Trong tự nhiên, nấm Linh chi đen mọc trong các rừng già, trên những thân cây khô đã chết, tai nấm của Linh chi đen chỉ phát triển trong một mùa, vì vậy số lượng quần thể nấm Linh chi đen
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) thu mua tại Bảo Lạc (Cao Bằng)
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
Bảng 3.1: Bảng dụng cụ, thiết bị, hóa chất
STT Danh mục vật tư thiết bị
A Dụng cụ Nguồn gốc xuất xứ
1 Bình tam giác Trung Quốc
2 Bình định mức Trung Quốc
6 Đũa thủy tinh Trung Quốc
B Hóa chất Nguồn gốc xuất xứ
1 Cồn thực phẩm Việt Nam
C Thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
2 Cân điện tử Trung Quốc
4 Máy đo UV-VIS Đức
Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
- Thời gian nghiên cứu: Từ 1.1.2021 đến 15.6.2021
Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Linh chi đen
- Xác định độ ẩm nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
- Xác định hàm lượng tro toàn phần
- Định lượng Polysaccharide tổng số sau trích ly bằng phương pháp so màu
Nội dung 2: Nghiên cứu quá trình trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn nồng độ dung môi trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn thời gian xử lý bằng sóng siêu âm tới hiệu quả trích ly Polysaccharie trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ xử lý bằng sóng siêu âm tới hiệu quả trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tới hiệu quả trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn thời gian trích ly tới hiệu quả trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
Nội dung 3: Nghiên cứu tạo sản phẩm trà hòa tan từ dịch chiết Polysaccharide tổng số từ nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu quy trình sản xuất dự kiến trà hòa tan từ nấm Linh chi đen
Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.4.1 Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý
Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Mẫu vật được sấy ở nhiệt độ 105°C nhằm loại bỏ tối đa lượng nước trong nguyên liệu Sau quá trình sấy, độ ẩm của nguyên liệu được xác định dựa trên lượng mẫu còn lại, đảm bảo tính chính xác trong đo lường độ ẩm Phương pháp này giúp kiểm tra chính xác tỷ lệ nước trong mẫu vật để thuận tiện cho các phân tích và nghiên cứu tiếp theo.
Công thức tính: Độ ẩm (w %) được tính theo công thức sau: m1 – m2
Trong đó: m1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g) m2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g) m0: Khối lượng của chén sứ (g)
Thí nghiệm 2: Xác định hàm lượng tro toàn phần
Nguyên tắc chính trong quá trình xác định hàm lượng tro tổng số là sử dụng nhiệt độ từ 550 đến 600°C để nung, đốt cháy hoàn toàn các chất hữu cơ trong mẫu vật Quá trình này đảm bảo chỉ còn lại phần tro không cháy, giúp xác định chính xác hàm lượng tro tổng số Hàm lượng tro tổng số được tính dựa trên khối lượng của chén sứ sau khi nung, phản ánh chính xác lượng tro còn lại trong nguyên liệu Phương pháp này là một tiêu chuẩn quan trọng trong phân tích thành phần hóa học của nguyên liệu, đảm bảo độ chính xác và tính đáng tin cậy của kết quả.
Đầu tiên, nung chén sứ đã được rửa sạch ở nhiệt độ từ 550°C đến 600°C trong lò nung cho đến khi trọng lượng không đổi, sau đó để nguội trong bình hút ẩm và cân chính xác đến 10^-4 g Tiếp theo, lấy khoảng 2g nguyên liệu cho vào chén sứ đã chuẩn bị, cân chính xác rồi đặt vào lò nung ở cùng nhiệt độ để nung trong 6-7 giờ cho đến khi thu được tàn tro trắng Nếu tro còn đen, lấy ra để nguội, rồi thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đặc, tiếp tục nung cho đến khi tro chuyển sang màu trắng, rồi để nguội và cân lại trong bình hút ẩm Quá trình nung lại và cân lặp lại nhiều lần, mỗi lần thêm 30 phút, cho đến khi sự chênh lệch trọng lượng giữa các lần là nhỏ hơn 0,0005g, đảm bảo độ chính xác cao trong phân tích thành phần mẫu.
