(Luận văn tốt nghiệp) nghiên cứu và nhân giống vô tính loài cây lan thạch học tía (dendrobium officinale kimura et migo) tại viện nghiên cứu và phát triển lâm nghiệp, trường đại học nông lâm thái nguyên

Luận văn “Nghiên cứu nhân giống vô tính loài cây lan Thạch hộc tía Dendrobium officinale Kimura et Migo tại Viện nghiên cứu và phát triển lâm nghiệp, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên”

ĐOÀN THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH LOÀI CÂY LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et

Ngành: Lâm học

Mã số ngành: 8.62.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THANH TIẾN

Thái Nguyên - 2021

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu là quá trình điều tra trên thực địa và có tham khảo, kế thừa các tài liệu là hoàn toàn trung thực, nếu có gì sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2021

XÁC NHẬN CỦA GVHD

TS NGUYỄN THANH TIẾN

HỌC VIÊN

Đoàn Thanh Bình

Luận văn “Nghiên cứu nhân giống vô tính loài cây lan Thạch hộc tía

(Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại Viện nghiên cứu và phát triển lâm nghiệp, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên” được hoàn thành theo

chương trình đào tạo Thạc sĩ, khóa 2019 - 2021 tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nghuyên

Đặc biệt, tác giả xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thanh Tiến - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn nhiệt tình, truyền đạt kinh nghiệm quý báu, những ý tưởng trong nghiên cứu khoa học và giúp tác giả hoàn thành luận văn

Mặc dù đã hết sức cố gắng và nỗ lực, nhưng kinh nghiệm nghiên cứu chưa nhiều, đặc biệt là hạn chế về mặt thời gian, tình hình dịch bệnh Covid-19 phức tạp, đi lại khó khó khăn trong quá trình nghiên cứu, nên luận văn chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót nhất định Tác giả rất mong nhận được

sự góp ý của các thầy cô giáo và bạn bè đồng nghiệp để cho luận văn được hoàn chỉnh hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 4

1.1 Cơ sở khoa học của nghiên cứu 4

1.1.1 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

1.1.2 Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.1.3 Các phương pháp nuôi cấy mô 5

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật 6

1.1.5 Các giai đoạn trong nhân giống in vitro 12

1.2 Khái quát vấn đề nghiên cứu 15

1.2.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu 15

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, ĐỊA ĐIỂM VÀ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Đối tượng nghiên cứu 29

3.2 Phạm vi nghiên cứu 29

3.3 Địa điểm thực hiện đề tài 29

3.4 Nội dung nghiên cứu 29

3.5.1 Quan điểm tiếp cận 30

3.5.2 Phương pháp điều tra, đánh giá thực trạng, tiềm năng phát triển và sản xuất giống cây Lan hộc tía 30

3.5.3 Phương pháp nhân giống bằng in vitro loài cây Lan Thạch hộc tía tại Viện NC&PTLN 31

2.5.4 Đánh giá nhu cầu sử dụng cây Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại các tỉnh miền núi phía Bắc 35

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 35

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Điều tra, đánh giá thực trạng, tiềm năng phát triển và sản xuất giống cây Thạch hộc tía tại các tỉnh miền núi phía Bắc 36

4.1.1 Đặc điểm sinh học của cây Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại các tỉnh miền núi phía Bắc 36

4.1.2 Đặc điểm phân bố cây Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại các tỉnh miền núi phía Bắc 39

4.1.3 Thực trạng phát triển của cây Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại các tỉnh phía Bắc 43

4.1.4 Tiềm năng phát triển cây lan Thạch hộc tía tại các tỉnh phía Bắc 46

4.2 Nghiên cứu nhân giống bằng in vitro loài cây Lan Thạch hộc tía tại Viện NC&PTLN 47

4.2.1 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 47

4.2.2 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 49

4.2.3 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 50

4.2.4 Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 52

4.3 Đánh giá nhu cầu sử dụng cây Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại các tỉnh miền núi phía Bắc 55

hiện nay tại các tỉnh điều tra 55

4.6.2 Nhu cầu sử dụng loài cây Thạch hộc tía và dự báo trong tương lai 58

4.4 Đề xuất một số giải pháp nâng cao hiệu quả nhân giống loài cây Lan Thạch hộc tía 59

4.4.1 Lựa chọn cây mẹ 59

4.4.2 Công tác nhân giống in-vitro 59

4.4.3 Điều kiện sinh thái và gây trồng cây lan Thạch hộc tía 60

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

5.1 Kết luận 63

5.2 Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

Bảng 4.1 Bảng tổng hợp sinh trưởng thân cây Lan thạch hộc tía tại các tỉnh

miền núi phía Bắc 37

Bảng 4.2 Bảng tổng hợp hình thái lá của loài Thạch hộc tía tại các tỉnh 38

Bảng 4.3 Đặc điểm phân bố Thạch hộc tía theo tuyến điều tra 40

Bảng 4.4 Phân bố Thạch hộc tía theo tuyến và ô tiêu chuẩn điều tra 40

Bảng 4.5 Kết quả đánh giá khả năng hiểu biết của người dân về cây Thạch hộc tía sử dụng làm dược liệu 44

Bảng 4.6 Thực trạng sản xuất giống cây Thạch hộc tía tại các tỉnh phía Bắc 45 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 47

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 49

Bảng 4.9 Kết quả ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễcây lan Thạch hộc tía (sau 30 ngày) 51

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng ra rễcây lan Thạch hộc tía 53

Hình 4.12 Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 54

Hình 4.13 Biểu đồ biểu thị tổng số rễ và số rễ trung bình trong thí nghiệm chất kích thích sinh trưởng tổ hợp NAA và IBA 54

Hình 2.1 Cây Thạch hộc tía 21

Hình 2.2.Cây Thạch hộc tía tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp 25 Hình 4.1 Hình thái thân của cây Thạch hộc tía 36

Bảng 4.1 Bảng tổng hợp chiều cao cây của Thạch hộc tía 37

tại các tỉnh miền núi phía Bắc 37

Hình 4.2 Hình thái lá cây Thạch hộc tía 38

Bảng 4.2 Bảng tổng hợp hình thái lá của loài Thạch hộc tía tại các tỉnh 38

Hình 4 3 Hình thái hoa cây lan thạc hộc tía 39

Bảng 4.3 Đặc điểm phân bố Thạch hộc tía theo tuyến điều tra 40

Bảng 4.4 Phân bố Thạch hộc tía theo tuyến và ô tiêu chuẩn điều tra 40

Hình 4.4 Một số mẫu Thạch hộc tía thu thập được từ các tỉnh điều tra 41

Bảng 4.5 Kết quả đánh giá khả năng hiểu biết của người dân về cây Thạch hộc tía sử dụng làm dược liệu 44

Bảng 4.6 Thực trạng sản xuất giống cây Thạch hộc tía tại các tỉnh phía Bắc 45 Hình 4.5 Mô hình trồng lan thạch hộc tái tại Hòa Bình 46

Hình 4.6 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 48

Hình 4.7 Biểu đồ biểu thị tổng số rễ và số rễ trung bình trong thí nghiệm chất kích thích sinh trưởng NAA 48

Hình 4.8 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 50

Hình 4.9 Biểu đồ biểu thị tổng số rễ và số rễ trung bình trong thí nghiệm chất kích thích sinh trưởng IBA 50

Hình 4.10 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 51

Hình 4.11 Biểu đồ biểu thị tổng số rễ và số rễ trung bình trong thí nghiệm chất kích thích sinh trưởng IAA 52

