Báo cáo " ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỐI KHÁNG VI KHUẨN Vibrio spp. VÀ NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG ẤU TRÙNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) BẰNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN HỦY N-HEXANOYL HOMOSERINE LACTONE " pot

Đánh giá mức độ an toàn của các gốc vi khuẩn khảo sát đối với ấu trùng cá chẽm Từ kết quả hai thí nghiệm trên, các gốc vi khuẩn có khả năng phân hủy HHL tốt hoặc/và đối kháng với Vibrio

ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỐI KHÁNG VI KHUẨN Vibrio spp VÀ NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG ẤU TRÙNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) BẰNG

CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN HỦY N-HEXANOYL HOMOSERINE

LACTONE

Phạm Minh Nhựt (1) , Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2)

(1)

Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM, Việt Nam; (2) Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy Sản II

ABSTRACT

Twenty nine isolates from sea bass (Lates calcarifer) and black tiger shrimp (Penaeus monodon) were tested to evaluate ability to degrade HHL, for Vibrio spp antogonism in vitro, safety and protection of sea bass larvae against Vibrio spp infection in in vivo condition within 48 hours, and survival rate improvability of sea

bass larvae in pilot hatchery scale Among 29 tested isolates, fifteen were able to

degrade HHL at medium to high level, and/or to antagonise Vibrio spp These fifteen

isolates were tested for the safety to sea bass larvae Only nine isolates (six from sea bass and three from black tiger shrimp) were safe toward sea bass larvae during of 48 hours However, these nine isolates did not have ability to protect sea bass larvae in

Vibrio spp experimental infection In pilot scale hatchery condition, three isolates from

black tiger shrimp could not improve survival rate of sea bass larvae In contrast, five among six isolates from sea bass showed positive effect on survival of sea bass larvae after 30 day of hatchery

Keywords: cá chẽm, N-hexanoyl homoserine lactone, tính đối kháng, Vibrio spp

GIỚI THIỆU

Trong hơn 30 năm trở lại đây, ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang trên đà phát triển rất mạnh với sản lượng không chỉ đáp ứng cho nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu ra các nước trên toàn thế giới Chính vì thế, nhu cầu về nguồn giống sạch bệnh và đạt chất lượng để cung cấp cho các trang trại nuôi trồng thủy sản rất lớn Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất giống, bệnh do vi sinh vật gây ra đang là một vấn đề quan trọng, gây chết ấu trùng hàng loạt, dẫn đến sự tổn thất nghiêm trọng của các trại sản xuất Bệnh do vi khuẩn gây ra trên ấu trùng cá chẽm đã làm ảnh hưởng đến khả năng cung cấp nguồn giống đạt chất lượng cho các trang trại và trực tiếp ảnh hưởng đến năng suất thủy hải sản

Trước thực tế đó, để có thể tồn tại và đáp ứng được nhu cầu cấp thiết về nguồn giống, các trang trại sản xuất giống đã sử dụng một số biện pháp để phòng và trị các bệnh do vi sinh vật như sử dụng kháng sinh, hóa chất Chính vì việc sử dụng kháng sinh, hóa chất tràn lan như hiện nay đã dẫn đến tình trạng dư lượng kháng sinh trong sản phẩm đầu ra Bên cạnh đó, khả năng tạo ra các chủng vi sinh vật kháng thuốc, khi đó hậu quả của ngành nuôi trồng thủy sản sẽ rất lớn

Đứng trước thực trạng đó, các giải pháp sinh học đã được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng để kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản Một trong những hướng nghiên cứu nhiều triển vọng nhất là sử dụng các chế phẩm probiotics để phòng các bệnh do vi sinh vật Ở Việt Nam, probiotics đã được sử dụng rộng rãi trong thời gian gần đây nhưng nguồn cung cấp probiotics do các công ty sản xuất thường không rõ nguồn gốc xuất xứ Do đó, việc nghiên cứu và phân lập các chế phẩm vi sinh ở điều kiện Việt Nam đã được tiến hành trong thời gian gần đây và bước đầu đã thu được những kết quả đáng kể

Hiện nay, cá chẽm (Lates calcarifer) là đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam

Tuy nhiên, tỷ lệ sống của ấu trùng của đối tượng này không cao, không ổn định và mẫn cảm với các

tác nhân gây bệnh (chủ yếu là nhóm Vibrio) Việc sử dụng kháng sinh không mang lại hiệu quả cao

trong phòng bệnh do vi sinh vật mà lại làm tăng khả năng kháng thuốc Trong thời gian gần đây, một số nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện một số vi khuẩn có khả năng ức chế các phân tử tín hiệu ―quorum sensing‖ (các phân tử do vi khuẩn tiết ra dùng trong quá trình giao tiếp và có liên

quan đến độc lực của vi khuẩn gây bệnh) Vì vậy, việc phân lập các chủng vi khuẩn có các đặc tính nói trên và sử dụng trong quá trình nuôi trồng thủy sản, đặc biệt trong công tác sản xuất giống sẽ có

ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh và nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng

cá biển

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các gốc vi khuẩn thí nghiệm

Các chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm được phân lập từ đường ruột của cá chẽm, tôm

sú thương phẩm và tôm post larvae khỏe mạnh Và chúng được phân lập dựa trên khả năng phân hủy phân tử tín hiệu AHL

