Báo cáo " SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MẪU CẤY LÁ CÂY DẦU MÈ (JATROPHA CURCAS L.) " doc

1 Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM; 2 Viện Sinh học Nhiệt đới; 3 Viện sinh học Tây Nguyên TÓM TẮT Mẫu cấy lá cây Dầu mè được nuôi cấy trên môi trường WPM có bổ sung Kinetin

193

SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MẪU CẤY LÁ CÂY DẦU MÈ

(JATROPHA CURCAS L.)

1 Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM; 2

Viện Sinh học Nhiệt đới;

3

Viện sinh học Tây Nguyên

TÓM TẮT

Mẫu cấy lá cây Dầu mè được nuôi cấy trên môi trường WPM có bổ sung Kinetin kết hợp với IBA hoặc 2,4-D ở những nồng độ khác nhau để cảm ứng sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Trên môi trường có bổ sung 1,5 – 2,0 mg/l Kinetin kết hợp với 0,5 mg/l 2,4-D có sự xuất hiện của khối mô sẹo mềm, dễ vỡ vụn cùng với một

số cấu trúc hình cầu giống phôi có màu kem sáng Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng khác nhau lên khả năng phát sinh phôi vô tính của cây Dầu mè cũng

đã được nghiên cứu Thành phần khoáng đa lượng của môi trường MS tỏ ra hiệu quả hơn trong việc cảm ứng sự hình thành các khối tiền phôi hình cầu Những khối tiền phôi này được cấy chuyển sang môi trường có nồng độ Kinetin và 2,4-D thấp hơn để cảm ứng sự biệt hóa và trưởng thành phôi Phôi vô tính Dầu mè có thể nảy mầm và phát triển thành cây con hoàn chỉnh trên môi trường MS½ không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Cây con có bộ rễ hoàn chỉnh và phát triển mạnh như cây con gieo từ hạt

Từ khóa: Jatropha curcas L., diesel sinh học, mô sẹo sinh phôi, phôi vô tính, khoáng đa lượng

GIỚI THIỆU

Trong tình hình khủng hoảng năng lượng hiện nay, các nước trên thế giới đều đi tìm những nguồn năng lượng không truyền thống hoặc năng lượng có khả năng tái sinh được để trước mắt thay thế một phần năng lượng dầu mỏ, trong đó nhiên liệu sinh học (biodiesel) là một lĩnh vực được

nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Cây Dầu mè (Jatropha curcas L.) là một trong những

loại cây nhiên liệu được đầu tư phát triển ở rất nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam

Cây Dầu mè thuộc họ Euphorbiaceae, có nguồn gốc từ Trung, Nam Mỹ và vùng biển Carribê

Đây là một loại cây đa mục đích vì tất cả các phần của cây đều có giá trị sử dụng, cây có dạng thân bụi, sống lưu niên, có thể cao tới 5 m, nhưng trong sản xuất thường để chiều cao không quá 2 m cho tiện việc thu hái Dầu từ hạt được xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất nhiên liệu sinh học, đây là loại nhiên liệu sạch, không độc, thân thiện với môi trường và kinh tế nhờ chi phí sản xuất thấp Ngoài ra, dầu cũng được sử dụng một cách truyền thống để sản xuất xà phòng, nến, sơn, dầu nhờn và dùng trong y học để làm thuốc xổ (Sujatha, Mukta, 1996)

Ở Việt Nam, cây Dầu mè mọc hoang dại trong tự nhiên ở độ cao trên 1000 m so với mặt nước biển, chúng có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước Có giống có hàm lượng dầu đạt 40% như ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng Năng suất hạt của cây Dầu mè, cũng như bao cây trồng khác, phụ thuộc vào giống, lọai đất, mức độ đầu tư phân bón và lượng nước tưới Trên vùng đất xấu, ít được chăm sóc năng suất hạt của cây Dầu mè có thể đạt 4-5 tấn hạt/ha/năm và đạt 10-12 tấn hạt/ha/năm ở vùng đất tốt cùng với sự đầu tư thích hợp Hàm lượng dầu của hạt khoảng 35-40% tuỳ theo giống Nếu chiết ép tốt, 3-3,5 kg hạt có thể cho 01 lít dầu thô (Du và Uyển, 2006)

