Xuất phát từ giá trị dược liệu và kinh tế của nấm Linh chi cũng như nhu cầu thực tế xã hội, đề tài: “Phân lập và nuôi trồng nấm Linh chi trong điều kiện bán tự nhiên” được thực hiện nhằ
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Nấm Linh Chi
- Địa điểm: Khoa CNSH-CNTP, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên
Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Phân lập giống nấm Linh chi
- Nội dung 2: Sản xuất meo nấm
- Nội dung 3: Sản xuất thể quả nấm Linh chi
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Nội dung 1: Phân lập giống nấm Linh chi
Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau tới khả năng phát triển của mảnh mô thể quả nấm Linh chi
Thí nghiệm được thực hiện trên ba loại môi trường khác nhau gồm môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), môi trường YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) và môi trường PDA trên tăm bông Quá trình chuẩn bị các môi trường này đã được thực hiện theo các quy trình chuẩn để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả Môi trường PDA là nền tảng phổ biến để nuôi cấy nấm và thực hiện các phân tích sinh học, trong khi môi trường YEPD thường được sử dụng để tăng cường sự phát triển của nấm men Việc sử dụng môi trường PDA trên tăm bông giúp đơn giản hóa quá trình truy vết và phân tích mẫu vật.
Môi trường PDA (Potato dextrose agar): Khoai tây: 200g/l, đường:
Đầu tiên, chuẩn bị môi trường cấy với hàm lượng 20g/l và agar 15g/l, hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 30 phút ở áp suất 1 atm để đảm bảo vô trùng Quả thể tươi được phun cồn 70°C trước khi đưa vào hộp cấy nhằm tiêu diệt vi khuẩn tối đa Dao và kẹp vô trùng được hơ qua lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ rồi để nguội để đảm bảo dụng cụ sạch sẽ Mẫu quả thể tươi được xé đôi bằng tay, sau đó dùng dao cắt lấy mảnh mô lõi khoảng 0,5-1cm² để cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn Quá trình cấy được thực hiện trong điều kiện kín khí, bọc bằng túi nilon vô trùng, và môi trường nuôi cấy duy trì ở nhiệt độ 20-30°C trong điều kiện không ánh sáng để hỗ trợ sự phát triển của mẫu mô.
Để bắt đầu quá trình mất mô, dùng tay xé đôi thể quả hoặc dùng dao cắt lấy mảnh mô lõi kích thước khoảng 0,5-1cm2, sau đó cấy mảnh mô vào môi trường đã chuẩn bị Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong điều kiện không có ánh sáng, duy trì ở nhiệt độ 20-30°C để đảm bảo sự phát triển tối ưu của mô tục.
Môi trường YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) bao gồm các thành phần chính như đường (20g/l), agar (20g/l), peptone (5g/l), và cao nấm men (3g/l), được hấp khử trùng ở 121°C trong 30 phút với áp suất 1 atm để đảm bảo an toàn và sạch khuẩn Trước khi đưa quả thể tươi vào môi trường, quả thể được xịt cồn 70°C để diệt khuẩn Dao và kẹp được hơ qua ngọn lửa đèn cồn và để nguội nhằm đảm bảo vô trùng Mẫu vật sau đó được xé đôi thủ công và cắt lấy mảnh mô lõi có kích thước khoảng 0,5-1cm² để cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn Quá trình nuôi cấy diễn ra trong điều kiện không có ánh sáng và ở nhiệt độ từ 20-30°C để tối ưu hóa sự sinh trưởng của nấm.
Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của mốc xanh trên môi trường phân lập nấm Linh chi
Mốc xanh là loại vi sinh vật gây nhiễm phổ biến trong quá trình nuôi trồng và tạo thể quả nấm Linh chi Để hạn chế sự lây nhiễm của mốc xanh, môi trường YEPD đã được bổ sung NaCl ở các nồng độ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, sau đó hấp khử trùng ở 121°C trong 30 phút ở áp suất 1 atm Mẫu nấm mốc xanh được lấy từ các túi nấm nhiễm bệnh và cấy lên môi trường để theo dõi khả năng phát triển của nấm sau 3-5 ngày nuôi cấy trong điều kiện thường.
Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của sợi nấm Linh chi
Muối ăn (NaCl) được kỳ vọng có khả năng ức chế một số loại vi sinh vật gây nhiễm trùng, tuy nhiên cũng có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Linh chi Để đánh giá tác động của nồng độ NaCl, môi trường YEPD đã được bổ sung với các nồng độ từ 1% đến 5% Quá trình hấp khử trùng được thực hiện ở 121°C trong 30 phút dưới áp suất 1 atm Mẫu thạch chứa sợi nấm khoảng 0,5-1cm2 được cấy vào môi trường, sau đó nuôi cấy trong điều kiện tối, nhiệt độ từ 20-30°C để quan sát sự phát triển của nấm Linh chi trên các nồng độ muối khác nhau.