Đánh giá khả năng phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn

Các gốc vi khuẩn được nuôi cấy trong các bình bình tam giác có chứa 10 ml môi trường LB

có bổ sung HHL với nồng độ 5 ppm Mật độ vi khuẩn khảo sát sử dụng lần lượt là 105

, 106 cfu/ml Mỗi gốc vi khuẩn được thực hiện lặp lại 3 lần tương ứng với mỗi nồng độ Các bình tam giác ủ lắc với tốc độ 120 vòng/phút Tốc độ phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn được đánh giá ở các thời điểm 0, 3, 6, 9 và 12 giờ sau khi nuôi cấy

Tại mỗi thời điểm thu mẫu, hút 1 ml dịch vi khuẩn từ mỗi bình tam giác cho vào 1 eppendorf

vô trùng Tiến hành ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ sinh khối vi khuẩn

Sau đó, lấy 10 μl dịch lọc này cho vào giữa đĩa môi trường LB agar đã tráng sẵn 50 l vi

khuẩn C violaceum với mật độ 106

cfu/ml và tiến hành ủ trong 24 giờ Tiến hành đo đường kính vòng tròn sắc tố violacein và tính toán nồng độ HHL còn lại tại mỗi thời điểm

Đánh giá đặc tính đối kháng của các gốc vi khuẩn đối với Vibrio spp

Các gốc Vibrio spp sử dụng trong thí nghiệm này là V harveyi BB120, V parahaemolyticus

và V alginolyticus

Đánh giá tính đối kháng của sinh khối vi khuẩn đối với Vibrio spp

Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong môi trường TSB Mật độ vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm này là 106

cfu/ml Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Mật độ Vibrio spp

sử dụng là 105

cfu/ml

Các gốc vi khuẩn khảo sát sau khi nuôi cấy trên môi trường TSB được pha loãng để có được mật độ 106

cfu/ml Sau đó 50 l dịch này được cấy trải trên môi trường TSA bổ sung NaCl Đem ủ

ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ

Các chủng Vibrio spp được xác định mật độ rồi tiến hành cấy trải 50 l trên môi trường TSA

bổ sung NaCl Chờ cho đĩa thạch thật khô, sử dụng một ống trụ đường kính 5 mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch

Đối với các đĩa thạch chứa vi khuẩn khảo sát sau khi nuôi cấy, chọn những vùng vi khuẩn phát triển dầy đặc, tiến hành đục 9 khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn Dùng kẹp vô trùng gắp từng

khối thạch đặt vào trong các giếng trên đĩa đã trải các chủng Vibrio spp Đem ủ ở nhiệt độ 300

C trong 24 giờ Sau thời gian 24 giờ, đo các vòng kháng khuẩn xung quanh các giếng thạch

Đánh giá tính đối kháng của dịch sau ly tâm vi khuẩn đối với Vibrio spp

Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong môi trường TSB có bổ sung NaCl Mật độ

vi khuẩn sử dụng là 106

cfu/ml Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Mật độ Vibrio spp sử dụng lần

lượt là 105

cfu/ml

Các gốc vi khuẩn khảo sát được nuôi trong môi trường TSB bổ sung NaCl trên tủ ấm lắc trong

24 giờ Sau đó, xác định mật độ và tiến hành pha loãng để có được mật độ 106

cfu/ml Cấy chuyển

50 l vào bình tam giác chứa môi trường TSB bổ sung NaCl và nuôi cấy trong tủ ấm lắc nhiệt độ

300C trong 24 giờ

Đối với các chủng Vibrio spp., tiến hành cấy chuyển sang môi trường TSB bổ sung NaCl và

nuôi cấy trong tủ ấm lắc nhiệt độ 300C trong 24 giờ

Sau 24 giờ nuôi cấy, hút 1 ml dịch vi khuẩn cho vào eppendorf vô trùng đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ sinh khối vi khuẩn và lấy dịch nổi

Đối với các chủng Vibrio spp sau khi xác định mật độ, tiến hành cấy trải 50 l trên môi trường TSA bổ sung NaCl Chờ cho đĩa khô, dùng một ống trụ đường kính 5 mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch

Hút 100 l dịch nổi sau khi ly tâm cho vào các lỗ thạch sau khi đục Sau đó, đem ủ ở nhiệt độ

300C trong 24 giờ Sau 24 giờ đo các vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch

Đánh giá mức độ an toàn của các gốc vi khuẩn khảo sát đối với ấu trùng cá chẽm

Từ kết quả hai thí nghiệm trên, các gốc vi khuẩn có khả năng phân hủy HHL tốt hoặc/và đối

kháng với Vibrio spp trong điều kiện in vitro được chọn lựa Những gốc này được đánh giá mức độ

an toàn đối với ấu trùng cá chẽm

Thí nghiệm được bố trí trong các khay có 6 ô, mỗi ô chứa 10 ml nước biển vô trùng với mật

độ ấu trùng cá chẽm là 5 con/ô Mỗi gốc vi khuẩn được tiến hành lặp lại 6 lần Thí nghiệm được bố trí gồm 16 nghiệm thức trong đó có 1 nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn và 15 nghiệm thức có bổ sung riêng lẻ từng loại vi khuẩn khảo sát

Các gốc vi khuẩn khảo sát được bổ sung vào trong các giếng (6 giếng/ một gốc vi khuẩn) với các mật độ 106

cfu/ml và chỉ bổ sung một lần Trong suốt quá trình thí nghiệm, không cho ấu trùng

cá chẽm ăn Tiến hành theo dõi tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm tại thời điểm 48 giờ

