PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ NEM CHUA TRUYỀN THỐNG LÀM GIỐNG KHỞI ĐỘNG NEM CHUA PROBIOTIC Nguyễn Hoài Hương 1 , Dương Thúy Vy 1 , Trần Linh Châu 2 , Đoàn Kim Như 1 1
Trang 1PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ NEM CHUA TRUYỀN THỐNG LÀM GIỐNG KHỞI ĐỘNG NEM CHUA PROBIOTIC
Nguyễn Hoài Hương 1 , Dương Thúy Vy 1 , Trần Linh Châu 2 , Đoàn Kim Như 1
1 Khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Kỹ thuật Công nghệ TP.HCM
2 Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường ĐH Kỹ thuật Công nghệ TP.HCM
TÓM TẮT
Các vi khuẩn lên men lactic được phân lập từ nem chua truyền thống Ninh Hòa, Thủ Đức, Lai Vung trên môi trường MRS chứa 0.2% Na-azide và định danh đến cấp
giống Lactobacillus bằng phương pháp nuôi cấy tuân theo khóa phân loại Bergey Để
làm vi sinh vật khởi động sản xuất nem chua, các vi khuẩn phân lập được tuyển chọn theo hoạt tính probiotic: khả năng kháng khuẩn tổng quát, khả năng kháng khuẩn sau khi loại bỏ tác nhân sinh acid, khả năng chịu acid và muối mật cũng như theo các tiêu chuẩn khác dành cho giống khởi động lên men thịt như hoạt tính protease, không sinh bioamine, tốc độ lên men lactic, khả năng tạo giá trị cảm quan truyền thống Kết quả
cho thấy kết hợp giữa Lactobacillus T13 từ nem Ninh Hòa và LactobacillusT3từ nem
Thủ Đức theo tỉ lệ 1:1 cho kết quả nem chua đạt yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm
và cảm quan, hơn nữa với mật độ LAB sống 108 cfu/g, đạt tiêu chuẩn về thực phẩm probiotic
Từ khóa: giống khởi động, thịt lên men, thực phẩm probiotic, vi khuẩn lên men lactic (LAB)
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nem chua là sản phẩm thịt lên men truyền thống của Việt Nam và các nước Đông Nam Á được đánh giá cao về giá trị cảm quan và dinh dưỡng Sản xuất nem chua truyền thống ở Việt Nam hiện nay theo hai hướng: hướng thứ nhất không cấy vi sinh vật khởi động mà chủ yếu dựa vào vi khuẩn lactic có sẵn trong thịt hay trong lá cây gói kèm; hướng thứ hai sử dụng giống khởi động từ nem chua mẻ trước Hai phương thức sản xuất này dẫn đến chất lượng nem chua không đồng đều về cảm quan và vệ sinh an toàn thực phẩm Những năm gần đây, với xu thế công nghiệp hóa các sản phẩm truyền thống, nem chua sản xuất tại các cơ sở sản xuất lớn và nhà máy sử dụng giống khởi động nhập khẩu từ nước ngoài như Danisco (Đan Mạch) (Truong et al., 2007) Vi khuẩn khởi động thịt lên men nhập khẩuthường bao gồm hỗn hợp vi khuẩn lên men lactic (LAB) và một số vi khuẩn khác nhằm sản xuất thịt lên men châu Âu, cho một chất lượng đồng nhất nhưng cảm quan không đạt yêu cầu cho người Việt Nam Quy trình lên men thịt châu Âu thường bao gồm hai quá trình: quá trình lên men lactic và quá trình chín hay lên men phụ để tạo hương vị Trong khi đó,sản xuất nem chua Việt Nam chỉ gồm quá trình lên men lactic Toàn bộ giá trị cảm quan của sản phẩm phụ thuộc vào quá trình này Do đó LAB trong nem chua Việt Nam hẳn phải có nhiều đặc điểm khác biệt so với LAB trong giống khởi động châu Âu.Ý thức được điều này và nhằm bảo tồn nguồn tài nguyên