Hạt Dầu mè là thể dị hợp tử từ phức hợp lai giữa 2 dạng Jatropha sp tự nhiên và nhân tạo gây

ra vấn đề khó khăn trong tính ổn định về di truyền (Prabakaran và Sujatha, 1999) Vì vậy, hàm lượng dầu dao động trong khoảng 4 – 40% Nhân giống truyền thống cây Dầu mè gặp phải vấn đề

về khả năng sống sót của hạt kém, tỉ lệ nảy mầm thấp, khả năng ra rễ của cây con gieo từ hạt và của cành giâm ít và chậm (Heller, 1996; Openshaw, 2000) Những cây con được nhân giống bằng cành giâm có tuổi thọ ngắn và khả năng kháng bệnh cũng như kháng hạn kém hơn so với cây con gieo từ hạt Cây con từ cành giâm không tạo được rễ cọc thật sự (dẫn đến khả năng kháng hạn kém), thay

vào đó, chúng tạo ra các rễ cọc giả chỉ có thể cắm sâu xuống đất khoảng 1/2 – 2/3 so với rễ cọc được tạo ra từ cây con gieo từ hạt (Heller, 1996)

Xét về tiềm năng to lớn của cây Dầu mè thì cần phải có một lượng lớn cây giống có chất lượng tốt để sử dụng trong tương lai Chính vì vậy, việc cải thiện chất lượng cây trồng thông qua việc áp dụng các phương pháp công nghệ sinh học thực vật là hết sức cần thiết Trong những nghiên

cứu trước đây, một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của cây Dầu mè in vitro đã được

khảo sát như loại mô dùng làm mẫu cấy, vị trí lấy mẫu, tuổi sinh lý của mẫu cấy, nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, thành phần của môi trường nuôi cấy,… (Sujatha và Mukta, 1996;

Sardana và cs., 2000; Rajore và Batra, 2005; Jha và cs., 2007; Shrivastava, Banerjee và 2008)

Trong đó, mẫu cấy đoạn thân có mang chồi bất định được xem là nguyên liệu tốt nhất để tái sinh

cây in vitro do có tỉ lệ nhiễm thấp, giúp giảm đáng kể những biến dị sinh dưỡng nhưng hệ số nhân

giống đạt được không cao

Phương pháp phát sinh phôi vô tính là một công cụ mạnh của ngành Công nghệ sinh học được

áp dụng để nhân giống đối với nhiều loại cây trồng khác nhau Việc ứng dụng phương pháp phát sinh phôi vô tính ở cây Dầu mè hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ưu điểm vì có thể tạo ra một số lượng lớn cây con có chất lượng tốt trong một thời gian ngắn Trong bài báo này, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin kết hợp với IBA và 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

từ mẫu cấy lá cây Dầu mè Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng khác nhau trong môi

trường nuôi cấy lên sự phát sinh phôi vô tính ở cây Dầu mè cũng được khảo sát Cây con in vitro

được chuyển ra vườn ươm để đánh giá khả năng sống sót và hoàn thiện quy trình nhân giống cây Dầu mè thông qua con đường phát sinh phôi vô tính từ mẫu cấy lá trưởng thành với hệ số nhân giống đạt được tương đối cao

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Vật liệu thí nghiệm là lá của cây Dầu mè Ấn độ được trồng tại vườn giống Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

Phương pháp

Khử trùng mẫu cấy

Lá được đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút sau đó tiến hành rửa sạch bề mặt lá bằng xà phòng loãng (Viso, Việt Nam) và rửa lại bằng nước cất vô trùng Sau đó, lá được khử trùng bằng dung dịch Javel 7% trong thời gian 15 phút và rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng

Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

Lá được cắt thành những mảnh nhỏ và được nuôi cấy trên môi trường WPM (Lloyd, McCown, 1980) có bổ sung 30 g/l sucrose, 9 g/l agar, Kinetin (0,1 – 2,0 mg/l) kết hợp với IBA (0,1 – 1,0 mg/l) hoặc 2,4-D (0,1 – 1,0 mg/l) pH môi trường được điều chỉnh về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121ºC, áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút Các mảnh lá được nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở nhiệt độ 22 ± 2ºC

Ảnh hưởng của khoáng đa lượng lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

Bảy loại môi trường khác nhau có chứa thành phần khoáng đa lượng của MS, MS½

(Murashige và Skoog, 1962), WPM (Lloyd và McCown, 1980), B5 (Gamborg và cs., 1968), White