Đánh giá tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm của các gốc vi khuẩn khảo sát khi gây nhiễm với Vibrio

spp

Kết thúc thí nghiệm 3, chỉ có những gốc vi khuẩn đạt mức độ an toàn đối với ấu trùng cá chẽm sau thời gian 48 giờ được sử dụng tiếp cho thí nghiệm này

Thí nghiệm được bố trí trong các khay nhựa, mỗi khay có 6 ô và mỗi ô được bố trí thể tích nước biển vô trùng là 50 ml Mỗi nghiệm thức được bố trí lặp lại 6 lần Mật độ ấu trùng cá chẽm là

5 con/1 ô Thí nghiệm được bố trí gồm 10 nghiệm thức trong đó có 1 nghiệm thức đối chứng chỉ bổ

sung vi khuẩn Vibrio spp và 9 nghiệm thức bổ sung cả Vibrio spp và các gốc vi khuẩn riêng lẻ

khảo sát Không cho cá ăn trong thời gian thí nghiệm Sục khí nhẹ một lần mỗi ngày sau khi đã đếm xong ấu trùng cá còn sống và đã loại bỏ ấu trùng cá chết

Vi khuẩn khảo sát được sử dụng với mật độ 107

cfu/ml và các chủng Vibrio spp được sử dụng

ở mật độ 108

cfu/ml Các chủng Vibrio spp được bổ sung vào sau khi bổ sung vi khuẩn khảo sát 6

giờ

Tiến hành theo dõi tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm sau 24 giờ và 48 giờ sau khi bổ sung vi khuẩn và tiến hành đánh giá tỷ lệ sống sót của ấu trùng cá chẽm tại các thời điểm

Đánh giá hiệu quả nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm của các gốc vi khuẩn khảo sát ở điều kiện bể ương

Kết thúc các thí nghiệm in vitro và in vivo, chúng tôi đã chọn lọc được 9 gốc vi khuẩn Ch101,

Ch102, Ch104, Ch201, Ch501, Ch601, T207, T401 và T402 phân lập từ cá chẽm và tôm sú Tuy nhiên, do khối lượng công việc khá lớn và điều kiện thí nghiệm hạn chế nên thí nghiệm không được tiến hành trong 1 đợt và phải được tiến hành trong 3 đợt thí nghiệm, mỗi đợt được tiến hành với 3 gốc vi khuẩn

Ở mỗi đợt, vi khuẩn khảo sát được bổ sung trực tiếp vào trong nước trước khi cho trứng vào

ấp và hai ngày một lần trực tiếp vào nước nuôi với mật độ vi khuẩn là 105

cfu/ml Song song đó, vi khuẩn khảo sát cũng được làm giàu qua thức ăn tự nhiên (rotifer và artemia) với mật độ vi khuẩn

105 cfu/ml trước khi cho cá ăn

Không bổ sung vi khuẩn ở nghiệm thức đối chứng Sử dụng một gốc vi khuẩn cho mỗi nghiệm thức và ở mỗi đợt nghiệm thức 5 là hỗn hợp của 3 gốc vi khuẩn khảo sát ở mỗi đợt Mỗi nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần

Thí nghiệm được bố trí trong các bể composite 0,5 m3

trên ấu trùng cá chẽm mới nở với mật

độ là 30 con/lít Nước biển phải được xử lý trước khi sử dụng Chế độ chăm sóc, quản lý và cho ăn được áp dụng theo đúng quy trình ương cá chẽm của Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam Bộ Đánh giá tỷ lệ sống ở các nghiệm thức vào ngày thứ 30 Theo dõi hoạt động cá hằng ngày và biểu hiện bệnh (nếu có)

Theo dõi chỉ tiêu vi sinh: Vibrio tổng số trong nước

Theo dõi các chỉ tiêu môi trường: nhiệt độ, pH, NH3-N, NO2-N

Vào cuối đợt thí nghiệm, tất cả các bể ương cá và bể nhân sinh khối vi khuẩn đều phải được

xử lý kỹ bằng chlorine

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Đánh giá khả năng phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn

Tiến hành khảo sát sự phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn ở mật độ 105

và 106 cfu/ml Mục tiêu của thí nghiệm này nhằm đánh giá khả năng phân hủy phân tử HHL theo thời gian

Khả năng phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn căn cứ vào đường kính vòng tròn sắc tố violacein màu xanh hình thành trong quá trình thí nghiệm Từ kết quả đó, dựa vào đường tương quan tuyến tính để tính toán nồng độ HHL còn lại trong mẫu sau mỗi thời điểm thu mẫu

Kết quả đánh giá mức độ phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn khảo sát tại thời điểm 12 giờ được thể hiện ở Bảng 1

Bảng 1: Mức độ phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn phân lập từ cá chẽm tại thời điểm 12 giờ

STT Ký hiệu vi khuẩn Phân hủy HHL

Trong đó (+++): các gốc vi khuẩn phân hủy HHL mạnh (nồng độ HHL bằng 0 tại thời điểm 12 giờ)

(++): các gốc vi khuẩn phân hủy HHL trung bình (nồng độ HHL nhỏ hơn 1 ppm tại thời điểm 12

giờ)

(+): các gốc vi khuẩn phân hủy HHL yếu (nồng độ HHL lớn hơn 1 ppm tại thời điểm 12 giờ)