vi sinh vật Việt Nam,nhiều nhà nghiên cứu trong và ngoài nước đã quan tâm đến phân lập, định danh và nghiên cứu đặc điểm của LAB từ nem chua ở Việt Namnhư Ho và đồng tác giả, 2007, Nguyen và đồng tác giả, 2010 và Tran và đồng tác giả,2011
Gần đây nhiều nghiên cứu còn cho thấy các vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thịt lên men có
khả năng chịu acid, muối mật, sinh bacteriocin tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh thực phẩm như E
coli, Salmonella, Staphylococcusaureus và Listeria monocytogenes(De Vuyst et al., 2008) Thực
phẩm lên men ngày càng được ưa chuộng vì khả năng cung cấp vi khuẩn sống cho hệ vi sinh đường ruột (Heller, 2001) Xu hướng sản xuất thực phẩm chứa vi sinh vật có ích sống sót qua đường tiêu hóa hay còn được gọi là thực phẩm probiotic cũng đang được quan tâm(Mattila- Sandholm et al.,2002) Thịt lên men được đánh giá là ―chất mang‖ thích hợp đối với vi khuẩn probiotic (Hammes et al.,2008)
Nghiên cứu sử dụng LAB phân lập từ nem chua làmvi sinh vật khởi động cũng bắt đầu được quan tâm ở Việt Nam (Ho et al.,2009) Thêm một bước nữa chúng tôi quan tâm đến việc sản xuất
Trang 2giống khởi động nem chua có hoạt tính probiotic Đó là mục tiêu nghiên cứu của nhóm chúng tôi, bao gồm nội dung như sau:
- Phân lập vi khuẩn lên men lactic trong các sản phẩm nem chua truyền thống
- Tuyển chọn vi khuẩn lactic này theo tiêu chuẩn probiotic và giống khởi động nem chua
- Sử dụng vi khuẩn lactic tuyển chọn để sản xuất nem chua probiotic
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vi khuẩn lactic được phân lập từ các nem chua truyền thống nem Ninh Hòa (Nha Trang) - ký hiệu T13, nem Thủ Đức (TP HCM) - ký hiệu T3, nem Lai Vung (Đồng Tháp), ký hiệu N8 Một
chủng Lactobacillus rhamnosus (L.R) được phân lập từ chế phẩm probiotics dược phẩm cho người
Môi trường phân lập: thạch MRS chứa 0.02 % Na-azide
Để sàng lọc vi khuẩn lactic, sơ đồ thử nghiệm được thiết lập theo Khóa phân loại Bergey xuất bản lần 2 (Hammes, Hertel, 2006)
Các phương phân tích vi sinh cổ điển như nhuộm Gram, nhuộm bào tử, nhuộm kháng acid, thử nghiệm catalase, thử nghiệm acid lactic, khả năng di động, khả năng lên men được được tiến hành theo các phương pháp thông dụng (Benson, 2001)
Lên men đường được tiến hành trong môi trường MRS chứa đường thích hợp và sử dụng bromocresol green làm chất chỉ thị màu
Tăng sinh chủng phân lập trong canh MRS, giữ giống trong thạch MRS
Thử nghiệm đối kháng đối với E coli và Salmonellaspp được tiến hành theo phương pháp
đo độ đục (Skytta, Sandholm,1991)
Khả năng chịu acid: vi khuẩn phân lập tăng sinh sau 18 h, cấy chuyền sang môi trường MRS
pH 2.0, ủ 1, 2 giờ ở 37oC , sau đó trải đĩa và đếm khuẩn lạc sau 48 giờ ủ ở 37oC (Tuomola et al.,2001)
Khả năng chịu muối mật: vi khuẩn phân lập tăng sinh sau 18 h, cấy chuyền sang môi trường MRS chứa 0.3% cao mật bò (Ox bile), ủ 1, 2 giờ ở 37oC , sau đó trải đĩa và đếm khuẩn lạc sau 48 giờ ủ ở 37oC (Tuomola et al.,2001)