Hình 4.12 Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía 54

Hình 4.14 Sản phẩm cây Thạch hộc tía tươi 57

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Việt Nam là quốc gia có tiềm năng phát triển LSNG ở khu vực châu Á, hiện có gần 1,6 triệu ha rừng đặc sản, với tổng sản lượng hàng năm trên 40.000 tấn Trong đó, các nhà khoa học đã phát hiện có hơn 5000 loài cây thuốc, 500 loài cây tinh dầu, 620 loài nấm, 820 loài tảo, 186 loài thực vật đặc hữu chỉ có ở Việt Nam, 823 loài đặc hữu chỉ có ở Đông Dương LSNG Việt Nam đã được xuất khẩu sang gần 90 nước và vùng lãnh thổ, giai đoạn 2005-

2007 giá trị xuất khẩu lâm sản ngoài gỗ đem lại nguồn thu 400-500 triệu USD, bằng gần 20% tổng giá trị xuất khẩu đồ gỗ Khai thác, chế biến LSNG đã thu hút hàng trăm nghìn lao động ở nông thôn, miền núi góp phần đáng kể vào xoá đói, giảm nghèo LSNG có vai trò quan trọng đối với đời sống của đồng bào miền núi Sản phẩm LSNG của Việt Nam đã và đang được nhiều nước trên thế giới quan tâm

Thạch hộc tía phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanmar và nhiều nước nhiệt đới, cận nhiệt đới Ở nước ta cây cây phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền núi Phía bắc như: Hòa Bình, Ninh Bình, Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang, vùng rừng có độ cao 1.000 - 3.400 m so với mực nước biển, thường phụ sinh vào cây gỗ hoặc vách đá có mọc rêu dưới tán rừng Trong điều kiện môi trường tự nhiên độ ẩm 70%, nhiệt độ không khí bình quân năm 12 - 18

độ C, lượng mưa 900 - 1.500 mm, thường tập trung sống ở phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và vách núi đá (Đỗ Tất Lợi, 2001).Điều kiện khí hậu cũng như trình độ sản xuất của người dân Việt Nam rất thích hợp cho trồng Thạch hộc tía Tuy nhiên, việc sản xuất loại dược liệu này vẫn chưa được đầu tư thích đáng khiến cho chúng có nguy cơ tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam (Sách đỏ Việt Nam, 2007)

Thạch hộc tía làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý, giàu polysacarit thạch hộc, alkaloit thạch hộc, polysacarit (22%), hàm lượng các acid amine như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amin Ngoài ra, thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn, bibenzyl, keton, ester và các chất nhầy, hợp chất amidon Trong thân cây thạch hộc tía có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3% Thạch hộc tía vừa là cây làm cảnh vừa là cây làm thuốc quý hiếm, đã có lịch sử làm thuốc cách đây trên 2.000 năm, được ghi trong “Thần nông bản thảo” của Trung Quốc Loài cây này có nguy cơ tuyệt chủng được quốc tế đưa vào Công ước buôn bán quốc tế về động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng (Dược điển Trung Quốc, 2000)

Việc nhân giống và trồng cây thuốc không những đáp ứng nhu cầu sử dụng mà còn góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen các loài quý hiếm, tạo việc làm và tăng thu nhập cho người dân địa phương, tận dụng được đất đai, tăng độ che phủ bảo vệ môi trường Đặc biệt là góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng, giữ gìn những bài thuốc quý và nghề làm thuốc ở địa phương

Thạch hộc tía có tên khoa học là Dendrobium officinale Kimura et Migo,

thuộc họ Lan (Orchidaceae), thường sinh trưởng ở các vách đá, khe đá, hoặc phụ sinh trên cây cổ thụ, ở vùng cao núi đá, nhiệt đới, Á nhiệt đới như Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á, ở độ cao từ 800 – 1000 m Loài này có mặt trong Sách đỏ, là dược liệu quý hiếm được pháp luật bảo hộ nghiêm ngặt Thạch hộc tía hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do nguồn cung cấp

tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán (John et al., 1999) Thạch hộc tía chế biến thành phong đấu, giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.000 USD/kg Ở Đài Loan giá phong đấu từ 1.000-3.000USD/kg Giá phong đấu hảo hạng ở thị trường Trung Quốc khoảng 30 đến 60 triệu

VNĐ/kg Giá 1 cây Thạch hộc tía tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây Thạch hộc tía, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3 năm Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch hộc tía còn rất lớn với giá cao, đem lại siêu lợi nhuận cho những người trồng và chế biến Thạch hộc tía

Như vậy, để bảo tồn và phát triển loài cây này cần thiết phải có những nghiên cứu sâu về chọn giống và nhân giống làm cơ sở đề xuất các giải pháp

phát triển loài cây trên địa bàn Với ý nghĩa đó, tôi thực hiện đề tài: "Nghiên

cứu và nhân giống vô tính loài cây lan thạch học tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại Viện nghiên cứu và phát triển lâm nghiệp, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên" nhằm đưa ra một số giải phát bảo

tồn và phát triển giống Thạch học tía đạt năng suất và hiểu quả kinh tế

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá được hiện trạng, tiềm năng phát triển nguồn gen của cây lan Thạch hộc tía tại Thái Nguyên

- Nghiên cứu phương pháp nhân giống in-vitro loài cây Lan Thạch

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Đề tài thực hiện nhằm đề xuất một số giải pháp bảo tồn và phát triền loài Lan thachj hộc tía cũng như góp phần cải thiện đời sống người dân tham gia trồng lan thạch hộc tía ở các tỉnh miền núi phía Bắc

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở khoa học của nghiên cứu

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô

trùng Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho

việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các

bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ (Nguyễn Quang Thạch, 2009) Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy

mô và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các

phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau Nguyên lý cơ bản của nuôi cấy mô là tính toàn năng của tế bào (Totipotency) Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật Ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời” Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào đều mang toàn

bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ

thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

1.1.1 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật có những ưu điểm sau (Dương Công Kiên, 2006):

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp

từ 1 cây sau khi được nuôi cấy từ 1 – 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây

- Sản phẩm cây đồng nhất: Tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát

từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

- Tiết kiệm không gian: Không phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất truyền thống trên đồng ruộng

- Lợi thế về vận chuyển: Cây con có kích thước nhỏ, vì vậy có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi

- Sản xuất được quanh năm: Qúa trình sản xuất có thể tiến hành vào bất

kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ

1.1.2 Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn

nhiều năng lượng,….nên giá thành sản xuất con giống cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

- Chất lượng cây giống có thể bị biến dị: cây con nuôi cấy có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma

1.1.3 Các phương pháp nuôi cấy mô

Các phương pháp thường được áp dụng phổ biến như sau (Nguyễn Như Khanh, 2011, Vũ Văn vụ, 2009):

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Trong nuôi cấy mô, một phương thức đơn giản và thường hay được sử dụng để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Trên thực tế người

ta thường nuôi cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm Đó có thể đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách, Mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh

- Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý bằng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…) Mẫu cấy ban đầu để tạo mô sẹo có thể lấy từ

cây con vô trùng trong ống nghiệm, rẽ, thân, lá của cây bên ngoài đã được vô trùng Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng như: nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma

- Nuôi cấy bao phấn và túi phấn

Nuôi cấy bao phấn và túi phấn tạo cây đơn bội là sự cảm ứng phát sinh phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bao tư, các hạt phấn non

- Nuôi cấy tế bào đơn

Tế bào đơn có thể ghi nhận bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý bằng enzyme Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau

Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển

và phân hóa của tế bào

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật

* Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…)

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy

Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có

khả năng tiêu diệt vi sinh vật Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu Hiệu quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất Một số hóa chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2-thủy ngân clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…)

* Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng Buồng cấy có hệ thống màng lọc giúp lọc vi sinh vật đồng thời có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu diệt

vi sinh vật trong không khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy Để khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy có thể sử dụng các phương pháp: Khử trùng khô (bằng nhiệt), khử trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánh sáng và nhiệt độ

* Môi trường nuôi cấy

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS (Murashige&Skoog, 1962) , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi trường MS (Murashige&Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm Môi trường Gramborg (1965)

còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần

Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vật liệu nuôi cấy hay loại cây khác nhau cần những thành phần môi trường thích hợp để phù hợp với mục đích việc nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhìn chung, môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các thành phần cơ bản sau:

+ Các khoáng đa lượng

+ Các khoáng vi lượng

+ Nguồn cacbon

+ Các vitamin

+ Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

+ Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; Agar

Khoáng đa lượng

Các khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm tức là 30mg/l Những nguyên tố đó là : N, Fe, P, K, Ca,

Mo Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng

- Nitrogen: Mô, tế bào thực vật có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium và nitrate Tỷ lệ ammonium và nitrat thay đổi tùy theo loại cây và trạng thái phát triển của mô Nitrogen được cung cấp dưới NO3-, NH4+

- Phospho ( P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc màng Ngoài ra khi phosphor ở dạng H2PO4 -

và HPO42- còn có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy

- Kali ( K): K+ là một cation chủ yếu trong cây,giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ Ion K được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai trò chính là điều hòa pH và áp suất môi trường nội bào Sự thiếu hụt

K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ hấp thu photphate Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat (KNO3), kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat (KH2PO4)

- Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào Sự

có mặt của Ca2+ rất quan trong trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm

Sự ổn định 12 của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bỡi ion Ca2+ Sự thiếu hụt Ca2+ sẽ làm tăng quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào Canxi được cung cấp dưới dạng canxi nitrat ( Ca(NO3)2.4H2O) canxi clorua (CaCl2.6H2O)

- Magiê (Mg): Là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng đến quá trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme lien quan trong biến dưỡng cacbonhydrat sự tổng hợp acid nucleic… Ion Mg có tính linh động cao, hầu hết ion Mg2+ đều đc sử dụng cho việc điều hòa pH nội bào và ổn đinh cân bằng anion và cation Nếu thiếu hụt Mg sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp RNA Kết quả là cấu trúc và chức năng của lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi xảy ra thiếu hụt Mg, là yếu tố không thể thiếu trong quá trình trao đổi năng lượng cảu thực vật bỡi vì nó có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ATP

Mg được cung cấp dưới dạng magiê sunphat ( MgSO4.7H2O)

- Sắt (Fe): Nhưng môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl2, FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, Fe(C4H4O6) Hiện nay hầu hết các phòng phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-Ethylene Diamine Tetra Acetate (EDTA) Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng tư từ ra môi trường theo nhu cầu mô thực vật

Khoáng vi lượng

Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng trong môi trường nuôi cấy invitro Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme Chúng được dùng với nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng Các dung dịch vi lượng thường dùng là : Nistch (1951), Heller (1953), Murashige – skoog ( 1962)

Nguồn cacbon

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các mẫu nuôi cấy nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp ở cường độ rất thấp, vì vậy trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung các hợp chất hydratcacbon Nguồn hydratcacbon được

sử dụng phổ biến là đường 13 saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/V) Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol, rất ít dùng

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: Nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009) [11] Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính Auxin và Cytokinin, ngoài ra còn có Gibberlin và Etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan

- Auxin: Auxin được chia thành 2 loại: Auxin tự nhiên và Auxin tổng hợp Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3- acid acetic (IAA)

và Auxin tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxy acetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid (NAA) Hoạt tính của các chất điều tiết sinh trưởng này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4-D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng do đó không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4-D không bị biến tính trong quá trình hấp tiệt trùng Tuy nhiên chất 2,4-D

là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng rất nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm Auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Tùy loại Auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của Auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo (callus) Nồng độ Auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất và đối tượng nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2008)

- Cytokinin: Nhóm chất Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi Tỉ lệ Auxin/Cytokinin quyết định sự phân hóa của mô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo Nồng độ sử dụng là 0,1-2mg/l Ở nồng độ cao, Cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Các Cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin,

2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (Cytokinin tự nhiên) Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá không đắt Zeatin là một loại Cytokinin tự nhiên có hoạt tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt do rất đắt Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một số chất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là một Cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân nhanh cây thân gỗ (Vũ Văn Vụ và cs, 2008)

- Ảnh hưởng giá thể trồng tới sinh trưởng phát triển của cây non ngoài vườn ươm

Trước đây giá thể sử dụng chủ yếu là đất, cát và sỏi Ngày nay giá thể

đã được thay đổi rất nhiều Như ta đã biết cây cần cả oxy và dinh dưỡng tiếp xúc với cây Giá thể lý tưởng là là loại có khả năng giữ nước, tương đương

với độ thoáng khí Khả năng giữ nước và độ giữ nước của giá thể được quyết định bởi những khoảng trống trong nó

Giá thể lý tưởng có các đặc điểm:

- Có khả năng giữ ẩm cũng như độ thoáng khí tốt

1.1.5 Các giai đoạn trong nhân giống in vitro

1.1.5.1 Khử trùng mô nuôi cấy

Là giai đoạn quan trọng, quyết định đến kết quả của quá trình nuôi cấy Mục đích của giai đoạn này là tạo nguồn nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian khử trùng

1.1.5.2 Tái sinh mẫu

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh có định hướng sự phát triển của

mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ các hợp chất điêu hòa sinh trưởng như auxin/cytokinin đưa vào môi trường nuôi cấy cũng như tuổi sinh lý của mẫu

1.1.5.3 Nhân nhanh

Là giai đoạn bao gồm nhiều lần cấy chuyển mô trên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo các cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà

từ đó cây con hoàn chỉnh có thể tái sinh Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ

số nhân cao nhất Để đạt được mục đích nhân nhanh, người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin,

gibberellin…) hoặc các chất hữu cơ (nước dừa, dịch chiết nấm men, …) kết hợp với các yếu tố môi trường (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…)

1.1.5.4 Ra rễ tạo cây Hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển qua môi trường tạo rễ, hình thành cây con hoàn chỉnh, giai đoạn này môi trường nuôi cấy chủ yếu được bổ sung thêm auxin giúp tạo rễ cho cây con Ra cây: Cây con nuôi cấy trong phòng thí nghiệm có đầy đủ các bộ phận (thân, lá, rễ) khỏa mạnh và không bị nhiễm sẽ đưa ra môi trường bên ngoài, trong điều kiện thực tiễn sản xuất, đây là giai đoạn đưa cây từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn

1.1.5.5 Giai đoạn huấn luyện và đưa cây con ra môi trường thực tiễn sản xuất

Cây con trong ống nghiệm được sản xuất dưới điều kiện lý tưởng (nhân tạo) về nhiệt độ, ánh sáng và môi trường dinh dưỡng Để cấy cây ra bầu đất với tỷ lệ sống cao cần phải huấn luyện cây cho cứng cáp trước khi cho ra khỏi ống nghiệm Cây được huấn luyện bằng cách đặt ống nghiệm (bình cây) trong điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với cường độ ánh sáng từ 5000 - 10.000 lux, nếu lớn hơn 10.000 lux cần phải che bớt lượng ánh sáng Thời gian huấn luyện khoảng 6 - 8 ngày để cây con quen dần với điều kiện tự nhiên Khi thân chuyển sang mầu của tự nhiên, lá xoè ra đầy đủ thì có thê tiến hành cấy chuyển vào bầu đất

Chú ý: Không nên kéo dài thời gian huấn luyện vì để lâu rễ bị đen, lá úa vàng, khi đó tỷ lệ sống khi cấy vào bầu đất hoặc luống đất sẽ không cao

Ra ngôi: Tạo dung dịch hồ rễ Trước khi hồ rễ ít 12 giờ, trộn đất tầng B với dung dịch thuốc tím 0,1 % Khi dùng rửa thuốc tím bằng nước sạch từ 3 -

4 lần và tạo cho đất ở dạng hồ loãng để hồ rễ cây, Tỷ lệ 1 đất 1 nước - Tạo bầu: Bầu được làm bằng nhựa PE có đường kính và chiều cao tùy theo từng loài cây, thông thường sử dụng các loại bầu có đường kính 5 - 6 cm, cao 11

cm không có đáy hoặc có đáy thì phải đục lỗ ở đáy hoặc xung quanh để thoát nước Thành phần ruột bầu: Dùng đất tầng B đập nhỏ, sàng bỏ rễ cây và các tạp chất khác