Dựa vào kết quả phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn khảo sát, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các gốc vi khuẩn khảo sát đều có khả năng phân hủy HHL theo thời gian, tuy nhiên, khả năng phân hủy HHL của chúng rất khác nhau Nhìn chung, mức độ phân hủy HHL ở mật độ vi khuẩn ban đầu

105 cfu/ml là cao hơn so với mật độ vi khuẩn ban đầu là 106 cfu/ml Chúng tôi cũng nhận thấy rằng khả năng phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn ở mật độ vi khuẩn 105

cfu/ml và 106 cfu/ml có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P < 0,05) Điều này là do trong cùng một thể

tích thí nghiệm, mật độ vi khuẩn càng cao thì càng dễ xảy ra khả năng ức chế lẫn nhau, chính vì thế khả năng phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn ở mật độ 106

cfu/ml không thể mạnh bằng ở mật độ

105 cfu/ml

Tinh và ctv (2007b) đã nghiên cứu các gốc vi khuẩn EC được phân lập từ tôm thẻ chân trắng

(Penaeus vannamei) và thí nghiệm được bố trí trong 48 giờ với nồng độ HHL ban đầu là 5 ppm,

mật độ vi khuẩn bổ sung là 106

cfu/ml Kết quả của thí nghiệm các gốc vi khuẩn EC này phân hủy HHL hoàn toàn ở thời gian 48 giờ trong đó gốc có khả năng phân hủy HHL tốt nhất cũng chỉ phân hủy HHL hoàn toàn ở 24 giờ Trong khi đó, những gốc phân lập từ cá chẽm, tôm sú và post larvae ở điều kiện thí nghiệm của chúng tôi lại phân hủy HHL hoàn toàn trong thời gian 12 giờ ở mật độ vi khuẩn là 105

cfu/ml

Đánh giá đặc tính đối kháng của các gốc vi khuẩn khảo sát đối với Vibrio spp

Đặc tính đối kháng của sinh khối vi khuẩn đối với Vibrio spp

Kết quả đặc tính đối kháng của sinh khối vi khuẩn đối với Vibiro spp được trình bày ở

Bảng 2 Mức độ đối kháng của sinh khối các gốc vi khuẩn khảo sát đối với Vibrio spp

Ký hiệu vi khuẩn V alginolyticus V parahaemolyticus V harveyi BB120

Trong đó (++): các gốc vi khuẩn đối kháng với Vibrio spp mạnh (đường vòng kháng khuẩn lớn hơn hoặc

bằng 15 mm)

(+): các gốc vi khuẩn đối kháng với Vibrio spp yếu (đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ hơn 15

mm và lớn hơn 5 mm)

(-): các gốc vi khuẩn không đối kháng với Vibrio spp (không tạo vòng kháng khuẩn)

Từ Bảng 2, chúng tôi nhận thấy rằng trong số các gốc vi khuẩn khảo sát thì chỉ có 7 gốc vi

khuẩn (Ch102, Ch104, Ch201, Pl101, T207, T401 và T402) có đặc tính đối kháng với Vibrio spp

Cả 7 gốc này đều có đặc tính kháng lại V alginolyticus qua việc hình thành vòng tròn kháng khuẩn

xung quanh lỗ thạch Tuy nhiên, trong số các gốc vi khuẩn này, thì chỉ có gốc vi khuẩn T402 hình

thành vòng tròn kháng khuẩn đối với cả 3 chủng Vibrio spp., trong đó vòng tròn kháng V alginolyticus là lớn nhất Điều này chứng tỏ T402 có khả năng ức chế sự phát triển cả 3 gốc Vibrio

khảo sát

Đặc tính đối kháng của dịch nổi sau khi ly tâm vi khuẩn đối với Vibrio spp

Đặc tính đối kháng của dịch nổi sau khi ly tâm vi khuẩn đối với Vibrio spp được trình bày ở

Bảng 3

Bảng 3: Mức độ đối kháng của dịch sau khi ly tâm các gốc vi khuẩn khảo sát đối với Vibrio spp

Ký hiệu vi khuẩn V alginolyticus V parahaemolyticus V harveyi BB120

Trong đó (++): các gốc vi khuẩn đối kháng với Vibrio spp mạnh (đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn

hoặc bằng 15 mm)

(+): các gốc vi khuẩn đối kháng với Vibrio spp yếu (đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ hơn 15

mm và lớn hơn 5 mm)

(-): các gốc vi khuẩn không đối kháng với Vibrio spp (không tạo vòng kháng khuẩn)

Trong số các dịch nổi sau khi ly tâm loại bỏ sinh khối vi khuẩn được khảo sát thì chỉ có dịch

nổi của hai gốc vi khuẩn Ch104 và Ch201 có khả năng ức chế sự phát triển của V alginolyticus nhưng không có khả năng ức chế sự phát triển của V parahaemolyticus và V harveyi BB120 Tuy

nhiên, mức độ ức chế của dịch nổi sau khi ly tâm vi khuẩn không cao do vòng kháng khuẩn hình

thành không rõ ràng Điều này chứng tỏ rằng hai gốc vi khuẩn Ch104 và Ch201 có thể tiết ra một số

hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của V alginolyticus, ngay cả khi không có sự hiện diện của vi khuẩn trong môi trường