Hoạt tính protease: đo đường kính vòng phân giải bằng kỹ thuật đục lỗ giếng thạch trên đĩa thạch chứa cơ chất protease là gelatin, casein và protein tác chiết từ thịt theo tính quy trình (Fransen
et al., 1997)
Khả năng tiết decarboxylase được kiểm tra sử dụng canh Lysine decarboxylase và Ornithine decarboxylase Các sản phẩm tạo ra làm tăng pH môi trường và đổi màu chất chỉ thị chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8) (Moeller, 1954)
Nem chua thí nghiệm có thành phần nguyên liệu như sau: thịt nạc 1000 g, đường cát vàng
300 g, muối (NaCl chứa 0.5% NaNO2) 20 g, bột ngọt 7 g, tiêu 10 g, tỏi 35g, ascorbic acid 5 g,da heo (bì) 200 g
Chuẩn bị vi sinh vật khởi động: tăng sinh trong canh MRS, 18 giờ ở 37oC, cấy tạo mật độ xác định Nồng độ tế bào được xác định bằng cach đo OD610 nm và suy ra đơn vị nồng độ cfu/ml nhờ đường chuẩn được thiết lập dựa trên phương pháp định lượng bằng trải đĩa và và đo OD610nm được tiến hành đồng thời trên một huyền phù tế bào
Acid tổng được xác định bằng cách chuẩn độ, tổng vi khuẩn lactic xác định bằng phương pháp chuẩn độ sử dụng NaOH 0.1 N, phenolphthalein là chất chị thị và tính theo acid lactic
Đánh giá cảm quan bằng phương pháp so hàng(Garrigaet al.,1996, Lawless, Heymann, 2010)
Xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua
Vi khuẩn lactic trong các sản phẩm nem chua (Bảng 1) được tăng sinh và phân lập trên môi trường MRS chứa 0.02% Na-azide với mục đích ức chế một số vi khuẩn hiếu khí tồn tại trong nem,
như Bacillus spp.,Pseudomonas spp., trong khi Lactobacillus spp và Streptococcus spp vẫn tăng
Trang 3trưởng với nồng độ Na-azide 0,02%(Lichstein, Soule, 1944) Việc cấy chuyền sang thạch MRS nhằm loại bỏ vi khuẩn kị khí bắt buộc (Hình 1)
Hình 1 Sơ đồ phân lập sàng lọc vi khuẩn lactic trong nem chua
Bằng các phương pháp nuôi cấy và phép thử cổ điển, các dạng vi khuẩn sau đây được loại
bỏ khỏi bộ sưu tập chủng thuần khiết như nhuộm Gram, nhuộm bào tử, nhuộm kháng acid, thử nghiệm catalase, thử nghiệm khả năng tổng hợp lactic acid và thử nghiệm khả năng di động Theo Khóa phân loại Bergey xuất bản lần 2 (Hammes, Hertel,2008), vi khuẩn lên men lactic gồm các vi
khuẩn hình que và hình cầu.Vi khuẩn hình que chủ yếu thuộc giống Lactobacillus và
Carnobacterium,tuy nhiên Carnobacteriumspp không thể tăng trưởng ở pH 4.5 nên nem chua
không phải là ổ sinh thái tự nhiên của vi khuẩn này Lactobacillus được mô tả là những vi khuẩn
hình que Gram dương, không sinh bào tử, không kháng acid, không có cytochrome nên phản ứng catalase âm tính, tổng hợp lactic acid và không di động Kết quả cho thấy một bộ sưu tập các vi khuẩn phân lập được từ ba loại nem truyền thống, phần lớn có khuẩn lạc màu trắng sữa đục, lồi, vi khuẩn Gram dương có chiều dài khác nhau (Bảng 1) Kết quả phân lập trình bày trong Bảng 1 cũng cho thấy rõ ràng là mỗi một loại nem truyền thống với tên gọi xuất xứ hàng hóa khác nhau chứa LAB khác nhau, do đó đều có hương vị đặc trưng riêng Hình thái khuẩn lạc tương tự như probiotic