(White, 1963), SH (Schenk và Hildebrandt, 1972), Nitsch (Nitsch và Nitsch, 1969) được sử dụng Mỗi môi trường đều được bổ sung thành phần vi lượng và vitamin của MS, 100 mg/l myo-inositol, 3% sucrose, 1,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D với 3 điều kiện nuôi cấy khác nhau: bán rắn (bổ sung 9 g/l agar), lỏng tĩnh (không bổ sung agar), lỏng lắc (không bổ sung agar, lắc với tốc độ 120 vòng/phút)

Bảng 1 Thành phần ion trong các môi trường sử dụng (theo George và Sherrington, 1984)

NO 3

-

H 2 PO 4

-

195

NH 4

+

NH 4

+

Sự trưởng thành, biệt hóa và nảy mầm của phôi vô tính

Mô sẹo với các khối tiền phôi được tách thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trường MS có

bổ sung 1,0 mg/l Kinetin kết hợp với 2,4-D ở những nồng độ khác nhau (0 – 1,0 mg/l) Tách các phôi ở giai đoạn lá mầm hoặc đã nảy chồi ra khỏi đám mô sẹo và cấy sang môi trường tái sinh cây (môi trường MS½ không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật)

Xử lý thống kê

Các thí nghiệm được thiết kế theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên Mỗi thí nghiệm được lặp lại

3 lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV theo phương pháp DMRT (Ducan, 1995) ở mức ý nghĩa 5%

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

Mẫu cấy lá cây Dầu mè được nuôi cấy trên môi trường WPM cơ bản có bổ sung Kinetin kết hợp với IBA và 2,4-D ở những nồng độ khác nhau bắt đầu phồng lên sau 5 – 7 ngày Trên môi trường không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật, mẫu cấy lá cũng phồng lên sau đó dần hóa nâu và chết (Hình 1a1) Đáp ứng đầu tiên của mẫu cấy là gân chính phình ra, sự hình thành mô sẹo chỉ được quan sát ở bề mặt cắt của mảnh lá sau 2 tuần nuôi cấy Mô sẹo bắt đầu hình thành từ gân chính sau đó lan rộng ra bề mặt lá Quan sát hình thái bên ngoài và cấu trúc giải phẫu bên trong của mẫu cấy cho thấy sau khoảng 7 – 10 ngày nuôi cấy, bắt đầu có sự tăng sinh tế bào từ vùng tế bào nhu mô của mô thịt lá, khối mô sẹo ban đầu có màu trắng, xốp

Jha và cộng sự (2007) cho rằng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được sử dụng ở các nồng độ khác nhau là những yếu tố chính xác định sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

vô tính ở cây Jatropha curcas Trong thí nghiệm này, kết quả được chỉ ra cho thấy Kinetin khi sử

dụng phối hợp với IBA hoặc 2,4-D ở những nồng độ khác nhau có ảnh hưởng đến sự hình thành mô sẹo và hình thái của mô sẹo từ mẫu cấy lá cây Dầu mè (Bảng 2)

Bảng 2 Ảnh hưởng của Kinetin kết hợp với IBA và 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Dầu mè Kinetin

(mg/l)

IBA (mg/l)

2,4-D (mg/l)

Tỉ lệ hình thành

mô sẹo (%) Hình thái mô sẹo

1,5 - 0,5 75,1 b Mềm, dễ vỡ vụn, có nốt hình cầu

Chú thích: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở

mức α = 0,05 trong phép thử DMRT

Kinetin (0,5 – 2,0 mg/l) kết hợp với IBA (0,5 – 1,0 mg/l) có tác dụng cảm ứng sự hình thành

mô sẹo có dạng đặc, chắc, màu từ vàng đến xanh sáng (Hình 1a2) Mô sẹo tăng sinh mạnh mẽ Tuy nhiên, sau khoảng 8 tuần nuôi cấy thì phần bên dưới của khối mô sẹo tiếp xúc với môi trường xuất hiện vùng hóa nâu đen, phần mô sẹo phía trên mất dần màu xanh

Tỉ lệ hình thành mô sẹo trên môi trường có bổ sung Kinetin kết hợp với IBA (37,5 – 65,4%) thấp hơn so với trên môi trường có bổ sung Kinetin kết hợp với 2,4-D (45,2 – 89,3%) Mô sẹo được tạo ra trên môi trường có bổ sung Kinetin (0,5 – 2,0 mg/l) kết hợp với 2,4-D (0,1 – 0,5 mg/l) đều có dạng mềm, dễ vỡ vụn Đặc biệt, trên môi trường có bổ sung Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D có sự xuất hiện của khối mô sẹo cùng với một số cấu trúc hình cầu giống phôi có màu kem sáng (Hình 1a3)