Do đó, khả năng ức chế Vibrio spp của các gốc vi khuẩn hiệu quả hơn khi sử dụng sinh khối

của chúng so với sử dụng dịch môi trường nuôi cấy Điều này có nghĩa là ở đa số các gốc vi khuẩn

khảo sát, chúng chỉ tiết ra các hợp chất có hoạt tính ức chế sự phát triển của Vibrio spp khi có sự

hiện diện của sinh khối vi khuẩn trong môi trường

Từ kết quả khảo sát đặc tính phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn và khả năng đối kháng

Vibrio spp ở điều kiện in vitro chúng tôi nhận thấy rằng không có sự tương quan giữa khả năng phân hủy HHL và ức chế sự phát triển của Vibrio spp AHL là phân tử tín hiệu quorum sensing đã được tìm thấy ở V harveyi và V parahaemolyticus, và sự tiết ra phân tử tín hiệu này điều khiển quá

trình hình thành độc lực ở các gốc vi khuẩn này (Defoirdt và ctv, 2004) Việc bất hoạt phân tử tín hiệu quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh có thể làm giảm đáng kể sự biểu hiện của các yếu tố độc lực, và người ta đã chứng minh được rằng nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân hủy AHL nếu các phân tử này hiện diện trong môi trường ở nồng độ từ M đến mM (Defoirdt và ctv, 2004) Những gốc vi khuẩn thí nghiệm đều được phân lập từ dựa trên khả năng phân hủy AHL nên chúng đều có thể phân hủy được HHL Tuy nhiên, trong thời gian 12 giờ theo dõi thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các gốc vi khuẩn khảo sát đều có khả năng phân hủy HHL ở các mức độ khác nhau với nồng

độ HHL ban đầu là 5 ppm Sự phân hủy HHL của các gốc vi khuẩn có thể là do chúng có thể tạo ra lactonase và acyclase (Dong và ctv, 2000; Molina và ctv, 2008) Tốc độ phân hủy HHL của các gốc

vi khuẩn này nhanh hay chậm có thể do mức độ thích nghi với môi trường của chúng, khả năng tiếp xúc với HHL đồng thời có thể do khả năng tạo ra enzyme

Vì các vi khuẩn gây bệnh sử dụng các phân tử tín hiệu AHL để điều khiển các yếu tố độc lực, do đó sự phân hủy các phân tử tín hiệu này làm giảm khả năng gây bệnh của vi khuẩn trên vật chủ, nhưng không ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Do đó, mặc dù các gốc vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm có khả năng phân hủy HHL nhưng như thế không có nghĩa là tất cả chúng có

khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio spp Trong số các gốc vi khuẩn thí nghiệm thì chỉ

có các gốc vi khuẩn Ch102, Ch104, Ch201 ức chế sự phát triển của V alginolyticus với mức độ (+) trong khi đó các gốc vi khuẩn phân lập từ tôm sú T207, T401 và T402 ức chế V alginolyticus với mức độ (++) và đặc biệt là gốc T402 ngoài khả năng ức chế V alginolyticus, chúng còn có khả năng

ức chế cả V parahaemolyticus và V harveyi với mức độ (+) Điều này chứng tỏ các gốc vi khuẩn

này khi có sự hiện diện của chúng trong môi trường, chúng có khả năng tiết ra một số hợp chất ức

chế sự phát triển của Vibrio spp Các hợp chất do vi khuẩn tiết ra để ức chế sự phát triển của Vibrio

spp có thể là bacteriocin, các acid hữu cơ, lysozyme hoặc là poly--hydroxy butyrate (PHB) (Defoirdt và ctv, 2004) hoặc siderophore (Gatesoupe, 1997; Verschuere và ctv, 2000)

Đánh giá mức độ an toàn của các gốc vi khuẩn khảo sát đối với ấu trùng cá chẽm

Từ các gốc vi khuẩn đã chọn lọc được từ hai thí nghiệm trên, tiến hành khảo sát mức độ an toàn của các gốc vi khuẩn này đối với ấu trùng cá chẽm Mục đích của thí nghiệm này nhằm xác định các gốc vi khuẩn này có phải là tác nhân gây bệnh hay là gốc vi khuẩn an toàn đối với ấu trùng

cá chẽm Thí nghiệm được theo dõi trong 48 giờ Trong số các gốc vi khuẩn được chọn lọc có 7 gốc

vi khuẩn phân lập từ cá chẽm, 2 gốc vi khuẩn phân lập từ post larvae và 7 gốc vi khuẩn phân lập từ tôm sú

Bảng 3: Mức độ an toàn của các chủng vi khuẩn đối với ấu trùng cá chẽm

Chủng vi khuẩn Tỷ lệ sống (%)

T302 63,33 ± 32,66bc

Dựa bảng 3 nhận thấy rằng tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm có sự khác nhau giữa các chủng vi khuẩn khảo sát so với đối chứng Xét trên phương diện thống kê học tại thời điểm 48 giờ, tỷ lệ sống

giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) Điều này chứng tỏ sự bổ sung vi khuẩn

ảnh hưởng đến tỷ lệ sống khác nhau của ấu trùng cá chẽm Đối với các chủng Ch101, Ch102, Ch104, Ch201, Ch501 và Ch601, tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng nên các chủng này không gây hại đến ấu trùng cá chẽm Trong khi đó, đối với các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú khi xét về phương diện thống kê học tại thời điểm 48 giờ, tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm khi bổ sung các chủng Pl101, Pl606, T602, T302, T303 và T501 có mức độ an toàn thấp một cách có ý nghĩa so với đối chứng Điều này chứng tỏ rằng các chủng vi khuẩn Pl606, T602, T302, T303 và T501 không an toàn cho ấu trùng cá chẽm, do đó chủng này không được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