Lb.rhamnosus, trong khi chiều dài tế bào có khác biệt
Trang 4Bảng 1.Hình thái khuẩn lạc (40X) và hình thái tế bào (1000 X)
Chủng phân lập Hình thái khuẩn lạc
(nhìn thẳng)
Hình thái khuẩn lạc (nhìn nghiêng)
Hình thái tế bào
T13 (Ninh Hòa)
Khuẩn lạc tròn, to,
nhẵn bóng, màu
trắng sữa, lồi nhiều,
không có núm
Vi khuẩn hình que
thon, dài
T3 (Thủ Đức)
Khuẩn lạc tròn, to,
nhẵn bóng, màu
trắng đục, lồi nhiều,
không có núm
Vi khuẩn hình que
ngắn
N8 (Lai Vung)
Khuẩn lạc tròn, to,
nhẵn bóng, trắng
đục,mép trơn đều,
lồiít
Vi khuẩn hình que
rất ngắn
L.R (chế phẩm)
Khuẩn lạc tròn, to,
nhẵn bóng, màu
trắng đục, lồi ít,
không có núm.Vi
khuẩn hình que nhỏ,
rất ngắn
Khả năng lên men đường đồng hình và dị hình của vi khuẩn lactic phân lập từ thịt được quan tâm Lên men dị hình ngoài lactic acid tạo cấu trúc gel,còn sinh CO2 và ethanol, cũng như aldehyte, diacetyl, acetoin và acid béomạch ngắn có ảnh hưởng nhiều đến cảm quan sản phẩm (Cocconcelli, Fontana, 2008) Hình 2 và bảng 2 cho thấy các vi khuẩn phân lập có khả năng lên men đường tổng hợp acid với nồng độ khácnhau,đa số đều lên men dị hình
Hình 2.Khảo sát khả năng lên men đường và sinh khí của chủng LAB phân lập
ĐC
Trang 5ĐC: Đối chứng- không đổi màu và không sinh khí – không lên men (-/-)
1 – Xanh nhạt ít đổi màu và sinh khí – lên men tổng hợp ít acid (+/+)
2 - Xanh lá cây và sinh khí – lên men tổng hợp acid trung bình (++/+)
3 – Màu đổi từ xanh sang vàng (pH <3.8) – sinh khí – lên men tổng hợp nhiều acid (+++/+)
Bảng 2.Khả năng lên men đường của một số chủng phân lập
Đường Khả năng lên men đường/sinh khí
Bảng 2 cho thấy các chủng phân lập từ nem chua truyền thống đều có khả năng lên men đường glucose sinh khí, đặc biệt T13 và T3 lên men glucose rất mạnh, sinh acid làm pH giảm xuống 3.8 làm canh trường chuyển từ màu xanh dương sang màu vàng rõ rệt Những vi khuẩn này đều thuộc loại lên men dị hình, giải thích tại sao nem chua truyền thống có hương vị đặc trưng mà không trải qua quá trình chínnhư thịt lên men châu Âu
Các chủng từ nem đều lên men maltose và sucrose, đặc biệt sucrose,phù hợpvới thói quen bổ
sung khá nhiều đường trong nemchua NamViệt Nam Rất ít loài Lactobacillusspp lên men
mannitol và xylose, nên có thể thu hẹp phạm vidự đoán các lòai vi khuẩn phân lập trong phạm vi
Lb.salivarus, Lb.plantarumhoặc Lb.brevis (Hammers và Hertel,2006) Theo Ho và đồng tác giả,
2007,25.19% LAB phân lập được từ nemchua truyền thống là Lb brevis, 21.37% là
Lb.plantarum,còn lại là cầu khuẩn như 14.50% Leuconostoc mesenteroides dextranicum, 12.21% Pediococcus pentosaceus và 11.45% Lactococcus lactis Trong khi đó Tran và đồng tác giả, 2010
lại phân lập được từ nem chua 67.6% Lb plantarum, sau đó là P.pentosaceus (21.6%) vàLb.brevis(9.5%) Trên thực tế từ nem chua truyền thống nêu trên chúng tôi phân lập được hàng