Xử lý bầu, luống đất: Trước khi cấy cây 12 - 24 giờ, đất phải được xử

lý bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hoà thuốc tím vào nước và dùng ô doa tưới đều lên bề mặt đất cho thấm sâu 1,5 - 2 cm Vào mùa nguy cơ nấm bệnh cao nồng độ thuốc tím phải cao hơn 0,2 - 0,3%

Thao tác ra ngôi: Lấy cây mầm từ trong lọ ra bằng cách đổ ra lòng bàn tay, nhặt từng cây một cho ra khỏi nền nuôi cấy sau đó rửa sạch thạch bằng nước sạch hồ rễ bằng đất đã được khử trùng, các thao tác này phải nhẹ nhàng, cẩn thận tránh làm tổn thương cho cây Cấy cây đã hồ rễ vào bầu đất như cấy cây con từ hạt Khi cấy chú ý cho rễ thẳng và xoè ra tự nhiên, không bị cuốn lại với nhau hoặc bị gập lên trên mặt bầu

Chăm sóc cây mô sau khi cấy: Thời gian quan trọng nhất là tuần cấy đầu tiên, cần phải theo dõi độ ẩm, ánh sáng và nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp từ 25 –

30oC, độ ẩm từ 85 - 90%, cần chú ý điều chỉnh ánh sáng cho cây quang hợp, những ngày trời nắng cần chú ý phải che giâm để giảm bớt ánh sáng trực xạ, tốt nhất là che giâm từ 7 - 10 ngày sau khi cấy, độ tàn che 50 - 60%

Sau 3 tuần thì bón thúc bằng cách tưới phân NPK (5:10:3) nồng độ 0,3% rồi tiếp tục 5 - 7 ngày tưới một lần Sau khi tưới song cần tưới rửa lại bằng nước sạch

Phun phòng nấm bệnh bằng dung dịch Bellate nồng độ 5 g/10 lít nước phun cho 100 m2 thời gian một tuần một lần, nếu phát hiện nấm bệnh cần phun nồng độ cao hơn và thời gian ngắn hơn có thể 3 - 5 ngày một lần tùy theo tình trạng bệnh

Phân loại cây con: Sau khi cây được 45 - 50 ngày cần tiến hành phân loại cây con để có chế độ chăm sóc phù hợp tạo ra các luống cây đồng đều đảm bảo tiêu chuẩn xuất vườn

Hãm cây: Ngừng tưới phân trước khi đi trồng hai tuần Trong trường hợp phải lưu giữ cây ở vườn ươm lâu hơn thì rất hạn chế tưới phân và nước

để hăm cây

Đỉnh sinh trưởng, đoạn thân, hạt giống được thu thập từ người dân, phải có lý lịch rõ ràng Các nguồn vật liệu nhân giống sạch bệnh này được trồng bảo quản trong điều kiện cách ly theo hệ thống nhà lưới cấp 3

1.2 Khái quát vấn đề nghiên cứu

1.2.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu

1.2.1.1 Những nghiên cứu trên thế giới

a) Tổng quan về cây lâm sản ngoài gỗ trên thế giới

Khái niệm về Lâm sản ngoài gỗ được đề cập chính thức vào năm 1989

do tổ chức WWF Theo khái niệm này: “Lâm sản ngoài gỗ bao hàm tất cả các vật liệu sinh học khác gỗ, được khai thác từ rừng tự nhiên phục vụ mục đích của con người Bao gồm các sản phẩm là động vật sống, nguyên liệu thô

và củi, song mây, tre nứa, gỗ nhỏ và sợi”(The Economic value of Non-timber

Forest products in Southeast asia - WWF, 1989)

Theo Tổ chức Lương Nông Liên Hiệp quốc (FAO, 1999), LSNG bao gồm các loài thực vật, động vật dùng làm thực phẩm, dược liệu, tinh dầu, nhựa sáp, nhựa dính, nhựa dầu, cao su, tanin, màu nhuộm, chất béo, làm cảnh, nguyên liệu giấy và sợi được khai thác từ rừng tự nhiên và rừng trồng phục vụ mục đích của con người Cây LSNG đã được gây trồng, khai thác tự nhiên và

sử dụng cách đây hàng nghìn năm, đặc biệt ở các nước có nhiều rừng nhiệt đới như: Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia

Trên thế giới, cây LSNG có vai trò quan trọng, là nguồn thu nhập lớn (chiếm 20-30% cơ cấu thu nhập) của các hộ gia đình miền núi Theo FAO (1999), hàng triệu hộ gia đình trên thế giới đang sống chủ yếu nhờ vào khai thác các sản phẩm LSNG để đáp ứng các tiêu dùng thiết yếu hàng ngày hay là tạo thu nhập Hiện nay, có ít nhất 150 loài LSNG quan trọng trong lĩnh vực thương mại quốc tế (mật ong, nấm, hương liệu, dược liệu, dầu nhựa, song mây, …), ước tính tổng giá trị thương mại quốc tế của LSNG hàng năm đạt 5-

11 tỷ USD Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2015), khoảng 80% dân số thế giới sử dụng sản phẩm LSNG làm thuốc thảo dược Dự báo nhu cầu dược liệu

để sản xuất thuốctrong các năm tới sẽ tiếp tục tăng, phù hợp với xu hướng sử dụng thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc thiên nhiên trong việc phòng và chữa bệnh ở nhiều nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, các nước EU, …Sử dụng nguồn dược liệu từ cây LSNG để chiết xuất các hoạt chất mới tạo ra những thuốc mới với chi phí nghiên cứu phát triển kinh tế hơn rất nhiều so với việc nghiên cứu bào chế thành công một thuốc hóa dược mới Nhận thức được tầm quan trọng của LSNG, Hội nghị môi trường và phát triển của Liên hợp quốc (UNCED) năm 1992 đã thông qua Chương trình nghị sự 21 và các nguyên tắc về rừng, đã xác định vai trò quan trọng LSNG, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái và là nguồn nuôi sống người dân miền núi Do đó FAO, UNCED, WB, v.v… đã xây dựng nhiều chương trình, giúp các nước bảo tồn, nuôi trồng và khai thác LSNG theo hướng phát triển bền vững, tạo nguồn thu nhập, nâng cao đời sống kinh tế, đảm bảo an ninh lương thực, ổn định xã hội cho người dân miền núi

Từ những nhận thức về tầm quan trọng của LSNG, Chiến lược bảo tồn, khai thác và phát triển cây LSNG đã được thực hiện ở nhiều Quốc gia (FAO, 2000) Trong nhóm cây cung cấp dược liệu, tính đến năm 2003 số loài cây thuốc được phát hiện ở Việt Nam lên đến 3.854 loài thuộc 309 họ của 9 ngành thực vật

khác nhau Với 3.854 loài cây thuốc được ghi nhận, so với 12.000 loài cây được phép khẳng định Việt Nam có nguồn cây thuốc phong phú và đa dạng

Hiện nay Việt nam có tới 126 loài cây thuốc thuộc 76 chi, 54 họ, 5 ngành thực vật được đưa vào Danh lục đỏ cần quan tâm bảo vệ (Nguyễn Văn Tập, 2004) Chính vì vậy chúng ta cần nỗ lực để rừng mưa ẩm nhiệt đới một kho thuốc vô giá, không thể thay thế được của nhân loại – không bị mất đi một cách phi lý (Phạm Văn Điển và CS, 2009)

b) Tình hình nghiên cứu cây Thạch hộc tía trên thế giới

Thạch hộc tía có tên khoa học là Dendrobium officinale Kimura et Migo, thuộc họ Lan (Orchidaceae), thường sinh trưởng ở các vách đá, khe đá, hoặc

phụ sinh trên cây cổ thụ, ở vùng cao núi đá, nhiệt đới, Á nhiệt đới như Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á, ở độ cao từ 800 – 1000 m Thạch hộc tía có thân cao 30-50 cm, thường mọc thành khóm Lá mọc so le đều hai bên thân, thuôn

dài Hoa to 4-4,5 cm xếp thành bó 2-4 cái ở sát nách lá (John et al., 1999)