Jha và cộng sự (2007) đã nhận thấy rằng những mẫu cấy lá cây Jatropha curcas được nuôi

cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l Kinetin có sự cảm ứng hình thành mô sẹo cao hơn đáng kể so với các môi trường khác Môi trường này cho thấy sự phát triển các mô sẹo có khả năng phát sinh phôi có nhiều nốt nhỏ màu kem trong khoảng 4 tuần nuôi cấy

Hình 1 Mô sẹo từ lá cây Dầu mè trên các môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau

mg/l 2,4-D; b 1 Mô sẹo trên môi trường bán rắn; b 2 Mô sẹo trong môi trường lỏng tĩnh; b 3 Mô sẹo trên môi

trường lỏng lắc

Ảnh hưởng của khoáng đa lượng lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

Bảng 3 Ảnh hưởng của khoáng đa lượng lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Dầu mè

Thành phần

khoáng đa lượng

Tỉ lệ hình thành

mô sẹo (%)

Trọng lượng tươi mô sẹo (mg)

Số cấu trúc giống phôi Hình thái mô sẹo

Chú thích: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở

mức α = 0,05 trong phép thử DMRT

Sự hấp thu các nguyên tố khoáng từ môi trường nuôi cấy trong quá trình cảm ứng và suốt

giai đoạn đầu phát sinh phôi vô tính đã được chứng minh (Dussert và cs., 1995; Fisichella và cs

2000) Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng thành phần khoáng đa lượng của 7 loại môi trường thường được sử dụng trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào thực vật: MS, MS ½, WPM, B5, White,

SH, Nitsch Mỗi môi trường đều được bổ sung thành phần vi lượng và vitamin của MS, đồng thời

bổ sung thêm 1,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy hầu hết các

197

môi trường đều cảm ứng sự hình thành mô sẹo với tỉ lệ cao Số lượng cấu trúc hình cầu giống phôi

vô tính hình thành nhiều nhất ở mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường có thành phần khoáng đa lượng của MS Không có sự khác biệt đáng kể nào giữa các nghiệm thức khoáng đa lượng khác nhau được ghi nhận ngoại trừ trên môi trường White không có sự hình thành cấu trúc hình cầu giống phôi Trên môi trường White, tất cả các mẫu cấy đều phát triển thành mô sẹo mềm, kết cấu xốp và dễ vỡ vụn mà không có sự hiện diện của cấu trúc giống phôi nào (Bảng 3)

Sự kết hợp các thành phần khoáng đa lượng cảm ứng sự phát sinh phôi vô tính hiệu quả nhất đối với cây Cọc rào là môi trường MS Kết quả này có thể do hàm lượng nitơ trong môi trường cao,

ít nhất là gấp hai lần so với những môi trường khác; một nguyên nhân khác có thể là do sự cân bằng giữa nitrate và ammonium trong môi trường nuôi cấy Như được chỉ ra trong Bảng 1, môi trường

MS có chứa 60 mM nitơ trong đó hàm lượng NO3

chiếm 39,4 mM và hàm lượng NH4+ chiếm 20,6

mM trong khi trong tất cả các môi trường khác, hàm lượng nitơ không vượt quá 30 mM Kết quả phân tích tương quan tuyến tính cũng chỉ ra mối quan hệ giữa hàm lượng nitơ trong môi trường và đáp ứng phát sinh phôi ở cây Dầu mè (Biểu đồ 1) Có một sự tương quan mạnh được ghi nhận giữa

số lượng cấu trúc giống phôi trung bình trên mỗi mẫu lá và hàm lượng nitơ tổng trong các môi trường khác nhau (R2

= 0,7284)

y = 0.0686x + 1.0291

R2 = 0.7284

0 1 2 3 4 5 6

Hàm lượng nitơ tổng (mM)

Biểu đồ 1 Mối tương quan giữa hàm lượng nitơ tổng (mM) trong các môi trường nuôi cấy và sự hình thành

các cấu trúc hình cầu giống phôi

Kết quả tương tự cũng đã được báo cáo trên 2 dòng sắn (Manihot esculenta), sự hình thành

cấu trúc giống phôi đạt được trên môi trường MS lớn hơn so với trên môi trường SH, WPM hay B5