loạt vi khuẩn lên men lactic nhưng chúng tôi chỉ quan tâm đến những vi khuẩn có khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm và chịu acid muối mật có tiềm năng là probiotics Do đó trong chúng tôi tiếp tục sàng lọc các chủng phân lập theo những tính chất thể hiện hoạt tính probiotic và
chỉ báo cáo các chủng có hoạt tính tương đối mạnh
Tuyển chọn các LAB phân lập có tiềm năng probiotic
Theo định nghĩa của FAO/WHO thì probiotic là những vi sinh vật sống hoạt động tích cực cho sức khỏe vật chủ trong đường ruột (Tuomola et al.,2001) Những tiêu chuẩn đầu tiên được sử dụng để tuyển chọn probiotics là khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh và khả năng sống sót qua đường ống tiêu hóa để phát huy hoạt động tại đích là ruột non và ruột già
Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh thực phẩm
Các vi khuẩn gây bệnh thực phẩm thường có trong thịt là E.coli, Salmonella spp.,
Staphylococcus spp và Listeria monocytogenes Việc loại trừ các vi khuẩn này trong qúa trình lên
men thịt được quan tâm để bảo đảm chất lượng vệ sinh cho thịt lên men Nhiều nghiên cứu cho thấy
vi khuẩn lactic thường ức chế vi khuẩn gây bệnh theo nhiều cơ chế,chủ yếu do acid hữu cơ tạo thành, CO2 sinh ra trong quá trình lên men và bacteriocin Để khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, chúng tôi áp dụng phương pháp đo độ đục (turbidimetricmethod) dịch nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị ủ với dịch nuôi cấy LAB sau khi ly tâm loại bỏ tế bào trước và sau khi trung hòa acid theo Schillinger và đồng tác giả, 1989 Tỉ lệ ức chế không trung hòa biểu hiện khả năng ức chế toàn phần của LAB, trong khi đó trung hòa loại trừ tác nhân acid nhằm biểu hiện khả năng ức chế của các tác nhân khác, có thể là của bacteriocin Cũng cần phải ghi chú rằng trong điều kiện thí nghiệm ủ hiếu khí, CO2 không tích tụ để ức chế tăng trưởng vi khuẩn chỉ thị
Trang 6Hình 3.Tỷ lệ (D %) ức chế tăng trưởng E.coli của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và trung
hòa, D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC)
Hình 4.Tỷ lệ (D%) ức chế sự tăng trưởng vi sinh chỉ thị Salmonella của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không
trung hòa và trung hòa, D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) Hình 3 và hình 4 cho thấy LAB T13, T3 và N8 phân lập từ nem truyền thống có khả năng ức
chế 77-88% E.coli và 85-87% Salmonellalà vi khuẩn gây bệnh thực phẩm Gram âm, trong khi
Lb.rhamnosus từ chế phẩm không ức chế những vi khuẩn này Sau khi trung hòa, T13, T3 và N8 từ
nem truyền thống còn khả năng ức chế 42-48% E.coli và 25-30% Salmonella.Phần lớn các LAB
trong xúc xích lên men châu Âu ức chế vi khuẩn Gram dương (Schillinger et al., 1989), trong khi các vi khuẩn gây bệnh thực phẩm chủ yếu thuộc vi khuẩn Gram âm Điều này cho thấy thực phẩm lên men truyền thống là nguồn cung cấp chủng LAB kháng vi khuẩn gây bệnhtiềm năng Để tìm hiểu tác nhân ức chế vi khuẩn sau khi trung hòa, protein kết tủa bằng (NH4)2SO4 từ T13 thể hoạt tính kháng khuẩn cùng phổ như dịch nuôi cấy, vì vậy có thể suy ra rằng protein này có thể là bacteriocin (kết quả chưa công bố) Bacteriocin luôn được tìm kiếm trong vi khuẩn khởi động nem chua vì có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Gram dương nguy hiểm phát triển trong quá trình
