau đó chuyển sang màu nâu, phân dính đầy xung quanh hậu môn

Hình 3.1: Gà bệnh nằm ủ rũ, xù lông

Hình 3.2: Gà bệnh tiêu chảy phân loãng trắng

III.2.5 Bệnh tích

- Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô

- Cơ đùi, cơ ngực, cơ cánh xuất huyết đỏ thành vệt hoặc thâm đen

- Mổ khám túi Fabricicus sưng to, đỏ, có xuất huyết tấm tấm hoặc cả đám, thận sưng nhạt màu Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề), ruột sưng to có nhiều dịch nhầy bên trong

- Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5,6,7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ 8 thì chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu

Hình 3.3: Túi Fabricius sưng to, đỏ, xuất huyết lấm tấm

Hình 3.4: Cơ đùi xuất huyết thành từng vệt

Hình 3.5: Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề)

III.3 Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro

III.3.1 RT-PCR

Kỹ thuật sinh học phân tử phát triển cho phép ta có thể xác định IBDV một cách nhanh hơn bằng cách phân lập virus Trong số những phương pháp sinh học phân tử thường được sử dụng để phát hiện bộ gene, thì phương pháp RT-PCR được sử dụng khá phổ biến Phương pháp này có thể phát hiện bộ gene IBDV mà không cần phải tăng sinh trong môi trường nuôi cấy trước khi khuyếch đại RT-PCR được tiến hành trong 3 bước:

B1: Ly trích acid nucleic từ mẫu nghiên cứu

B2: thực hiện phiên mã ngược RNA IBDV thành cDNA

B3: khuyếch đại cDNA thu được bằng PCR Chọn những mồi oligonucleotide trình tự ngắn bổ sung với trình tự nucleotide đặc hiệu virus Những vùng khác nhau của bộ gen sẽ được khuyếch đại phụ thuộc vào sự định vị từ những primer được chọn

Sự khuyếch đại gen mã hoá protein vỏ bên ngoài (protein capsid outer)

Ly trích acid nucleic:

Trong khi RNA chuỗi đơn rất dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase, thì

bộ gene RNA IBDV chuỗi đôi (dsRNA) kháng sự phân huỷ bởi enzyme RNase

Trong thực tế, những tế bào nhiễm (dương tính với IBDV) chứa các chủng RNA chuỗi đơn có thể được sử dụng như một mẫu ở bước RT Sự ly trích RNA được tiến hành một cách cẩn thận: sử dụng găng tay, những tác nhân không có RNase và phòng thí nghiệm nhân tạo

RNA IBDV có thể được ly trích từ những mô nhiễm bằng cách sử dụng một vài bộ kit có sẵn Bằng cách khác RNA IBDV có thể được ly trích bằng cách bổ sung 1% SDS (sodium dodecyl sulphate) và 1mg/ml protein K đối với 700 μl dịch huyền phù virus (như dịch đồng nhất bìu) Ủ ấm khoảng

60 phút ở 370C Acid nucleic được thu bằng cách sử dụng protocol chuẩn cho việc ly trích phenol/chloroform ( chú ý: phenol là một chất độc và nên được xử lý và loại bỏ sau đó) Acid nucleic được thu hoạch từ giai đoạn dịch cuối cùng bằng việc kết tủa ethanol và được giữ ở trong nước cất không có RNase hoặc dung dịch đệm bền RNA pha loãng nước nên được giữ lạnh ở nhiệt độ dưới -200C cho đến khi sử dụng

Sự phiên mã ngược ( Reverse transscription)

Sử dụng mồi PCR “lower” ( bổ sung với mạch dương của bộ gen IBDV) có thể tổng hợp cDNA từ cả dsRNA IBDV cũng như từ những RNA chuỗi đơn lấy từ IBDV được lấy từ những tế bào nhiễm

Hỗn hợp RNA IBDV phải được biến tính trước khi chuyển vào hỗn hợp phản ứng RT Thêm 20% (bằng thể tích) dimethylsulphoxide vào dung dịch RNA IBDV giải lạnh Đun nóng khoảng 3 phút ở 920C và làm lạnh trên đá; một phương pháp khác là đun nóng khoảng 5 phút và ủ ấm hỗn hợp tức thì trong nitơ lỏng Chuyển thể tích hỗn hợp biến tính vào trong hỗn hợp phản ứng Ủ ấm theo sự chỉ dẫn của nhà cung cấp enzyme