(Taylor và cs., 1996) Hơn nữa, việc loại bỏ NH4+ hay NH4NO3 ra khỏi môi trường MS làm giảm sự hình thành những cấu trúc phôi Sự phát sinh phôi vô tính trên môi trường SH thấp hơn so với trên

môi trường MS (Trigiano và cs., 1992) nhưng khi bổ sung NH4+ vào môi trường SH làm kích thích

sự phát sinh phôi ngang bằng với trên môi trường MS Môi trường MS cũng hiệu quả hơn trong

việc cảm ứng phát sinh khối mô sẹo có khả năng phát sinh phôi ở cây Pistacia vera so với môi trường WPM (Onay và cs., 1995) và trong nuôi cấy bao phấn cây Helianthus annuus, môi trường

MS cũng gây ra đáp ứng phát sinh phôi tốt hơn môi trường Nitsch, B5 và White (Thengane và cs.,

1994) Tác động kích thích của nguồn nitơ khử trong môi trường lên sự phát sinh phôi vô tính cũng được ghi nhận trong quá trình nuôi cấy cỏ Linh lăng trên môi trường SH có bổ sung thêm muối ammonium (Walker và Sato, 1981)

Bên cạnh hàm lượng nitơ tổng, có thể nhận thấy rằng sự khác biệt về khả năng hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi còn chịu ảnh hưởng bởi hàm lượng ion K+

và Ca2+ Ion K+ liên quan đến bơm proton và trong sự vận chuyển gián tiếp các chất hòa tan (Briskin và Hanson, 1992) có thể

là yếu tố giới hạn sự phát sinh phôi vô tính Vì vậy, trong nuôi cấy huyền phù Cà rốt, hàm lượng potassium thấp trong môi trường nuôi cấy làm hạn chế sự hình thành phôi vô tính mà không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng tế bào trong khi hàm lượng potassium cao làm tăng mạnh số lượng phôi

(Brown và cs., 1976) Sự phát sinh phôi vô tính cũng có thể chịu ảnh hưởng bởi calcium Ca2+ hoạt động như là một tín hiệu thứ cấp trong con đường truyền tín hiệu kích thích ngoại bào bằng cách gắn với calmodulin hay các protein gắn calcium khác để kiểm soát nhiều đáp ứng sinh lý tế bào (Bush, 1995) Ở Cà rốt, sự phân cực hình thái của các cụm tế bào sinh phôi kết hợp với Ca2+

nội bào

tự do (Timmers và Schel, 1991) Hơn nữa, sự gia tăng hàm lượng CaCl2 trong môi trường cảm ứng hình thành số lượng phôi nhiều hơn (Silva và Ricardo, 1992)

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo có khả năng phát sinh phôi

Trong thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng các nhân tố môi trường như trạng thái vật lý của môi trường và điều kiện khí oxy hòa tan có những ảnh hưởng chuyên biệt trong sự cảm ứng tạo các cấu trúc hình cầu giống phôi và gia tăng sự phát sinh phôi từ mô sẹo

Sinh khối mô sẹo mang đi nuôi cấy trong môi trường lỏng tĩnh tăng sinh rất chậm so với trong môi trường thạch rắn và môi trường lỏng lắc (Bảng 4); không những vậy, cấu trúc mô sẹo từ nuôi cấy lỏng tĩnh cũng không có khả năng phát triển thành những khối hình cầu có cấu trúc giống phôi (Hình 1b2)

Bảng 4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo sinh phôi

Điều kiện

nuôi cấy

Trọng lượng tươi mô sẹo (mg)

Số cấu trúc giống phôi Hình thái mô sẹo

trúc hình cầu

hình cầu

Chú thích: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở

mức α = 0,05 trong phép thử DMRT

Sự gia tăng sinh khối mạnh mẽ của cụm mô sẹo trên môi trường đặc so với môi trường lỏng tĩnh trong một thời gian ngắn là rất đáng được ghi nhận (Bảng 4) Hoạt động phân chia của cụm mô sẹo trên môi trường bán rắn rất tốt, khi được nuôi cấy ngoài sáng, các tế bào mô sẹo sinh tổng hợp diệp lục tốt, có màu xanh mướt và có sự hình thành những cấu trúc hình cầu từ rất sớm (sau 20 ngày nuôi cấy) (Hình 1b1)

Mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút phát triển thành các khối tế bào có màu vàng kem, hơi rời rạc, bề mặt dạng nốt, có thể nhận thấy rõ sự xuất hiện của những cấu trúc tiền phôi hình cầu có đường kính lớn khoảng 1 mm (Hình 1b3) Số lượng cấu trúc giống phôi trong môi trường lỏng tĩnh (10,2 phôi hình cầu/mẫu mô sẹo) tăng đáng kể

so với trên môi trường rắn (4,5 phôi hình cầu/mẫu mô sẹo) tuy nhiên khả năng gia tăng sinh khối vẫn không có sự khác biệt đáng kể Sau 30 ngày, thể tích môi trường giảm dần, có thể do môi trường bốc hơi và do sự hấp thu dinh dưỡng lỏng của mẫu cấy để tiếp tục tăng sinh, do đó phải tiến hành cấy chuyền trên cùng loại môi trường Trong suốt thời gian cấy chuyền này, các tế bào liên tục trải qua các chu kỳ phân chia tế bào để cuối cùng có thể đạt đến trạng thái sinh phôi Ngoài ra, việc duy trì khối mô sẹo trong môi trường cảm ứng trong một thời gian dài không chỉ có tác dụng cảm ứng tế bào sang trạng thái sinh phôi, mà còn có thể duy trì và gia tăng khả năng sinh phôi của mẫu cấy

Sự trưởng thành, biệt hóa và nảy mầm của phôi vô tính

Mô sẹo với các khối tiền phôi được tách thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trường có bổ sung Kinetin và 2,4-D ở nồng độ thấp hơn cho thấy những kết quả khác nhau (Bảng 5)

Bảng 5 Ảnh hưởng của Kinetin và 2,4-D lên sự trưởng thành và biệt hóa phôi Kinetin

(mg/l)

2,4-D (mg/l)

Tỉ lệ phát sinh phôi (%)

Số lượng phôi ở các giai đoạn Hình cầu Hình tim Hình thủy lôi Lá mầm

Kết quả được chỉ ra cho thấy tần suất mô sẹo phát sinh phôi vô tính hình cầu cao nhất (82%) được ghi nhận trên môi trường có sự kết hợp 1,0 mg/l Kinetin và 0,05 mg/l 2,4-D sau 4 – 6 tuần nuôi cấy

199

Hình 2 Sự trưởng thành, biệt hóa và nảy mầm của phôi vô tính Dầu mè

a 1 Phôi hình cầu; a 2 Phôi hình tim; a 3 Phôi hình thủy lôi; a 4 Phôi giai đoạn lá mầm; b Hình thái giải phẫu

phôi vô tính Dầu mè; c Cây con nảy mầm từ phôi; d Cây con ngoài vườn ươm

Khi chuyển mô sẹo có các khối tiền phôi sang môi trường chỉ bổ sung 1,0 mg/l Kinetin, chúng tôi nhận thấy có những thay đổi đáng kể từ phần sinh khối tiền phôi về màu sắc và kết cấu, đặc biệt

là những biểu hiện phát triển biệt hóa rất nhanh chóng của phôi vô tính trên môi trường này Kết quả giải phẫu hình thái phôi vô tính cho thấy có sự hình thành của các cấu trúc lưỡng cực gồm những tế bào nhỏ, tế bào chất đậm đặc, bắt màu đậm (Hình 2b)

Vai trò của cytokinin và auxin trong các giai đoạn phát sinh phôi vô tính khác nhau đã được

báo cáo (Fujimura và Komamine, 1980; Lo Schiavo và cs., 1989; Litz và Gray, 1995) Sự kết hợp

của auxin và cytokinin trong nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu phát sinh phôi

vô tính ở cây Coffea Arabica (Neuenschwnader và Baumann, 1992) Cụm phôi vô tính hình cầu có

thể được quan sát trong suốt 2 – 3 tuần đầu trên môi trường tăng sinh phôi Phôi vô tính hình cầu có màu kem, tròn và có tổ chức cao được biệt hóa từ phần rìa của khối mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy Chúng bám vào khối mô sẹo có khả năng phát sinh phôi trong khi phần còn lại của mô sẹo vẫn trắng và hơi mờ Phôi vô tính hình cầu được cấy chuyền sang môi trường tăng sinh phôi tương tự dần dần chuyển sang các giai đoạn phôi hình tim, hình thủy lôi và giai đoạn lá mầm với 2 cực rõ ràng so với phôi hình cầu chiếm đa số trong quá trình nuôi cấy (Hình 2a)

Bảng 6 Hàm lượng hormone nội sinh trong phôi vô tính Dầu mè ở những giai đoạn phát triển khác nhau