chế biến và bảo quản thịt ở nhiệt độ mát là Listeria monocytogenes (Demeyer, 2004)
Khả năng chịu acid và muối mật
Vi khuẩn ức chế tác nhân gây bệnh chỉ có giá trị như một probiotic nếu có khả năng sống sót qua đường tiêu hóa, cụ thể là chịu acid và muối mật.Để xác định một chủng có khả năng kháng acid
và muối mật hay không, người ta xác định tỉ lệ sống sót của chủng đó trong môi trường có pH bằng
pH dịch vị là 2.0 hoặc nồng độ cao mật bò 0.3% trong thời gian 1 -2 giờ là thời gian thức ăn lưu trong dạ dày hoặc ruột non (Tuomola et al., 2001 )
Trang 7Hình 5 Tỉ lệ sống sót của LAB phân lập sau khi ủ 1-2 giờ ở pH =2.0
Hình 6 Tỉ lệ sống sót của LAB phân lập sau khi ủ 1-2 giờ với muối mật 0.3%
Hình 5,6 cho thấy T13, T3 và N8 phân lập từ nem truyền thống đều sống sót với tỉ lệ>50 %
sau khi ủ ở pH 2.0 hai giờ, trong đó T13 thể hiện khả năng sống sót cao hơn cả Ngược lại,Lb
rhamnosus phân lập từ chế phẩm lại tỏ ra chịu yếu hơn Điều này càng chứng tỏ thực phẩm lên men
truyền thống có thể là nguồn cung cấp probiotic tiềm năng
Tuyển chọn chủng có khả năng làm giống khởi động nem chua
Các tiêu chuẩn để chọn lọc giống khởi động nem chua là có khả năng tổng hợp bacteriocin trong quá trình lên men‘không tổng hợp bioamine và có khả năng sử dụng protein thịt làm nguồn amino acid cho sự tăng trưởng LAB (Hammes, Hertel,1996; Talon, Leroy, 2006)
Không sinh bioamine trong quá trình lên men
Bioamine là sản phẩmphụ của thực phẩm lên men, gây quan ngại về vấn đề vệ sinh an toàn thựcphẩm Thịt lên men không được chứa nhiều hơn 100mg/kg bioamine (Hammes, 2008) Bioamine sinh ra chủ yếu do enzyme decarboxylase của vi sinh vật có mặt trong thịt Vi khuẩn Gram âm gây hư hỏng thịt thường sinh ra putrescine và cadaverine, trong khi LAB có xu hướng khử nhóm carboxyl từ tyrosine, histidine và ornithine sinh ra tyramine, histamine và putrescine Do đóchọn lọc các chủng LAB không có hoạt tính decarboxylase đóng vai trò quan trọng bảo đảm không sinh bioamine trong quá trình lên men
t
n
đc
Trang 8Hình 7 Khảo sát hoạt động enzyme decarboxylase từ các chủng LAB phân lập
(Mẫu đối chứng (đc): không cấy LAB, mẫu thí nghiệm có cấy LAB lên men đường sinh acid làm giảm pH
(màu vàng - âm tính, màu tím - dương tính)
Kết quả cho thấy tất cả các chủng LAB phân lập đều không thể hiện hoạt tính decarboxylase
Hoạt tính protease
Hoạt tính protease của LAB thường rất thấp và khó xác định so với các vi khuẩn khác (Fransen et al., 1997), nhưng lại đóng vai trò vô cùnng quantrọng đối với LAB trong việc thích nghi môi trường thịt, tức là khả năng tự tạo nguồn yếu tố tăng trưởng cho LAB Thông thường để so sánh hoạt tính protease bán định lượng, phương pháp đục lỗ giếng thạch thường được sử dụng và đo đường kính vòng phân giải (Hình 8) Tuy nhiên các cơ chất thông thường sử dụng để xác định hoạt tính protease trong phòng thí nghiệm không phải là cơ chất tự nhiên của protease của LAB Để có