- Tính kết quả: Hàm lượng tro theo phần trăm tính bằng công thức :
G1 - G Trong đó: X: Hàm lượng tro (%)
G1: Khối lượng chén nung và mẫu (g)
G2: Khối lượng chén nung và tro trắng (g)
Lưu ý quan trọng khi xử lý chén sứ sau khi lấy ra từ lò nung là không nên đóng kín bình hút ẩm ngay lập tức Để tránh nguy cơ nắp bình bị bật hoặc vỡ do khí nóng thoát ra, bạn cần để nắp hé mở hoặc mở lỗ khí ở trên nắp bình hút ẩm Điều này giúp khí nóng trong chén sứ thoát ra từ từ, bảo vệ bình hút ẩm và tránh hiện tượng vỡ nắp không mong muốn.
Thí nghiệm 3: Định lượng Polysaccharide tổng số sau trích ly bằng phương pháp so màu
Polysaccharide được định lượng bằng phương pháp phenol-sunfuric axit, trong đó 400 µl dịch mẫu chứa polysaccharide được trộn với 200 µl dung dịch phenol 5% rồi thêm 1 ml H2SO4 đậm đặc, sau đó để phản ứng diễn ra trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Màu sắc của phản ứng được đo trên máy quang phổ tại bước sóng 490 nm để xác định nồng độ polysaccharide Hàm lượng polysaccharide được tính dựa trên giá trị OD đo được của mẫu thí nghiệm so sánh với đồ thị chuẩn glucose, theo phương pháp Foster D S & cộng sự (1961), giúp đảm bảo độ chính xác trong quá trình phân tích.
Các hóa chất như sau:
3.4.2 Phương pháp phân tích các yếu tố ảnh hưởng tới trích ly Polysaccharide từ nấm Linh chi đen
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi tới hiệu quả trích ly Polysaccharide từ nấm Linh chi đen
Mục đích: Lựa chọn được nồng độ dung môi cho hiệu quả trích ly cao nhất
Nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng ethanol để trích ly tổng số polysaccharide, với quy trình thay đổi nồng độ ethanol từ 60% đến 90% Các yếu tố như khối lượng mẫu, nhiệt độ xử lý siêu âm, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian siêu âm và thời gian trích ly được cố định để đảm bảo tính chính xác của kết quả Thí nghiệm được bố trí theo một sơ đồ rõ ràng, giúp phân tích ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly polysaccharide một cách hiệu quả.
Công thức Yếu tố thay đổi
Nồng độ dung môi Ethanol Yếu tố cố định
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/15 (g/ml)
- Thời gian siêu âm: 6 phút
- Thời gian trích ly: 150 phút
Quy trình chiết trích ly bắt đầu bằng việc lọc qua giấy lọc thô hai lần để loại bỏ tạp chất lớn, sau đó tiếp tục lọc qua giấy lọc tinh một lần để đảm bảo độ trong của dung dịch Mỗi công thức thực hiện quá trình lọc này ba lần nhằm nâng cao độ tinh khiết của dịch chiết Dựa trên hàm lượng polysaccharide tổng thu được, xác định nồng độ dung môi tối ưu để tối đa hóa hiệu quả chiết xuất Quá trình này giúp đảm bảo chất lượng và hiệu quả của dịch chiết, phù hợp với các tiêu chuẩn nghiên cứu.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lí bằng sóng siêu âm tới hiệu quả trích ly Polysaccharide tổng số trong nấm Linh chi đen
Tiến hành khảo sát xử lý sóng siêu âm tại các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8 phút để đánh giá mức độ hiệu quả của quá trình trích ly Nồng độ dung môi được chọn dựa trên kết quả của thí nghiệm 4, trong khi các yếu tố khác như khối lượng mẫu, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ siêu âm và thời gian trích ly được giữ cố định để đảm bảo tính chính xác và nhất quán của nghiên cứu Bố trí thí nghiệm theo bảng đã lập giúp tối ưu hóa quy trình xử lý sóng siêu âm, từ đó nâng cao hiệu suất trích xuất các thành phần mong muốn.
