Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô lan giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm Hegarty,1955; Niimoto and Sagawa, 1961.. Tùy từng thí nghiệm, nước dừa già sẽ được bổ sung vào môi t
Trang 1ABSTRACT
Phalaenopsis amabilis is one of many commercial valuable orchids as cut flowers
and potted plants with great economic importance all over the world which rely on their colors, species and specific characteristics Considerable difficulties have been encountered in the clonal propagation of this orchid due to the characteristics ununiform and the limitted plantlets number This study was performed in order to establish
embryogenic morphological of Phalaenopsis amabilis The in vitro leaves emerging
from the flower stalk nodes were used for protocorm-like bodies (PLBs) induction These PLBs were used for the embryos induction The embryos were used as the sample
to study morphological of Phalaenopsis amabilis About 1360 mg embryos (1335.4
embryos), 3050 mg PLBs (311.9 PLBs) and 2650 mg shoots (50.9 shoots) were harvested from 100 mg embryos on 30 ml MS medium supplemented with 2 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 30% (v/v) old coconut water, 1 g/l activated charcoal, 30 g/l sucrose and
9 g/l agar after 12 culture weeks of Results indicated that old coconut water 30% (v/v)
is suitable for embryogenesis, PLBs and shoot development, conversely
Keywords: nước dừa già, nước dừa non, Phalaenopsis amabilis, phát sinh hình thái, PLB (Protocorm-like body), tăng sinh phôi
MỞ ĐẦU
Trong nuôi cấy in vitro thực vật từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi cấy phôi
Datura metel L và năm 1949 nuôi cấy mô Daucus carota Các nghiên cứu sau đó trên hoa lan cho
thấy nước dừa rất thích hợp cho đối tượng này Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
mô lan giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty,1955; Niimoto and Sagawa, 1961) Theo kết quả phân tích thành phần nước dừa của Tulecke và cộng sự trong nước dừa có các amino acid, acid hữu cơ, đường sucrose, glucose, fructose…, các hợp chất có hoạt tính auxin, cytokinin dạng glycoside với thành phần và hàm lượng rất cân đối Trong đó hàm lượng các chất này có trong nước dừa non cao hơn so với nước dừa già Do đó, từ trước đến nay nước dừa non thường được sử dụng trong nuôi cấy mô lan Tuy nhiên, giá thành của nước dừa non thường cao gấp nhiều lần so với
nước dừa già, do vậy chí phí giá thành cây giống nuôi cấy in vitro cao hơn Vì vậy chúng tôi tiến
hành khảo sát ảnh hưởng của nước dừa già, xác định nồng độ thích hợp nhất cho việc nhân nhanh phôi vô tính, PLB và cây con lan Hồ điệp nhằm làm giảm giá thành sản xuất cây giống, tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính với quy mô lớn
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu là cây P amabilis Phát hoa của các cây trưởng thành 5 – 6 tuổi, khỏe
mạnh, không có biểu hiện bệnh, cho hoa đẹp trồng trong nhà kính
Chọn những phát hoa không già, khi hoa chưa nở Chọn các phần phát hoa mang chồi, khoảng nốt thứ ba từ dưới lên, hai nốt phần gốc thường không tạo chồi được bỏ đi, phần phía trên mang hoa cũng không sử dụng được Phần phát hoa sử dụng làm nguồn mẫu cấy ban đầu thường chỉ mang từ 4 – 6 nốt
Trang 2Hình 1 Nguồn vật liệu phôi vô tính lan Hồ điệp được sử dụng cho thí nghiệm nuôi cấy.