cơ chất thích hợp, phòng thí nghiệmchúng tôi đã điều chế protein từ thịt làmcơ chất cho protease trong thử nghiệm này
Hình 8 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp bán định lượng Bảng 3.Đường kính vòng phân hủy cơ chất của enzyme protease bằng phương pháp khuyếch tán qua giếng
thạch
Vi khuẩn lactic
Đường kính vòng phân hủy cơ chất của
enzyme protease (mm) Protein thịt Gelatin Casein
Trong thành phần nguyên liệu làm nem chua thường có protein thịt và bì heo là cơ chất tự nhiên của enzyme protease Bảng 3 cho thấy các chủng thủy phân protein thịt tương đượng, trong khi có hoạt tính phân hủy gelatin khác biệt
Trong các LAB phân lập, vi khuẩn có nguồn gốc nem chua truyền thống thể hiện nhiều ưu
điểm hơn so với vi khuẩn từ chế phẩm probiotics Lb rhamnosus được nhiều nơi trên thế giới sử
dụng làm giống khởi động thịt lên men (Erkkilä et al.,2001).Các chủng từ nem chua truyền thống Việt Nam thể hiện nhiều ưu điểm được tiếp tục thử nghiệm sản xuất nem chua probiotics
Như vậy từ các nguồn nem truyền thống khác nhau, chúng tôi đã phân lập được 12 chủng
LAB Tuy nhiên sau khi sàng lọc hoạt tính kháng E.coli và Salmonella, khả năng chịu acid và muối
mật, hoạt tính protease và không có enzyme decarboxylase, T13 (nem Ninh Hòa), T3 (nemThủ Đức) và N8 (nem Lai Vung) thể hiện hoạt tính mạnh hơn cả, được đưa vào sản xuất thử nem chua probiotic
Sản xuất thử nem chua probiotics từ LAB phân lập
Khảo sát tốc độ lên men
đc
Trang 9Tốc độ lên men lactic có ý nghĩa quan trọng với chất lượng nem chua về khía cạnh vệ sinh an toàn lẫn khía cạnh cảm quan Lên men nhanh đồng nghĩa với các vi khuẩn khác trong thịt bị ức chế sớm, nhưng không đáp ứng nhu cầu cảm quan Điểm khác biệt giữa nem chua châu Á và thịt lên men châu Âu là ở chỗ nem chua đơn thuần là quá trình lên men lacticlàm giảm pH đến pI (4.5) làm đông tụ gel protein, trong khi đó xuc xích lên men châu Âu cònthêm quá trình chín kéo dài tạo nhiều hương vị đăc trưng Một đặc điểm quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ lên men nem chua miền Nam là nồng độ đường bổ sung vào nguyên liệu thịt thường rất lớn, từ 20-50% so với khối lượng thịt Hình 9 cho thấy thấy tốc độ giảm pH sử dụng các giống khởi động khác nhau, nhưng khác biệt không đáng kể pH đạt đến pI sau hơn 2 ngày lên men ở nhiệt độ phòng Ở thịt lên men châu Âu, hàm lượng đường thường là 0.7%,bảo đảm pH giảm đến 4.7 sau 24 h lên men (Demeyer, 2004) Trong khi đó,Ho và đồng tác giả, 2007 khảo sát nem truyền thống lên men tự phát,pH >5.2 sau 24 giờ và chỉ ổn định về 4.2 sau 72-96 giờ; còn nem lên men có định hướng (sử dụng nem đã chua làm giống khởi động) thì pH giảm nhanh hơn,nhưng cũng phải sau 48 giờ mới đạt mức ổn định là 4.0 Thí nghiệmcủa chúng tôi cho biết với 20% đường bổ sung ngay cả khi cấy giống đạt 105cfu/g cũng đòi hỏi 48 giờ để đạt pH 4.5