Ở Trung Quốc, Thạch hộc tía phân bố chủ yếu ở các tỉnh Chiết Giang, Quảng Tây, Hồ Nam, Vân Nam, Quý Châu Loài này có mặt trong Sách đỏ, là dược liệu quý hiếm được pháp luật bảo hộ nghiêm ngặt Thạch hộc tía hoang

dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do nguồn cung cấp tự nhiên đã

cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán (John et al., 1999) Thạch hộc tía chế biến

thành phong đấu, giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.000 USD/kg Ở Đài Loan giá phong đấu từ 1.000-3.000USD/kg Giá phong đấu hảo hạng ở thị trường Trung Quốc khoảng 30 đến 60 triệu VNĐ/kg Giá 1 cây Thạch hộc tía tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây Thạch hộc tía, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3 năm Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch hộc tía còn rất lớn với giá cao,

đem lại siêu lợi nhuận cho những người trồng và chế biến Thạch hộc tía

Theo Thomas (2006), Thạch hộc tía có nhiều hợp chất phenol (12 loại), Lignanoid (4 loại); hợp chất lacton (2 loại); hợp chất dihydroflavon (2 loại), bibenzil v.v Có tác dụng bổ thận, tích tinh, dưỡng vị âm, dưỡng khí lực Với hàm lượng polysaccarit phong phú có công năng tăng cường miễn dịch, tăng lực, chữa trị đau dạ dày, chữa trị viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật; giúp cho gân cốt khỏe, khớp nối thanh thoát, giảm đường huyết, mỡ máu, điều trị bệnh tiểu đường, xúc tiến tuần hoàn, giãn huyết quản, giảm cholesterol và triglyceride, tiêu diệt một số tế bào ác tính ung thư phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng, tăng khả năng miễn dịch, chống lão hóa

Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu nhân giống thành công

Thạch hộc tía Zhang et al (2014) nhân giống in vitro thành công trong môi

trường MS + 6-BA 1,5 mg/l + NAA 0,2 mg/l + nước dừa 10% Tạo rễ tốt nhất trong môi trường MS/2 + NAA 0,5 mg/l+ IBA 0,2 mg/l + chuối nghiền 10%

Tỷ lệ ra rễ lên đến 95,0% Giá thể ra cây là vỏ thông tốt nhất trong đó tỷ lệ sống sót đạt 90% Tương tự, Hu (2015) đã nghiên cứu nhân nhanh loài này và

tìm được môi trường thích hợp cho nhân nhanh, tạo rễ cây cấy mô Lu et al (2015) đã công bố nghiên cứu tối ưu hệ thống nhân giống cấy mô loài này 1.2.1.2 Những nghiên cứu trong nước

a) Tổng quan về LSNG ở trong nước

Ở Việt Nam, LSNG được phân thành 6 nhóm: Nhóm cây có sợi; Nhóm cây làm thực phẩm; Nhóm cây thuốc; Nhóm cây cho dầu nhựa; Nhóm Tanin, Thuốc nhuộm; Nhóm cây bóng mát (Triệu Văn Hùng, 2007)

Cây LSNG đã được quan tâm nghiên cứu từ lâu ở nước ta Một số công trình nổi bật như Đỗ Tất Lợi (1991) đã mô tả nhiều loài cây LSNG làm cảnh

và làm thuốc, trong đó có nhiều bài thuốc hay từ những loài LSNG này Vũ Văn Dũng và cs (2002) về phân loại LSNG, giới thiệu về một số nhóm LSNG có giá trị ở Việt Nam, tổ chức và quản lý LSNG, những thuận lợi, khó khăn trong

quá trình phát triển LSNG.Triệu Văn Hùng (2007) đã mô tả hình thái, phân bố, công dụng, kỹ thuật gây trồng, thu hoạch, chế biến và bảo quản của 299 loài LSNG Trong đó phân ra thành 6 nhóm: Nhóm cây có sợi (35 loài tre nứa, 2 loài mây và 8 loài khác); Nhóm cây làm thực phẩm (40 loài cây ăn được, 12 loài nấm); Nhóm cây thuốc (76 loài); Nhóm cây cho dầu nhựa (60 loài); Nhóm Tanin, thuốc nhuộm (19 loài); Nhóm cây bóng mát (23 loài cây hoa, 13 loài cây cảnh, 11 loài cây cảnh và cây bóng mát thân gỗ) Nguyễn Quang Hưng (2008) đã nghiên cứu đánh giá vai trò của LSNG ở tỉnh Cao Bằng và Bắc Kạn cho rằng LSNG ở đây có vai trò rất quan trọng, chúng là nguồn thu nhập quan trọng của nhiều hộ gia đình, chiếm trung bình 20 – 30% tổng thu nhập kinh

tế của hộ/năm Chương trình dự án Dự án LSNG pha II (2006) đã nghiên cứu, tổng kết và đánh giá một số mô hình nhận thấy rằng các mô hình LSNG đều mang lại hiệu quả kinh tế cao và đáp ứng được nhu cầu nguyện vọng của người dân nếu loài được chọn có tiềm năng thị trường, phù hợp đất đai và được chuyển giao kỹ thuật tốt Các loài LSNG có giá trị, đang được gây trồng

và phát triển mạnh như mây, thảo quả, sa nhân,… đang có xu hướng mở rộng diện tích ở nhiều vùng sinh thái

Đặc biệt, Bộ NN&PTNT đã phê duyệt đề án “Bảo tồn và phát triển LSNG trong giai đoạn 2006 – 2020” Năm 2007, Bộ NN&PTNT tiếp tục phê duyệt Kế hoạch hành động bảo tồn và phát triển LSNG ở Việt Nam giai đoạn

2007 – 2010” Gần đây, Đề án tái cơ cấu nghành Lâm nghiệp (2015-2020) xác định phát triển LSNG là một trong những trọng tâm của nghành nhằm tăng giá trị thu nhập trên một đơn vị diện tích canh tác rừng

Theo thống kê của Cục Quản lý Y dược cổ truyền (2016), nhu cầu dược liệu của nước ta từ 60.000 – 80.000 tấn/ năm Hàng năm nhập khẩu khoảng

300 loại dược liệu và 40 loại cao dược liệu, số lượng dược liệu thô trung bình khoảng 17,6 nghìn tấn với kim ngạch nhập khẩu gần 13 triệu USD Trong khi

đó có nhiều loài Việt Nam có thể chủ động sản xuất được nguồn dược liệu

Để sản xuất được dược liệu đáp ứng nhu cầu trong nước nhiều công ty dược

đã lên kế hoạch, dự toán kinh phí triển khai trồng dược liệu quy mô lớn Nhưng vấn đề khó khăn đầu tiên đặt ra là chất lượng giống và số lượng giống Cây nhân giống hữu tính (từ hạt) thì chất lượng không đảm bảo và không ổn định do tính phân ly cao Cây nhân giống vô tính (bằng hom) đòi hỏi phải số lượng hom lớn, phương pháp này cũng mang lại rủi ro cao vì khó tập hợp được số lượng hom giống có độ tuổi và kích thước đồng đều Nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào có thể khắc phục được những nhược điểm trên: độ đồng đều của cây giống và chỉ sử dụng nguồn vật liệu nhân giống rất nhỏ mà duy trì được đặc tính của cây mẹ Tuy nhiên, hiện nay các công bố về chọn giống dược liệu rất hạn chế và ít được nghiên cứu Một số nghiên cứu của Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp đã tiến hành chọn giống Lan kim tuyến, Đinh lăng, Gừng gió trong dự án khoa học

công nghệ cấp quốc gia “Hoàn thiện công nghệ nhân giống In vitro và nuôi

trồng một số cây thuốc quý có giá trị kinh tế cao (Lan kim tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume), Đinh lăng (Polycias fruticosa L Harms.)và Gừng gió (Zingber zerumber sm.)” Một số nghiên cứu gần đây của Viện

dược liệu đã đề cập tới vấn đề chọn giống dược liệu đối với một số cây như:

Hà thủ ô đỏ, Đảng sâm, Đinh lăng lá sẻ thông qua một số đề tài dự án

b) Tình hình nghiên cây Thạch hộc tía ở trong nước

Tên khoa học: Dendrobium officinale Kimura et Migo, thuộc chi Thạch

hộc, họ Lan (Orchidaceae) Tên gọi thông thường: Thạch hộc tía, Lan thạch hộc

Phân bố và môi trường sinh thái: Thạch hộc tía phân bố ở Việt Nam,

Lào, Trung Quốc, Myanmar và nhiều nước nhiệt đới, cận nhiệt đới Ở nước ta cây cây phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền núi Phía bắc như: Hòa Bình, Ninh Bình, Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang, vùng rừng có độ cao 1.000 - 3.400 m so

với mực nước biển, thường phụ sinh vào cây gỗ hoặc vách đá có mọc rêu dưới tán rừng Trong điều kiện môi trường tự nhiên độ ẩm 70%, nhiệt độ không khí bình quân năm 12 - 18 độ C, lượng mưa 900 - 1.500 mm, thường tập trung sống ở phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và vách núi đá (Đỗ Tất Lợi, 2001).Điều kiện khí hậu cũng như trình độ sản xuất của người dân Việt Nam rất thích hợp cho trồng Thạch hộc tía Tuy nhiên, việc sản xuất loại dược liệu này vẫn chưa được đầu tư thích đáng khiến cho chúng có nguy cơ tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam (Sách đỏ Việt Nam, 2007)

Hình 2.1 Cây Thạch hộc tía

Đặc điểm thực vật: Thân cây Thạch hộc tía có màu tía, lá mọc so le

thành dây đều hai bên thân, thuôn dài, hầu như không cuống, đầu lá hơi cuộn hình móng, có 5 gân dọc, dài 12 cm, rộng 2 - 3 cm Cụm hoa ở kẽ lá Hoa to màu vàng, mọc thành chùm trên những cuống dài, mang 2 - 4 cánh hoa có cánh môi hình bầu dục, nhọn, cuốn thành phễu trong hoa, ở họng hoa có những điểm màu tím Quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở Hạt rất nhiều và nhỏ như bụi phấn Mùa hoa tháng 2 - 4, mùa quả tháng 4 - 6 Cây mọc hoang

ở rừng núi trên cây gỗ (Đỗ Tất Lợi, 2001)

Thành phần hóa học và tác dụng dược lý:Thạch hộc tía làm thuốc có

nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý, giàu polysacarit thạch hộc, alkaloit thạch hộc, polysacarit (22%), hàm lượng các acid amine như glutamic,

asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amin Ngoài ra, thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn, bibenzyl, keton, ester và các chất nhầy, hợp chất amidon Trong thân cây thạch hộc tía có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3% Thạch hộc tía vừa là cây làm cảnh vừa là cây làm thuốc quý hiếm, đã có lịch sử làm thuốc cách đây trên 2.000 năm, được ghi trong “Thần nông bản thảo” của Trung Quốc Loài cây này có nguy

cơ tuyệt chủng được quốc tế đưa vào Công ước buôn bán quốc tế về động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng (Dược điển Trung Quốc, 2000)

Thị trường: Sản phẩm Thạch hộc tía hiện có trên thị trường, phần lớn là

thân cây cho gia công thô và chế biến như Thạch hộc tía tươi; Thạch hộc tía phong đầu, bột bột Thạch hộc tía; Thạch hộc tía lát Với 1 cây Thạch hộc tía 3 tuổi có giá khoảng 25.000 – 35.000 đồng; giá khoảng 3.000.000 đồng/ 1kg

tươi, giá bán 300.000- 400.000/1kg khô

Nhân giống: Loài này có thể nhân giống bằng hạt hoặc vô tính bằng

giâm cành và nuôi cấy mô Kết quả của Nguyễn Thị Sơn (2014) đã chỉ rõ: Nhân giống Thạch hộc tía bằng gieo hạt trên môi trường VW + 10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa/ lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100 ml nước dừa/ lít môi trường + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/ lít môi trường Bùi Văn Thắng (2016) đã tiến hành nhân giống nuôi cấy mô sử dụng lá, thân non, rễ trong môi trường MS + NAA (0,05-1,5mg/l) + IAA (0,2-1,0mg/l) + 6-BA (1,0-5,0mg/l) Nguyễn Thị Sơn

và cs (2014) đã nhân giống cây lan Thạch hộc thiết bì in vitro sử dụng bằng

hạt nuôi cấy trên môi trường VW + sucrose 10g + agar 6g + nước dừa 100ml/l môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + ND 100 ml + sucrose 20g + agra 6g + chuối chín 60g/lít

c) Đánh giá chung về tình hình nghiên cứu và phát triển cây LSNG ở nước ta

Nghiên cứu về LSNG phục vụ phát triển nguồn dược liệu ở các tỉnh

vùng núi nước ta đã được tiến hành từ những năm 1968 – 1975 (thực hiện chỉ thị 210/TTg – VG của hội đồng chính phủ về công tác dược liệu, năm 1966) Qua đó, Viện Dược liệu, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, v.v… đã phối hợp với ngành địa phương tiến hành điều tra cơ bản nguồn cây LSNG ở tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, v.v Tại Hà Giang, kết quả điều tra bước đầu cho thấy Hà Giang có nguồn cây LSNG đặc biệt phong phú, với nhiều loại cây quý như Ngũ gia bì gai, Cầu tích, Hà thủ ô đỏ, Đảng sâm, Tục đoạn, Bách bộ, v.v… Các loài cây thuốc của vùng rất phong phú với 665 loài thuộc 159 họ thực vật và nấm lớn

có công dụng làm thuốc; xác định được danh mục 30 loài có giá trị sử dụng phổ biến; 26 loài cây quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng cần bảo vệ

Trong thời gian qua, một số đề tài dự án các cấp nhân giống và nuôi trồng thử nghiệm một số cây LSNG đã được tiến hành ở quy mô nhỏ lẻ ở một

số địa phương Nhìn chung, các đề tài, dự án đã được thực hiện chưa quan tâm đến tuyển chọn, chọn lọc nguồn gen tốt có năng suất, chất lượng cao, xây dựng vườn giống gốc tại vùng sinh thái bản địa để cung cấp nguồn giống chất lượng cao cho sản xuất tại vùng miền núi nước ta Vì vậy, các đề tài, dự án sau khi kết thúc, nguồn gen đã bị thất thoát, chết dần do không được lưu giữ trong trong vườn giống và phát triển nhâng giống và mở rộng vùng sản xuất sau đó Đặc biệt qua điều tra cho thấy không có các vườn giống gốc được lưu trữ để làm các vật liệu nhân giống, các giống cây hiện có nhân giống bằng hom, hạt và không rõ nguồn gốc xuất xứ Vì vậy việc đưa vào sản xuất kinh doanh từ những giống không có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng, chất lượng không đảm bảo sẽ ảnh hưởng rất lớn đến thiệt hại kinh tế cho người trồng LSNG Hơn nữa, chưa có một đề tài, dự án nào đầu tư cho xây dựng quy trình nhân giống ở quy mô công nghiệp, sử dụng giá thể siêu nhẹ, giúp cho cây giống có

tỷ lệ sống cao và giảm giá thành vận chuyển

Để phát triển cây LSNG có giá trị kinh tế cao với quy mô lớn, không chỉ cần nguồn giống chất lượng cao, mà cả số lượng lớn cho nuôi trồng Nhu cầu về giống cây LSNG trên địa bàn các tỉnh là rất lớn, trong khi khả năng sản xuất và cung ứng giống còn rất hạn chế, chủ yếu là sản xuất theo phương pháp truyền thống và nhập khẩu giống.Quy trình trồng trọt và thu hái chưa hoàn chỉnh.Vì vậy, việc cần thiết nên chú trọng vào hướng sản xuất giống này