Dung dịch cDNA thu được sau bước RT nên được giữ lạnh ở < -20oC Việc trì hoãn bước PCR vài tuần sau khi tổng hợp cDNA có thể là nguyên nhân gây ra kết quả PCR âm tính giả

PCR

Enzyme DNA polymerase dùng cho phản ứng PCR nay đã được thương mại hóa Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Cặp mồi U3/L3 được dùng để khuyếch đại gen VP2 thuộc dòng IBDV serotype 1 đã được thiết kế:

5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3'

5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAA-TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3'

Những mồi U3 và L3 là những mồi lai dài 44 nucleotide Chúng bao gồm một đầu tận cùng 3’ đặc hiệu IBDV (ở những chỗ nghiêng trong trình

tự chỉ ở trên) bắt cặp tại vị trí nucleotide 657 đến 676 hoặc 1193 đến 1212 của đoạn IBDV Đầu tận cùng đặc hiệu IBDV được ghép với đầu tận cùng 5’ không đặc hiệu (loại bôi đen trong trình tự ở trên), sản phẩm PCR được tinh sạch từ quá trình khuếch đại với cặp mồi U3/L3 thì thuận lợi cho quá giải trình tự Trong mồi U3 và L3 có những vị trí cắt giới hạn của enzyme endonuclease restriction (gạch dưới trong trình tự ở trên), kết quả sản phẩm PCR này có thể được ứng dụng trong việc tạo dòng Cặp mồi U3/L3 tạo sản phẩm 743 bp chúng đặc hiệu cho trình tự IBDV được khuyếch đại

Sau đó, ta tiến hành bước biến tính lần cuối với 35 chu kỳ (mỗi một chu kỳ gồm một bước biến tính, một bước bắt cặp và một bước kéo dài) Đối

với cặp mồi U3/L3, trong một chu kỳ, biến tính ở 950C/30 giây và bắt cặp ở

640C/ 45 giây(nhiệt độ biến tính được điều chỉnh thích ứng nếu những mồi khác được sử dụng) Những thông số đối với bước kéo dài nên được thiết lập theo lời chỉ dẫn của nhà cung cấp

Sự phát hiện có thể được tiến hành bằng điện di với sản phẩm PCR và marker trọng lượng phân tử DNA trong gel agarose 1% nhuộm với ethidium bromide ( chú ý: EB là độc chất và là tác nhân gây ung thư Nên xử lý và loại bỏ sau đó)

Mỗi phản ứng PCR phải có phản ứng đối chứng âm và dương

Việc trì hoãn PCR khoảng một vài tuần sau bước RT có thể gây ra kết quả PCR âm tính giả

IV.4 RFLP

Những năm gần đây, những kĩ thuật phân tử được sử dụng để kiểm tra những thay đổi di truyền trên IBDV đã tăng nhanh ( Wu và cộng sự,1992; Stram và cộng sự, 1994; Jackwood và Jackwood, 1997; Akin và cộng sự, 1998) Kĩ thuật thông dụng cho định dạng IBDV bao gồm những phương pháp phân tử để khuếch đại những đoạn đặc trưng của bộ gen IBDV bằng RT/PCR tiếp sau đó là bằng RFLP (Dybing và Jackwood, 1996; Jackwood

và Niselsen, 1997; Jackwood và Sommer, 1997; Ture và cộng sự, 1998) Những nghiên cứu phân tích chuỗi nucleotide của VP2 giúp ta có thể phân tích được gen mã hoá cho nhóm kháng nguyên xác định của virus (Schnitzler, 1993) Phân tích RT/PCR-RFLP đã cho thấy nhạy hơn những phương pháp khác bao gồm AC-ELISA Sử dụng RT/PCR và RFLP cho phép ta xác định được những đặc trưng kháng nguyên phụ cũng như cho phép phân lập mầm bệnh khác từ virus vaccine (Lin và cộng sự, 1993; Liu

và cộng sự, 1994; Jackwood và Jackwood, 1994, 1997; Jackwood và Nielsen, 1997)

Những enzyme cắt giới hạn khác nhau đã được sử dụng cho RFLP của IBDV như BstNI hoặc EcoRII, Sty1, DraI, SspI, SacI, SauAI hoặc NboI, StuI HaeIII, TaqI và BspMI, là tất cả hiện nay được sử dụng kết hợp hoặc sử dụng riêng rẽ ( Jackwood và Jackwood, 1997; Jackwood và Neilsen, 1997;