Như vậy, chín chủng vi khuẩn Ch101, Ch102, Ch104, Ch201, Ch501, Ch601 T207, T401 và T402 này sẽ tiếp tục được sử dụng cho thí nghiệm khảo sát hiệu quả nâng cao tỷ lệ sống của ấu

trùng cá chẽm trong điều kiện in vivo

Đánh giá tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm khi gây nhiễm với Vibrio spp khi có sự hiện diện của

các chủng vi khuẩn khảo sát

Thí nghiệm này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá

chẽm gây nhiễm với Vibrio spp khi có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn đã chọn lọc được ở thí

nghiệm 4.1, 4.2 và 4.3

Bảng 4: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm khi gây nhiễm với Vibrio spp khi có sư hiện diện của các gốc vi

khuẩn khảo sát

V parahaemolyticus V alginolyticus

Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng trong số 9 gốc vi khuẩn khảo sát, tuy có một số gốc

vi khuẩn có khả năng nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm so với đối chứng ở điều kiện gây

nhiễm Vibrio spp như gốc Ch104, Ch601, T207 nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

so với nghiệm thức đối chứng

Kết quả này không tương đồng với kết quả thí nghiệm in vitro Điều này là do trong thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của các gốc vi khuẩn với Virio spp trong điều kiện in vitro thì chỉ có hai đối tượng là vi khuẩn khảo sát và Vibrio spp Trong khi đó, ở điều kiện in vivo ngoài vi khuẩn khảo sát và Vibrio spp còn có sự hiện diện của vật chủ, nên ngoài sự tương tác với Vibrio

spp các gốc vi khuẩn khảo sát còn tương tác với vật chủ Chính điều này có thể làm cho khả năng

phân hủy phân tử tín hiệu AHL và/hay hoạt tính ức chế đối với sự phát triển của Vibrio spp bị giảm

xuống, từ đó làm cho khả năng bảo vệ ấu trùng cá chẽm của các gốc vi khuẩn không đạt hiệu quả, đặc biệt đối với gốc T402 Đây là một gốc vi khuẩn khá đặc biệt vì ngoài khả năng phân hủy HHL

(mặc dù tương đối yếu), nó còn thể hiện khả năng ức chế cả ba chủng Vibrio thí nghiệm trong đó

mức độ ức chế V alginolyticus là mạnh nhất Trong thí nghiệm in vivo, gốc này cũng thể hiện khả năng bảo vệ ấu trùng cá chẽm khi gây nhiễm với V alginolyticus và V parahaemolyticus khá tốt ở

thời điểm 24 giờ

Tuy tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm có sự hiện diện của các gốc vi khuẩn khảo sát khi gây

nhiễm với Vibrio spp khá thấp nhưng điều này không có nghĩa là các gốc vi khuẩn này hoàn toàn

không có tác dụng nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm Một số gốc vi khuẩn khảo sát đã giúp nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm mặc dù chưa đạt đến mức độ bảo hộ cho ấu trùng cá chẽm

so với đối chứng như gốc vi khuẩn Ch104, Ch201, Ch601, T207, T402

Hiệu quả nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm của các gốc vi khuẩn trong điều kiện ương

Từ kết quả các thí nghiệm in vitro và thử nghiệm tính đối kháng của các gốc vi khuẩn khảo sát đối với Vibrio spp trên ấu trùng cá chẽm, chúng tôi đã chọn lọc được một số gốc vi khuẩn với

những đặc tính có lợi để tiến hành thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các gốc vi khuẩn này đến tỷ

lệ sống của ấu trùng cá chẽm Các gốc vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm này là: T207, T401, T402, Ch102, Ch104, Ch201, Ch101, Ch501, Ch601 được chia thành 3 đợt thí nghiệm

Bảng 5: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở đợt thí nghiệm 1 Nghiệm thức Tỷ lệ sống (%)

Dựa vào bảng 5, tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm khi bổ sung các chủng vi khuẩn giảm thấp và

có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Việc cung cấp các chủng vi khuẩn khảo sát này

chẳng những không cải thiện tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm mà còn làm cho ấu trùng cá chẽm chết rất nhiều so với nghiệm thức đối chứng và đợt phải kết thúc ở thời điểm 14 ngày Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn T207, T401 và T402 là những chủng phân lập từ tôm sú thương phẩm không thích hợp với ấu trùng cá chẽm nên khi cung cấp vi khuẩn qua thức ăn tự nhiên và cung cấp trực tiếp, vi khuẩn xâm nhập vào đường ruột và không tương thích với hệ vi sinh vật đường ruột của ấu trùng cá chẽm

Bảng 6: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở đợt thí nghiệm 2

Nghiệm thức Tỷ lệ sống (%)