Hormone nội sinh

Nồng độ

Chú thích: (*) ND – Không phát hiện ở mức LOD (giới hạn phát hiện) = 0,1 mg/kg

Kết quả phân tích hàm lượng hormone nội sinh trong phôi vô tính ở những giai đoạn khác nhau cho thấy ở giai đoạn phôi hình cầu, hàm lượng cytokinin nội sinh rất cao, tuy nhiên không phát hiện thấy có sự hiện diện của auxin nội sinh (Bảng 6) Điều này có thể do trong những giai đoạn cảm ứng mô sẹo trước đó đã sử dụng 2,4-D ở nồng độ tương đối cao nên các tế bào đã sử dụng 2,4-D thay thế cho vai trò của IAA nội sinh Khi phôi vô tính phát triển sang những giai đoạn tiếp theo, hàm lượng cytokinin nội sinh giảm dần Đến giai đoạn xuất hiện lá mầm, hàm lượng Zeatin chỉ còn lại rất thấp (26,9 μg/kg)

Phôi vô tính trưởng thành được nuôi cấy trên môi trường nảy mầm không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng trong 2 tuần để kích thích phát triển thành cây con hoàn chỉnh có chồi và rễ Ban đầu, cây con phát triển tốt với nhiều lá xanh Phôi vô tính được tạo thành cũng như đã nảy mầm xuất hiện lẫn lộn trong đám mô sẹo, do đó một động tác tách các phôi đã nảy mầm để cấy sang môi trường mới cho cây con phát triển hoàn chỉnh và mạnh khỏe là điều cần thiết Sau khi được cấy sang môi trường mới, rễ mầm bắt đầu được kéo dài Dần dần, cây phát triển nên một hệ thống rễ dày đặc và khỏe, bộ rễ đâm thẳng xuống môi trường thạch (Hình 2c) Hệ rễ phát triển khỏe mạnh hút chất dinh dưỡng trong môi trường cung cấp cho cây tăng trưởng và phát triển chồi Thời gian

các phôi vô tính trong cùng một mẫu mô sẹo nảy mầm cũng khác nhau Tuy nhiên, sau 45 ngày thì

tỷ lệ nảy mầm của các phôi vô tính là 70% Như vậy, phôi vô tính Dầu mè được tạo thành gián tiếp thông qua giai đoạn tạo mô sẹo dưới sự tác động của Kinetin và 2,4-D cho thấy có sự nảy mầm tốt, ngoài ra cây con tạo thành không có những biểu hiện gì bất thường

KẾT LUẬN

Cây Dầu mè là một trong những loại cây trồng đa mục đích mang lại hiệu quả kinh tế cao, nhất là đối với những nước đang phát triển như Việt Nam Đã có nhiều nghiên cứu trong việc tái sinh loài cây trồng có giá trị này Tuy nhiên, kết quả đạt được trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mẫu cấy lá là một loại mô cấy thích hợp để nhân giống cây Dầu mè thông qua con đường phát sinh phôi vô tính Kết quả đạt được là tiền đề cho những nghiên cứu chuyển gene trong tương lai nhằm nâng cao sản lượng quả và hàm lượng dầu trong quả phục vụ cho ngành công nghiệp năng lượng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Briskin D, Hanson JB (1992) How does the plant plasma membrane HC-ATPase pump protons J

Exp Bot 43: 269-289

Brown S, Wetherell DF, Dougall DK (1976) The potassium requirement for growth and

embryogenesis in wild carrot suspension cultures Physiol Plant 37: 73-79

Bush DS (1995) Calcium regulation in plant cells and its role in signalling Annu Rev Plant

Physiol Plant Mol Biol 46: 95-122

Duncan DB (1995) Multiple range and Multiple F tests Biometrics 11(1): 1-5

Dussert S, Verdeil JL, Buffard-Morel J (1995) Specific nutrient uptake during initiation of somatic

embryogenesis in coconut calluses Plant Sci 111: 229-236

Fisichella M, Silvi E, Morini S (2000) Regeneration of somatic embryos and roots from quince

leaves cultured on media with different macroelement composition Plant Cell Tis Org Cult 63:

101-107

Fujimura T, Komamine A (1980) Mode of action of 2,4-D and zeatin on somatic embryogenesis in

carrot suspension culture Z Pflazenphysiol 99: 1-8

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean

root cells Exp Cell Res 50: 151-158

George EF, Sherrington PD (1984) Plant Propagation by Tissue Culture Edington, UK; Exegetics