để đảm bảo được chất lượng cây giống, giá thành rẻ, có khả năng vận chuyển đến những vùng núi cao để trồng dưới tán rừng

Tóm lại: LSNG có vai trò rất quan trọng đối với người dân miền núi

sống ở gần rừng và trong rừng khu vực vùng núi phía Bắc Ở một số địa phương, LSNG là nguồn thu nhập chủ yếu để nâng cao đời sống, góp phần xoá đói giảm nghèo cho người dân Phát triển LSNG dưới tán rừng tự nhiên vừa tăng thêm thu nhập vừa bảo vệ được tầng cây gỗ của rừng, đồng thời bảo

vệ được môi trường sống cho loài người Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu còn tản mạn chưa tập trung và chưa hệ thống, chủ yếu tập trung thống kê, phân loại các loài LSNG, nhân giống, điều kiện gây trồng, chế biến và bảo quản cho một hay một số loài cụ thể Hầu như có rất ít nghiên cứu về chọn giống các loài cây LSNG Vì thế chưa thể phát triển các loài LSNG trên quy

mô lớn Để thực hiện tốt chương trình phát triển LSNG cần thiết phải đánh giá được thực trạng và kỹ thuật nhân giống các loài LSNG hiện nay để làm cơ

sở xây dựng và phát triển công nghệ nhân giống các loài cây LSNG chất lượng cao, sạch bệnh trên quy mô công nghiệp đáp ứng nhu cầu về giống của địa phương nhằm phát triển kinh tế - xã hội khu vực miền núi phía Bắc và phát triển sản xuất hàng hoá phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu

1.2.2 Nghiên cứu về Thạch hộc tía

Tên khoa học: Dendrobium officinale Kimura et Migo, thuộc chi Thạch

hộc, họ Lan (Orchidaceae) Tên gọi thông thường: Thạch hộc tía, Lan thạch hộc

Phân bố và môi trường sinh thái: Thạch hộc tía phân bố ở Việt Nam,

Lào, Trung Quốc, Myanmar và nhiều nước nhiệt đới, cận nhiệt đới Ở nước ta cây cây phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền núi Phía bắc như: Hòa Bình, Ninh Bình, Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang, vùng rừng có độ cao 1.000 - 3.400 m so với mực nước biển, thường phụ sinh vào cây gỗ hoặc vách đá có mọc rêu dưới tán rừng Trong điều kiện môi trường tự nhiên độ ẩm 70%, nhiệt độ không khí bình quân năm 12 - 18 độ C, lượng mưa 900 - 1.500 mm, thường tập trung sống ở phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và vách núi đá (Đỗ Tất Lợi, 2001).Điều kiện khí hậu cũng như trình độ sản xuất của người dân Việt Nam rất thích hợp cho trồng Thạch hộc tía Tuy nhiên, việc sản xuất loại dược liệu này vẫn chưa được đầu tư thích đáng khiến cho chúng có nguy cơ tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam (Sách đỏ Việt Nam, 2007)

Hình 2.2.Cây Thạch hộc tía tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp

Đặc điểm thực vật: Thân cây Thạch hộc tía có màu tía, lá mọc so le

thành dây đều hai bên thân, thuôn dài, hầu như không cuống, đầu lá hơi cuộn hình móng, có 5 gân dọc, dài 12 cm, rộng 2 - 3 cm Cụm hoa ở kẽ lá Hoa to màu vàng, mọc thành chùm trên những cuống dài, mang 2 - 4 cánh hoa có cánh môi hình bầu dục, nhọn, cuốn thành phễu trong hoa, ở họng hoa có những điểm màu tím Quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở Hạt rất nhiều và nhỏ như bụi phấn Mùa hoa tháng 2 - 4, mùa quả tháng 4 - 6 Cây mọc hoang

ở rừng núi trên cây gỗ (Đỗ Tất Lợi, 2001)

Thành phần hóa học và tác dụng dược lý:Thạch hộc tía làm thuốc có

nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý, giàu polysacarit thạch hộc, alkaloit thạch hộc, polysacarit (22%), hàm lượng các acid amine như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amin Ngoài ra, thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn, bibenzyl, keton, ester và các chất nhầy, hợp chất amidon Trong thân cây thạch hộc tía có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3% Thạch hộc tía vừa là cây làm cảnh vừa là cây làm thuốc quý hiếm, đã có lịch sử làm thuốc cách đây trên 2.000 năm, được ghi trong “Thần nông bản thảo” của Trung Quốc Loài cây này có nguy

cơ tuyệt chủng được quốc tế đưa vào Công ước buôn bán quốc tế về động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng (Dược điển Trung Quốc, 2000)

Thị trường: Sản phẩm Thạch hộc tía hiện có trên thị trường, phần lớn là thân

cây cho gia công thô và chế biến như Thạch hộc tía tươi; Thạch hộc tía phong đầu, bột bột Thạch hộc tía; Thạch hộc tía lát Với 1 cây Thạch hộc tía 3 tuổi

có giá khoảng 25.000 – 35.000 đồng; giá khoảng 3.000.000 đồng/ 1kg tươi, giá bán 300.000- 400.000/1kg khô

Thạch hộc tía có tên khoa học là Dendrobium officinale Kimura et Migo, thuộc họ Lan (Orchidaceae), thường sinh trưởng ở các vách đá, khe đá,

hoặc phụ sinh trên cây cổ thụ, ở vùng cao núi đá, nhiệt đới, Á nhiệt đới như Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á, ở độ cao từ 800 – 1000 m

Thạch hộc tía có thân cao 30-50 cm, thường mọc thành khóm Lá mọc so le đều hai bên thân, thuôn dài Hoa to 4-4,5 cm xếp thành bó 2-4 cái ở sát nách

lá (John et al., 1999) Ở Trung Quốc, Thạch hộc tía phân bố chủ yếu ở các

tỉnh Chiết Giang, Quảng Tây, Hồ Nam, Vân Nam, Quý Châu Loài này có mặt trong Sách đỏ, là dược liệu quý hiếm được pháp luật bảo hộ nghiêm ngặt Thạch hộc tía hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động

thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do nguồn

cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán (John et al., 1999)

Theo Thomas (2006), Thạch hộc tía có nhiều hợp chất phenol (12 loại), Lignanoid (4 loại); hợp chất lacton (2 loại); hợp chất dihydroflavon (2 loại), bibenzil v.v Có tác dụng bổ thận, tích tinh, dưỡng vị âm, dưỡng khí lực Với hàm lượng polysaccarit phong phú có công năng tăng cường miễn dịch, tăng lực, chữa trị đau dạ dày, chữa trị viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật; giúp cho gân cốt khỏe, khớp nối thanh thoát, giảm đường huyết, mỡ máu, điều trị bệnh tiểu đường, xúc tiến tuần hoàn, giãn huyết quản, giảm cholesterol và triglyceride, tiêu diệt một số tế bào ác tính ung thư phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng, tăng khả năng miễn dịch, chống lão hóa

Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu nhân giống thành công

Thạch hộc tía Zhang et al (2014) nhân giống in vitro thành công trong môi

trường MS + 6-BA 1,5 mg/l + NAA 0,2 mg/l + nước dừa 10% Tạo rễ tốt nhất trong môi trường MS/2 + NAA 0,5 mg/l+ IBA 0,2 mg/l + chuối nghiền 10%