Dựa vào bảng 6, chúng tôi nhận thấy rằng tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở ngày thứ 30 là khá thấp Tỷ lệ sống cao nhất ở nghiệm thức hỗn hợp cũng chỉ đạt 14,34 % Nguyên nhân là do chất lượng trứng sử dụng trong đợt này không tốt nên ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm Khi xét về phương diện thống kê học với trắc nghiệm Duncan, tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm

giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở

nghiệm thức bổ sung Ch201 là thấp nhất (1,34 %) và tỷ lệ sống ở nghiệm thức bổ sung hỗn hợp vi khuẩn là cao nhất (14,34%) và cao hơn nghiệm thức đối chứng một cách có ý nghĩa về phương diện

thống kê học (p < 0,05), trong khi tỷ lệ sống ở các nghiệm thức Ch102 và Ch104 không có sự khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng khi đánh giá bằng trắc nghiệm Duncan (p > 0,05) Điều này chứng

tỏ rằng việc bổ sung vi khuẩn đã có hiệu quả trong việc nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm Việc

sử dụng hỗn hợp của ba chủng vi khuẩn cho tỷ lệ sống cao hơn so với việc sử dụng từng chủng riêng lẻ và cao hơn đối chứng, chứng tỏ hỗn hợp vi khuẩn có tác dụng bổ trợ nhau trong việc nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm Riêng đối với chủng Ch201 lại cho tỷ lệ sống thấp hơn rất nhiều so với đối chứng và các nghiệm thức còn lại, điều này là do các chủng này không ức chế được

sự phát triển của Vibrio trong nước và mật độ Vibrio trong nước khá cao nên làm cho ấu trùng chết

rất nhiều

Bảng 7: Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở đợt thí nghiệm 3

Nghiệm thức Tỷ lệ sống (%)

Tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở đợt 3 được thể hiện ở bảng 7 Chúng tôi nhận thấy rằng,

tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở đợt này khá cao và cao hơn rất nhiều so với đợt trước ngay cả ở nghiệm thức đối chứng Điều này có thể do nguồn trứng cá thụ tinh sử dụng cho đợt này tốt hơn khá nhiều so với đợt trước Và tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở các nghiệm thức cũng có sự khác nhau khá rõ rệt Khi đánh giá sự khác biệt của từng nghiệm thức với nhau bằng trắc nghiệm Duncan, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm giữa nghiệm thức Ch501 và hỗn hợp so với nghiệm thức đối chứng, trong khi đó tỷ lệ sống ở 2 nghiệm thức bổ sung Ch101 hoặc Ch601 lại không có sự khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng Qua đợt này, một lần nữa cho phép kết luận việc bổ sung vi khuẩn có hiệu quả trong việc nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm so với không bổ sung vi khuẩn và việc sử dụng hỗn hợp các vi khuẩn cho hiệu quả cao hơn hẳn so với sử dụng từng chủng riêng rẽ

Tóm lại, các chủng vi khuẩn khảo sát có tác dụng nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm và các chủng vi khuẩn này khác nhau theo nguồn gốc phân lập, có nghĩa là chỉ có các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm mới thể hiện hiệu quả trong việc nâng cao tỷ lệ sống và phát triển của ấu trùng

cá chẽm Trong ba đợt, đợt 1 với ba chủng phân lập từ tôm sú thương phẩm có tỷ lệ sống của ấu trùng rất thấp so với đối chứng, điều này chứng tỏ các chủng này không phù hợp với hệ vi sinh đường ruột của ấu trùng cá chẽm nên không có khả năng nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng mà ngược lại còn có khả năng gây chết ấu trùng Mặc dù những chủng này đã được kiểm tra khả năng an toàn đối với ấu trùng cá chẽm nhưng đợt này chỉ tiến hành theo dõi trong 48 h, đây là thời gian khá ngắn nên không thể đánh giá hết mức độ an toàn Trong khi đó, các chủng vi khuẩn phân lập từ ấu trùng

cá chẽm hoàn toàn không gây hại đến ấu trùng cá chẽm trong suốt thí nghiệm Do đó, những chủng

vi khuẩn phân lập từ đối tượng nào nên sử dụng cho đối tượng đó sẽ cho kết quả tốt nhất Từ kết quả thí nghiệm đã chứng minh rằng các chủng vi khuẩn đã phân lập có tính đặc hiệu theo loài

Do chất lượng trứng đã thụ tinh ở hai đợt 2 và 3 không đồng đều nhau nên chúng tôi không thể đánh giá các chủng vi khuẩn ở đợt 3 hiệu quả hơn trong việc nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm so với các chủng sử dụng ở đợt 2 Nhìn chung, sự bổ sung vi khuẩn có hiệu quả trong việc nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm ở cả hai đợt, ngoại trừ chủng Ch201 ở đợt 2 Ngoài khả năng

nâng cao tỷ lệ sống, chúng còn có khả năng kìm hãm sự phát triển của Vibrio trong nước, là một tác

nhân có thể gây chết ấu trùng cá chẽm Hiệu quả nâng cao tỷ lệ sống ấu trùng cá chẽm của các chủng vi khuẩn chủ yếu là nâng cao khả năng tiêu hóa của ấu trùng, tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng làm chúng phát triển nhanh hơn và làm thời gian biến thái của chúng rút ngắn lại Đồng thời,

các chủng này ức chế độc lực của Vibrio và những vi khuẩn gây bệnh khác thông qua việc bẻ gãy các phân tử tín hiệu quorum sensing và chúng có thể sản xuất ra các chất ức chế làm Vibrio không

thể gây hại cho ấu trùng cá chẽm

Hơn nữa, qua đợt 2 và 3 chúng tôi nhận thấy rằng hiệu quả sử dụng các chủng vi khuẩn cao hơn khi sử dụng ở dạng hỗn hợp Vì các chủng vi khuẩn đã được thử nghiệm là những vi khuẩn có lợi nên khi sử dụng chung chúng sẽ hỗ trợ lẫn nhau tốt hơn so với từng chủng riêng rẽ và có thể thích nghi với các điều kiện môi trường khác nhau nên hiệu quả cao hơn