Hình 9 Biến thiên pH trong thời gian lên men (đường bổ sung 30%, mật độ cấy giống 103 cfu/g)
Song song với động học pH là động họctổng hợp acid hữu cơ (tính theo acid lactic) Bảng 4 cho thấy sau 4 ngày lên men, hàm lượng acid tổng hợp được đạt xấpxỉ 1.7% là hàm lượng acid lactic thường đo được trong thực phẩm lên men truyền thống (Steinkraus, 1992) Khôngcósựkhác biệt đáng kể về tốc độ giảm pH và tổng hợp acid giữa các nem được sản xuất từ các nguồn giống khởi động khác nhau
Bảng 4 Biến thiên acid tổng trong 4 ngày lên men thịt Giống khởi động T13 T3 N8 Ngày 0
Sau khi cấy giống 0.70 0.70 0.70 Ngày 1 0.74 0,76 0.78
Ngày 2 1.12 1.10 1.04
Ngày 3 1.57 1.48 1.55
Ngày 4 1.67 1.68 1.74
Khảo sát chất lượng cảm quan của nem thí nghiệm
Hương vị nem truyền thống được ưa chuộng nhờ sự đóng góp của hỗn hợp các chủng LAB có mặt trong nem truyền thống từng vùng.Nguồn vi khuẩn ấy có thể là lá chùm ruột,lá ổi thích nghi lâu đời trên môi trường thịt Phân lập tuyển chọn vi khuẩn LAB từ nemtruyền thống làm giống khởi động lên men thịt là để đáp ứng cùng lúc nhu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm và cảm quan
Trang 10Bằng phương pháp so hàng xếp hạng theo độ ưa thích giảm dần, các chỉ tiêu màu, mùi, vị, cấu trúc của sản phẩm được 20 đối tượng chọn ngẫu nhiên đánh giávà tổng điểm được trình bày trong bảng 5
Bảng 5 Bảng điểm tổng cộng đánh giá các chỉ tiêu cảm quan nem thí nghiệm Giống khởi
động
T13 Ninh Hòa
T3 Thủ Đức
N8 Lai Vung
T13:T3=
1:1
Cấu trúc 50 54 59 29
Chỉ tiêu màu không quan trọng lắm vì có thể sử dụng màu thực phẩm bổ sung.Chỉ tiêu mùi vị
và cấu trúc đóng vai trò quyết định hơn trong đánh chất lượng cảm quan thực phẩm T 3 từ nem Thủ Đức có mùi vị được ưa chuộng hơn nemsản xuất từ T13 (Ninh Hòa và Lai Vung) Mặt khác, nem sản xuất từ T13 có cấu trúc tốt hơn Kết hợp T13 và T3 theo tỉ lệ 1:1 cho ra nem có các chỉ tiêu cảm quan cải thiện đáng kể Mặc dù sự tương tác giữa hai vi khuẩn này chưa được nghiên cứu, những rõ ràng chúng cótác động tương hỗ làm thay đổi giá trị cảm quan sản phẩm
Bảng 6.Kết quả đánh giá cảm quan theo mức độ ưa thích của các sản phẩm nem
Thành viên
Vị trí hạng của các mẫu
Trong đó: A:nem Dư phước, B: nem thí nghiệm, C: Nem Lai Vung, D: nem Đức Thịnh, E: nem Vissan
Ngoài ra kết quả đánh giá cảm quan mức độ ưa chuộng đối với các sản phẩm nem chua khác nhau hiện có mặt trên thị trường Việt Nam và nem chua thí nghiệm T13-T3 (1:1) cho thấy nem thí nghiệm trội hơn hẳn về mùi vị và cấu trúc (p<0.05), trong khi không khác biệt đáng kể so với các nem khác vè màu sắc (bảng 6)
Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm của nem thí nghiệm
Sản phẩm kiểm nghiệm đạt về các yêu cầu vi sinhthực phẩm theo TCVN 7050 : 2002
Khảo sát sự biến thiên pH sau 15 ngày bảo quản, ta thấy pH vẫn ổn định ở 4.2,điều này chứng tỏ bioamine không được tạo thành, hoàn toàn tương ứng với kết quả khảo sát hoạt tính decarboxylase