Lá thu được sau hai tháng nuôi cấy phát hoa được dùng làm nguyên liệu để tái sinh PLB
Các lá (dài 2 cm) của các chồi in vitro này được cắt thành 6 mảnh Cách cắt mẫu như sau: tiến hành
cắt một đường giữa gân lá chia lá thành hai phần theo chiều dọc Tiếp tục cắt theo chiều ngang vuông góc với gân lá tạo các lát cắt hình vuông Mẫu cấy được cấy trên môi trường MS có bổ sung
1 mg/l NAA; 10 mg/l BA; 30 g/l sucrose; 20% (v/v) nước dừa non; 9 g/l agar Các PLB tái sinh từ
mô lá in vitro được cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 20% (v/v)
nước dừa non; 30 g/l sucrose; 1 g/l than hoạt tính; 9 g/l agar cho sự tái sinh mô sẹo Cấy chuyền các
mô sẹo này sang môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 20% (v/v) nước dừa non; 1 g/l than hoạt tính; 9 g/l agar cho sự phát sinh phôi vô tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự., 2009) Các phôi thu được có dạng xốp, màu vàng nhạt được dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm trong nghiên cứu này (Hình 1)
Phương pháp
Môi trường nuôi cấy
Trong các nghiệm thức thí nghiệm, môi trường căn bản được sử dụng là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) Ngoài môi trường nuôi cấy khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin còn bổ sung thêm các thành phần sau: 0,5 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 30 g/l sucrose; 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; pH = 5,8 được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121o
C, 1 atm trong 25 phút
Tùy từng thí nghiệm, nước dừa già sẽ được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau
Bố trí thí nghiệm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nước dừa già (nước dừa được lấy từ những quả dừa có cơm dày khoảng 0,5 - 1 cm) đến khả năng phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp
Các mẫu phôi có trọng lượng tươi trung bình 0,1 g và chứa khoảng 158,9 phôi/mẫu cấy được cấy vào các bình có chứa 30 ml môi trường MS bổ sung nước dừa già với nồng độ khác nhau (v/v)
kết hợp với 0,5 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 30 g/l sucrose, 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính
Điều kiện nuôi cấy
- Thời gian chiếu sáng : 10 giờ/ngày
- Cường độ ánh sáng : 2.500 – 3.000 lux
- Nhiệt độ : 25 ± 2oC
- Độ ẩm trung bình : 75 – 80%
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Ảnh hưởng của nước dừa già lên sự phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp sau 12 tuần nuôi cấy
Sau 12 tuần nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu nhận kết quả ở các nghiệm thức thí nghiệm và
Trang 3thuận với thời gian nuôi cấy Thời gian đầu sau khi nuôi cấy phôi tăng sinh chậm, đến tuần thứ 4 tốc
độ tăng sinh bắt đầu gia tăng và đến tuần thứ 8 phôi tiếp tục tăng sinh mạnh, một số các phôi xuất hiện trước (các phôi nằm phía trên) bắt đầu biệt hóa tạo cấu trúc PLB, các PLB gia tăng kích thước
và khối lượng và phát triển thành cây con hoàn chỉnh Còn các phôi mới tiếp tục được tạo ra thường
là phần mẫu cấy tiếp xúc với môi trường thạch Đến thời điểm này trên các mẫu cấy đã có sự khác biệt rõ rệt về hình thái và cấu trúc Đến tuần thứ 12, mẫu cấy xuất hiện cả ba dạng cấu trúc là: phôi, PLB và chồi với số lượng lớn Đặc biệt, kết quả thí nghiệm cho thấy việc bổ sung 30% nước dừa già (v/v) cho hệ số nhân giống cao nhất, với số lương phôi sau 12 tuần nuôi cấy nhiều gấp 8,4 lần so với mẫu cấy ban đầu, tạo ra 311,4 PLB/mẫu cấy và 50,9 chồi/mẫu cấy
Nước dừa là dạng phôi nhũ lỏng có chứa nhiều thành phần có nồng độ khác nhau, người ta
đã chứng minh được trong nước dừa có chứa zeatin (Letham, 1974) Cấu trúc của zeatin gần giống với kinetin nhưng hoạt tính cao hơn khoảng 10 lần Zeatin có trong nước dừa là một loại cytokinin, chất này làm tăng hoạt động phân chia tế bào trong điều kiện có auxin, giúp gia tăng kích thước tế bào và tổng hợp protein Đồng thời trong nước dừa có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng chưa xác định, các thành phần dinh dưỡng bổ sung này sẽ giúp thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào Theo phân tích thành phần dinh dưỡng của tổ chức y tế thế giới (WHO) thì trong nước dừa có chứa protein, hydratecarbon, calcium, sắt và một số vitamine như thiamine, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường Mặc dù protein trong nước dừa đã bị loại bỏ do sự kết tủa trong quá trình lưu giữ lâu dài, nhưng các thành phần đa dạng khác của nước dừa đã cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong việc kích thích sự tăng trưởng và nhân số lượng tế bào