Tóm lại, các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm được phân lập từ cá chẽm, tôm sú thương phẩm và post larvae dựa trên khả năng phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing ở vi khuẩn gram âm (phân từ AHL) thì chỉ có các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm có hiệu quả tốt trong việc nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm, điều đó chứng tỏ rằng nguồn gốc phân lập vi khuẩn

có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn lọc được một chủng vi khuẩn tốt cho đối tượng mà chúng ta quan tâm Hơn nữa, việc chọn lọc các chủng vi khuẩn này theo khả năng phân hủy AHL là một

hướng đi khá mới ở Việt Nam Những chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế độc lực của vi khuẩn gây bệnh và từ đó nâng cao khả năng sống của ấu trùng cá chẽm

Trên thế giới cũng như tại Việt Nam, đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu về nâng cao tỷ

lệ sống của nhiều loại động vật nuôi trồng thủy sản bằng probiotic như trên tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) (Gomez và ctv, 2008), cá bơn (Ringo, 1999;

Tinh và ctv, 2008), bào ngư (Macey và Coyne, 2005) … Trong nghiên cứu của Gomez và ctv

(2008) về đánh giá khả năng nâng cao tỷ lệ sống tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) của

các chủng vi khuẩn probiotics bằng cách cho ăn 2 ngày/lần với thời gian theo dõi lần lượt là 15, 30

và 45 ngày thì thấy rằng tỷ lệ sống của tôm thẻ tại các thời điểm đều đạt tỷ lệ khá cao (từ 83,33 % đến 92,66 %) Gomez và ctv (2008) đã nhận thấy rằng những chủng vi khuẩn này có sản xuất ra các enzyme tiêu hóa như protease và những enzyme tiêu hóa này có vai trò rất quan trọng trong việc nâng cao khả năng tiêu hóa ở vật chủ Nhìn chung, theo kết quả của các nghiên cứu đã đạt được, các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic đều có khả năng nâng cao tỷ lệ sống của động vật thí nghiệm Đây là một tín hiệu rất đáng khả quan, vì trong tình hình các tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản ngày càng nhiều, và việc lạm dụng kháng sinh đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thì probiotic là một giải pháp khả thi để nâng cao chất lượng con giống cũng như chất lượng tôm hay cá nuôi thương phẩm

KẾT LUẬN

Tất cả các chủng vi khuẩn khảo sát đều có khả năng phân hủy phân tử AHL (phân tử tín hiệu quorum sensing của vi khuẩn gram âm) trong thời gian 12 h nhưng mức độ phân hủy của chúng không giống nhau và phụ thuộc vào thời gian khảo sát

Khả năng phân hủy AHL có mối tương quan với khả năng ức chế độc lực ở vi khuẩn gây bệnh,

tuy nhiên không nhất thiết phải có mối tương quan với khả năng ức chế sự tăng trưởng của Vibrio spp trong điều kiện in vitro Một số chủng phân hủy AHL yếu nhưng lại có khả năng đối kháng mạnh với Vibrio spp (như chủng T402), và ngược lại một số chủng phân hủy AHL mạnh lại không

ức chế sự phát triển Vibrio spp (như chủng Ch101)

Khả năng bảo vệ ấu trùng cá chẽm của các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy AHL hoặc/và

ức chế Vibrio spp trong điều kiện in vitro phụ thuộc vào sự hiện diện của ấu trùng cá chẽm Không

có chủng vi khuẩn nào có khả năng bảo vệ ấu trùng cá chẽm khi gây nhiễm với V parahaemolyticus và V alginolyticus (RPS < 60 %)

Đa số các chủng vi khuẩn đều an toàn đối với ấu trùng cá chẽm trừ một số chủng vi khuẩn T302, T303, T501, T602, Pl101 và Pl606 sau 48 h khảo sát khi tiến hành đánh giá mức độ vô hại của các chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn đã phân lập có tính đặc hiệu loài theo nguồn gốc phân lập khi tiến hành đánh giá khả năng nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm, chỉ có các chủng vi khuẩn phân lập từ

cá chẽm có khả năng nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ở ngày thứ 30, còn các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú thương phẩm lại gây hại đến ấu trùng cá chẽm

Các chủng vi khuẩn phân lập cá chẽm đều có khả năng nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm ngoại trừ chủng Ch201 Việc sử dụng hỗn hợp các chủng vi khuẩn nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá chẽm hiệu quả hơn so với việc sử dụng các chủng vi khuẩn riêng lẻ, và có sự sai biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Ali A., 2000 Probiotics in fish farming - Evaluation of a candidate bacterial mixture PhD

Licentiate Thesis, Sveriges Lantbruks, Umea

Avendano R E., Riquelme C E., 1999 Establishment of mixed-culture probiotics and micoralgae

as food for bivalve larvae Aquaculture Research 30: 893 – 900

Baticados M C L., Lavilla-Pitogo C R., Cruz-Lacierda E R., de la Pena L D and Sunaz N A.,

1990 Studies on the chemical control of luminous bacteria Vibrio harveyi and V splendidus isolated from diseased Penaeus monodon larvae and rearing water Disease of Aquatic Organisms 9: 133 – 139