Ltd

Heller J (1996) Physic nut, Jatropha curcas L International Plant Genetic Resource Institute,

Rome: 1-66

Jha TB, Mukherjee P, Datta MM (2007) Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Linn., an important biofuel plant Plant Biotech Rep 1: 135-140

Litz RE, Gray DJ (1995) Somatic embryogenesis for agricultural improvement World J Microbiol

Biotechnol 11: 416-425

Lloyd G, McCown BH (1980) Commercially feasible micropropagation of mountain laurel (Kalmia

latifolia) by use of shoot tip culture Int Plant Prop Soc, Comb Proc 30: 421-427

Lo Schiavo F (1989) DNA methylation of embryogenic carrot cell cultures and its variations as

caused by mutation, differentiation, hormones and hypomethylating drugs Theor Appl Genet 77:

325-331

Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue

cultures Physiol Plant 15: 473-479

Neuenschwander B, Baumann TW (1992) A novel type of somatic embryogenesis in Coffea

arabica Plant Cell Rep 10: 608-612

Nitsch JP, Nitsch C (1969) Haploid plants from pollen grains Science 163: 85-87

Onay A, Jeffree CE, Yeoman MM (1995) Somatic embryogenesis in cultured immature kernels of

Pistachio (Pistacia vera L) Plant Cell Rep 15: 192-195

201

Openshaw K (2000) A review of Jatropha curcas: an oil plant of unfulfilled promise Biomass

Bioener 19: 1-15

Prabakaran AJ, Sujatha M (1999) Jatropha tanjorensis Ellis and Saroja, a natural interspecific hybrid occurring in Tamil Nadu, India Genet Resour Crop Evol 46(3): 213-218

Rajore S, Batra A (2005) Efficient plant regeneration via shoot tip explant in Jatropha curcas J

Plant Biochem Biotech 14: 73-75

Sardana J, Batra A, Ali DJ (2000) An expeditious method for regeneration of somatic embryos in

Jatropha curcas L Phytomorphology 50: 239-242

Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of

monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures Can J Bot 50: 199-204

Shrivastava S, Banerjee M (2008) In vitro clonal propagation of physic nut (Jatropha curcas L.): Influence of additives Inter J Integrative Bio 3(1): 73-79

Silva P, Ricardo CPP (1992) Beta-fructosidases and in vitro dedifferentiation-redifferentiation of carrot cells Phytochem 31: 1507-1511

Sujatha M, Makkar HPS, Becker K (2006) Shoot bud proliferation from axillary nodes and leaf

sections of non-toxic Jatropha curcas L Plant Grow Reg 47: 83-90

Sujatha M, Mukta N (1996) Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha

curcas Plant Cell Tis Org Cult 44: 135-141

Taylor NJ, Edwards M, Kiernan RJ, Davey CDM, Blakesley D, Henshaw GG (1996) Development

of friable embryogenic callus and embryogenic suspension culture systems in cassava (Manihot

esculenta Crantz) Nature Bio 14: 726-730

Thái Xuân Du, Nguyễn Văn Uyển (2006) Triển vọng sản xuất dầu diesel từ cây Cọc rào (Jatropha

curcas L.) ở Việt Nam Hội thảo: Nhiên liệu sinh học ở Việt Nam, tiềm năng và cơ hội phát triển, NXB Khoa học và kỹ thuật, 88-94

Thengane SR, Joshi MS, Khuspe SS, Mascarenhas AF (1994) Anther culture in Helianthus annuus

L., influence of genotype and culture conditions on embryo induction and plant regeneration

Plant Cell Rep 13: 222-226

Timmers ACJ, Schel JHN (1991) Localization of cytosolic Ca2+ during carrot somatic embryogenesis using confocal scanning laser microscopy In: Karsenn CM, van Loon LC,

Vreugdenhil D (eds) Progress in Plant Growth Regulation Dordrecht: Kluwer Academic

Publishers 347–353

Trigiano RN, May RA, Conger BV (1992) Reduced nitrogen influences somatic embryo quality and

plant regeneration from suspension cultures of orchardgrass In Vitro Cell Dev Biol 28: 187-191 Walker KA, Sato SJ (1981) Morphogesis in callus tissue of Medicago sativa: the role of ammonium ion in somatic embryogenesis Plant Cell Tiss Org Cult 1: 109-121

White PR (1963) The Cultivation of Animal and Plant Cells, 2nd edn New York: Ronald Press