Theo Vũ Văn Vụ (1993), nước dừa có chứa khá nhiều hợp chất nitrogen dạng khử như các acid amine, ngoài ra trong nước dừa còn chứa các hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinine Trong nghiên cứu này, việc bổ sung nước dừa đã làm thay đổi nồng độ và loại cytokinin trong môi trường nuôi cấy Bổ sung nước dừa kích thích phôi tăng sinh, tạo nhiều phôi mới, các phôi xuất hiện trước sẽ định hướng phát triển thành PLB, các PLB gia tăng kích thước và có màu đậm dần sau đó phát triển thành chồi
Nghiên cứu này cho thấy nước dừa già cũng có tác dụng tích cực lên quá trình phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp Khi bổ sung nước dừa già với các nồng độ từ 10 đến 30% (v/v), thì khả năng tăng sinh phôi, khả năng biệt hóa thành PLB và khả năng phát triển chồi của mẫu cấy tăng dần (hình 2) Trong đó, nồng độ nước dừa già là 30% (v/v) cho kết quả tăng sinh phôi, biệt hóa PLB
và phát triển chồi tối ưu nhất, kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu về sự tăng sinh phôi lan
Hồ điệp của Trịnh Thị Hương và cộng sự (2009)
Tuy nhiên khi tăng nồng độ nước dừa già lên 40% (v/v) thì kết quả lại ngược lại, mẫu cấy kém phát triển ngay từ giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, sau đó mẫu cấy hóa nâu và chết dần Điều này cho thấy khi gia tăng nồng độ nước dừa đồng nghĩa với việc tăng thêm các hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinine lên cao vượt quá nhu cầu cần thiết của phôi không thích hợp cho mẫu cấy phát triển, thậm chí còn gây tác dụng xấu lên mẫu cấy khiến mẫu cấy hóa nâu và chết dần
Trang 4Hình 2 Ảnh hưởng của nước dừa già lên khả năng phát sinh hình thái của phôi lan Hồ điệp sau 12 tuần nuôi
cấy [A0, A1, A2, A3, A4 tương ứng với nồng độ nước dừa già là 0%; 10%; 20%; 30%; 40% (v/v)] Trong nuôi cấy mô lan, nước dừa rất thích hợp là nguồn dinh dưỡng dồi dào, cung cấp đạm và carbohydrate (sucrose, glucose, fructose,…) Ngoài ra, nước dừa còn chứa một số chất điều hòa sinh trưởng, được biết đến nhiều nhất là zeatin (Arditti, 1992) Các nghiên cứu về nuôi cấy mô lan cho thấy mô cấy tăng sinh nhanh trên môi trường bổ sung nước dừa Ở quả dừa non hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trong nước dừa non hơn cao hơn so với trong nước của quả dừa già Do vậy, khi nuôi cấy mô lan thường sử dụng nước dừa non để bổ sung vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, mục tiêu của nhân giống vô tính, ngoài gia tăng hệ số nhân giống, cây giống đồng nhất về mặt di truyền có chất lượng cao, thì giá thành cũng là điều đáng quan tâm Vì thế, trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng nước dừa già cũng thích hợp cho nuôi cấy mô lan từ đó có thể sử dụng
nước dừa già thay thế cho nước dừa non nhằm giảm chi phí sản xuất cây giống in vitro
KẾT LUẬN
Sau 12 tuần nuôi cấy phôi lan Hồ điệp trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 30 g/l surose, nếu bổ sung từ 10% đến 30% nước dừa (v/v) thì mẫu cấy phôi tăng sinh, biệt hóa PLB và phát triển chồi, trong đó, việc bổ sung 30% (v/v) nước dừa già ở nghiệm thức A3 cho kết quả tăng sinh phôi, biệt hóa PLB và phát triển chồi tối ưu nhất Các phôi này dạng xốp có màu vàng nhạt, thường xuất hiện ở phần mẫu cấy tiếp xúc với môi trường thạch, các PLB và chồi nằm phía trên của mẫu cấy
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Arditti (1992) Fundamentals of orchid biology – Jonh Wiley and Sons Inc New York, U.S.A Dương Tấn Nhựt, Hồng Ngọc Trâm, Nguyễn Phúc Huy và Đinh Văn Khiêm, 2009 Ảnh hưởng của
Trang 5CNSH toàn quốc – khu vực phía Nam năm 2009
Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lý thực vật ứng dụng NXB Giáo Dục