Công thức Thời gian xử lí bằng sóng siêu âm (phút)
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/15 (g/ml)
- Dung môi ethanol: Chọn ở thí nghiệm 4
- Thời gian trích ly: 150 phút
Trích ly dịch qua giấy lọc thô hai lần và qua giấy lọc tinh một lần để đảm bảo sự loại bỏ tạp chất hiệu quả Mỗi công thức được lặp lại ba lần nhằm đảm bảo tính chính xác của quá trình Việc dựa trên hàm lượng Polysaccharide tổng số thu được giúp xác định thời gian xử lý sóng siêu âm tối ưu, nâng cao hiệu quả phân lập polysaccharide.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ xử lí bằng sóng siêu âm tới hiệu quả trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
Chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả tại các mức nhiệt độ 30°C, 40°C, 50°C, và 60°C để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình xử lý Nồng độ dung môi được lựa chọn dựa trên kết quả của thí nghiệm 4 để đảm bảo tối ưu hóa quá trình Thời gian xử lý bằng sóng siêu âm đã được xác định từ các thí nghiệm trước nhằm đạt được hiệu quả cao nhất trong quá trình xử lý.
5 Cố định các yếu tố như khối lượng mẫu, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian trích ly Bố trí thí nghiệm được tiến hành theo bảng dưới đây:
Công thức Nhiệt độ xử lí bằng sóng siêu âm ( o C)
- Tỉ lệ nguyên liệu: 1/15 (g/ml)
- Dung môi ethanol: Chọn ở thí nghiệm 4
- Thời gian siêu âm: Chọn ở thí nghiệm 5
- Thời gian trích ly: 150 phút
Quá trình dịch trích ly được thực hiện bằng cách lọc qua giấy lọc thô hai lần và qua giấy lọc tinh một lần, mỗi bước lặp lại ba lần để đảm bảo độ tinh khiết cao Dựa trên hàm lượng polysaccharide tổng thu được từ các quá trình, xác định nhiệt độ siêu âm tối ưu là bước quan trọng để nâng cao hiệu quả trích ly Việc lựa chọn nhiệt độ siêu âm phù hợp giúp tối ưu hóa lượng polysaccharide thu nhận, nâng cao chất lượng dịch trích và đảm bảo kết quả nghiên cứu chính xác.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu nấm Linh chi đen với dung môi trích ly
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) theo các tỷ lệ 1/10, 1/15 và 1/20 để xác định tỷ lệ tối ưu Nồng độ dung môi được lựa chọn dựa trên kết quả từ thí nghiệm 4, trong khi thời gian và nhiệt độ siêu âm được xác định từ các thí nghiệm 5 và 6 để đảm bảo hiệu quả trích xuất tối ưu Các yếu tố cố định bao gồm khối lượng mẫu và thời gian trích ly nhằm duy trì tính nhất quán và chính xác của quá trình nghiên cứu.
Bố trí thí nghiệm được bố trí theo bảng dưới đây:
Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml)
- Nhiệt độ siêu âm: chọn ở thí nghiệm 6
- Dung môi ethanol: chọn ở thí nghiệm 4
- Thời gian xử lí sóng siêu âm: chọn ở thí nghiệm 5
- Thời gian trích ly: 150 phút
Quá trình chiết xuất dịch trích ly được thực hiện bằng cách lọc qua giấy lọc thô hai lần để loại bỏ tạp chất lớn, sau đó lọc qua giấy lọc tinh một lần nhằm đảm bảo độ tinh khiết cao Mỗi bước lọc đều được lặp lại ba lần để nâng cao hiệu quả loại bỏ tạp chất Dựa trên hàm lượng polysaccharide tổng số thu được sau quá trình lọc, công thức phù hợp nhất sẽ được chọn để tối ưu hóa hoạt tính của dịch trích ly.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu lựa chọn thời gian trích ly Polysaccharide từ nấm Linh chi đen
Nghiên cứu đã tập trung vào việc điều chỉnh thời gian trích ly, từ 60 đến 180 phút, để tối ưu quá trình Trong thí nghiệm này, nồng độ dung môi được xác định dựa trên kết quả của thí nghiệm 4, đảm bảo hiệu quả cao nhất trong việc trích xuất Đồng thời, thời gian và nhiệt độ siêu âm được chọn lựa kỹ lưỡng dựa trên các dữ liệu thu thập từ thí nghiệm 5, nhằm nâng cao năng suất và chất lượng của sản phẩm.
6, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi được chọn ở thí nghiệm 7 và cố định khối lượng mẫu
Bố trí thí nghiệm được tiến hành theo bảng dưới đây:
Yếu tố thay đổi Thời gian trích ly (phút )
- Nhiệt độ siêu âm: chọn ở thí nghiệm 6
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: chọn ở thí nghiệm 7
- Thời gian xử lí sóng siêu âm: chọn ở thí nghiệm 5
- Nồng độ ethanol: chọn ở thí nghiệm 4