Tỷ lệ ra rễ lên đến 95,0% Giá thể ra cây là vỏ thông tốt nhất trong đó tỷ lệ sống sót đạt 90% Tương tự, Hu (2015) đã nghiên cứu nhân nhanh loài này và

tìm được môi trường thích hợp cho nhân nhanh, tạo rễ cây cấy mô Lu et al (2015) đã công bố nghiên cứu tối ưu hệ thống nhân giống cấy mô loài này

Loài này có thể nhân giống bằng hạt hoặc vô tính bằng giâm cành và nuôi cấy mô Kết quả của Nguyễn Thị Sơn (2014) đã chỉ rõ: Nhân giống Thạch hộc tía bằng gieo hạt trên môi trường VW + 10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa/ lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100 ml nước dừa/ lít môi trường + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/ lít môi trường Bùi Văn Thắng (2016) đã tiến hành nhân giống nuôi cấy mô sử dụng lá, thân non, rễ trong môi trường MS + NAA (0,05-1,5mg/l) + IAA (0,2-1,0mg/l) + 6-BA (1,0-5,0mg/l) Nguyễn Thị Sơn và cs

(2014) đã nhân giống cây lan Thạch hộc thiết bì in vitro sử dụng bằng hạt

nuôi cấy trên môi trường VW + sucrose 10g + agar 6g + nước dừa 100ml/l môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + ND 100 ml + sucrose 20g + agra 6g + chuối chín 60g/lít

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, ĐỊA ĐIỂM VÀ NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Lan thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) được

thu thập về trồng khảo nghiệm và chọn lọc tại Viện nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Kế thừa kết quả điều tra thực địa của đề tài “Nghiên cứu chọn giống và phát triển công nghệ nhân giống quy mô công nghiệp cho một số loài cây lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế cao để phát triển kinh tế xã họi vùng núi phía Bắc” của Viện Nghiên cứu và phát triển lâm nghiệp Nội dung nhân giống thực hiện tại các địa điểm Viện nghiên cứu và phát triển lâm nghiệp Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA, IBA, IAA, tổ hợp NAA

và IBA) đến giai đoạn ra rễ in vitro của cây Lan thạch hộc tía

- Đề tài được thực hiện từ tháng 5 năm 2020 đến tháng 8 năm 2021

3.3 Địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại Viện NC&PTLN- Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1 Điều tra, đánh giá thực trạng, tiềm năng phát triển và đánh

giá sản xuất giống cây Thạch hộc tía tại các tỉnh miền núi phía Bắc

Nội dung 2 Nghiên cứu nhân giống bằng in vitro loài cây Lan Thạch

hộc tía tại Viện NC&PTLN

Nội dung 3 Đánh giá nhu cầu sử dụng cây Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) tại các tỉnh miền núi phía Bắc

Nội dung 4 Đề xuất một số giải pháp nâng cao hiệu quả nhân giống loài

cây Lan Thạch hộc tía

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Quan điểm tiếp cận

* Tiếp cận hệ thống: Xây dựng và phát triển công nghệ nhân giống cây

lâm sản ngoài gỗ chất lượng cao, sạch bệnh, tỷ lệ sống cao ở quy mô công nghiệp được tiếp cận một cách hệ thống từ nghiên cứu các đặc điểm sinh học

và sinh thái học của giống; ảnh hưởng của điều kiện môi trường (thời tiết, đất đai, …) và kinh tế xã hội vùng đến sinh trưởng, phát triển, năng suất, chất lượng, hiệu quả đối với các loài cây lâm sản ngoài gỗ; đến nghiên cứu các công nghệ nhân giống cây lâm sản ngoài gỗ trên quy mô công nghiệp

Nội dung nghiên cứu được thực hiện một cách tuần tự: Đánh giá thực trạng và khả năng cung ứng giống cây Thạch hộc tía có giá trị kinh tế cao tại vùng núi phía Bắc; Chọn lọc và xây dựng vườn giống gốc cây Thạch hộc tía

chất lượng cao; Hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro (qua tái sinh chồi

trực tiếp và tái sinh cây từ mô sẹo) cây Thạch hộc tía quy mô công nghiệp; nghiên cứu và hoàn thiện các quy trình công nghệ sau cấy mô ở giai đoạn vườn ươm sử dụng bầu siêu nhẹ

* Tiếp cận kế thừa: Kế thừa từ kết quả nghiên cứu nhân giống một số

loài cây LSNG sẵn có và kết quả các nhiệm vụ đã nghiên cứu của Viện

NC&PTLN về nhân giống in vitro

3.5.2 Phương pháp điều tra, đánh giá thực trạng, tiềm năng phát triển và sản xuất giống cây Lan hộc tía

Tiếp cận nắm bắt thông tin ban đầu thông qua cán bộ lâm nghiệp ở Chi cục lâm nghiệp, kiểm lâm, công ty lâm nghiệp và người dân địa phương ở tỉnh Thái Nguyên, đồng thời kế thừa các tài liệu đã có về cây Lan thạch hộc

tía kết hợp với điều tra ngoài thực địa theo tuyến điển hình để từ đó xác định vùng phân bố của loài cây nghiên cứu

Sử dụng một số công cụ trong phương pháp điều tra nhanh có sự tham gia (PRA) để đánh giá về thực trạng và tiềm năng phát triển cây Lan hộc tía

có giá trị kinh tế cao tại các tỉnh: Phiếu điều tra phỏng vấn, cây vấn đề, sơ đồ SOWT,…

- Trong mỗi OTC lập 5 ô dạng bản (ODB) 5m2 song song cách đều để xác định số lượng, chiều cao, nguồn gốc và chất lượng cây tái sinh dưới rừng

- Xác định sinh trưởng đối với loài thạch hộc tía: Đo chiều cao toàn bộ

cá thể trong OTC, số cành trong khóm, tình hình sâu bệnh hại

(Phần này kế thừa các kết quả điều tra của 14 tỉnh trong đề tài cấp Bộ của Viện Ngiên cứu và phát triển lâm nghiệp mà tác giả không trực tiếp điều tra hiện trường)

3.5.3 Phương pháp nhân giống bằng in vitro loài cây Lan Thạch hộc tía tại Viện NC&PTLN

2.5.3.1 Hóa chất

* Phương pháp điều tra các đặc điểm lâm học thông qua lập OTC

Tại mỗi khu vực điều tra tiến hành lập 2 tuyến điều tra điển hình đi qua các trạng thái sinh cảnh khác nhau (vườn nhà, tràng cỏ, nương rẫy, rừng trồng, rừng tự nhiên, ) để xác định đặc điểm phân bố của Lan thạch hộc tía Ghi lại số cây/khóm trên mỗi tuyến đi và trên mỗi trạng thái sinh cảnh Trên mỗi tuyến đi đó tiến hành lập các ô tiêu chuẩn (OTC) điển hình, tạm thời để điều tra các đặc điểm lâm học của loài lan Thạch hộc tía Với mỗi trạng thái rừng có các loài hiện có ở các lập địa thiết lập 1 OTC với diện tích là 1000m2 Trong mỗi ô tiêu chuẩn tiến hành thu thập các thông tin như sau:

- Xác định một số đặc điểm sinh thái: độ cao so với mực nước biển, vị trí phân bổ hoặc gây trồng (chân, sườn, đỉnh, khe) độ dốc, hướng dốc

Môi trường MS cơ bản, WPM, B5

Thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra

rễ của mẫu nuôi cấy Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích

ra rễ đến khả năng ra rễ cây lan Thạch hộc tía: Các cụm chồi đạt chiều cao ≥ 4

cm, cây thẳng, cứng cáp, có từ 3 lá được chuyển sang môi trường tạo rễ có thành phần 1/2MS + đường 15g/l + aga 5,5 g/l và bổ sung:

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ ra rễ, số lượng rễ/mẫu Thời gian theo dõi: 4 tuần

Thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