3.3.2 Nội dung 2: Sản xuất meo nấm
Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của loại cơ chất tới khả năng sinh trưởng của nấm Linh chi
Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại cơ chất khác nhau gồm hỗn hợp thóc và CaCO3, hỗn hợp mùn cưa và cám, hỗn hợp thóc và mùn cưa
Để sản xuất meo nấm từ hỗn hợp thóc và bột CaCO₃, cần bắt đầu bằng việc cân lượng thóc phù hợp rồi rửa sạch với nước để loại bỏ bụi bẩn và hạt lép Thóc sau đó được ngâm trong nước sạch khoảng 12 giờ giúp mềm và dễ nảy mầm Tiếp theo, đưa thóc vào nồi và luộc cho đến khi vỏ hạt nứt để đảm bảo khả năng sinh trưởng tốt của meo nấm Sau khi luộc, vớt thóc ra để ráo và để khô trong khoảng 20-30 phút nhằm giảm hàm lượng nước, chuẩn bị cho quá trình lên men tiếp theo.
Bổ sung 1% bột CaCO3 vào nguyên liệu, trộn đều và đóng gói trong túi nilon để chuẩn bị Tiếp theo, tiến hành hấp khử trùng với nhiệt độ 121°C trong vòng 3 giờ ở áp suất 1atm để đảm bảo vệ sinh Sau đó, lấy một mảnh thạch chứa sợi nấm từ môi trường agar cấy vào túi thóc để nuôi cấy Quá trình nuôi cấy diễn ra trong điều kiện ít ánh sáng, ở nhiệt độ phòng, và được theo dõi theo chu kỳ 3 ngày để đánh giá sự sinh trưởng của nấm.
Sản xuất meo nấm từ hỗn hợp mùn cưa và cám bắt đầu bằng việc lấy đủ lượng mùn cưa, tưới nước để tạo độ ẩm phù hợp Sau đó, bổ sung 5% cám gạo, trộn đều và đóng vào túi nilon Quá trình hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 3 giờ dưới áp suất 1 atm giúp đảm bảo môi trường vô trùng Tiếp theo, từ môi trường agar, cấy một mảnh thạch chứa sợi nấm vào túi thóc để nuôi cấy Quá trình nuôi cấy diễn ra trong điều kiện ít ánh sáng, ở nhiệt độ phòng và được theo dõi định kỳ cứ mỗi 3 ngày để đảm bảo sự phát triển của nấm.
Sản xuất meo nấm từ hỗn hợp thóc và mùn cưa bắt đầu bằng việc rửa sạch thóc để loại bỏ bụi bẩn và hạt lép, sau đó ngâm trong nước sạch khoảng 3 giờ Thóc được luộc đến khi vỏ nứt, rồi để khô 20-30 phút để giảm độ ẩm Tiếp theo, bổ sung 10% mùn cưa vào hỗn hợp, trộn đều và hấp khử trùng ở 121°C trong 3 giờ với áp suất 1atm Hỗn hợp đã vệ sinh được đóng vào túi nilon, sau đó cấy mảnh sợi nấm từ môi trường agar vào túi thóc Quá trình nuôi cấy diễn ra trong điều kiện ít ánh sáng, ở nhiệt độ phòng, theo dõi định kỳ mỗi 3 ngày để đảm bảo khả năng phát triển của nấm.
Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của loại giống cấy
Chuẩn bị hỗn hợp thóc bổ sung 10% mùn cưa, trộn đều, hấp khử trùng
Trong quá trình nuôi cấy, nấm phát triển ở nhiệt độ 0°C trong 3 giờ dưới áp suất 1 atm Hai phương pháp giống nấm được sử dụng gồm giống trên môi trường agar và giống mọc trên tăm bông cấy vào túi cơ chất Quá trình nuôi cấy diễn ra trong điều kiện ít ánh sáng, tại nhiệt độ phòng, với quá trình theo dõi diễn ra theo chu kỳ 3 ngày để đánh giá sự phát triển của nấm.
Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ mùn cưa phối trộn với cơ chất thóc trong sản xuất meo nấm
Đầu tiên, cần chuẩn bị lượng thóc phù hợp, rửa sạch bằng nước để loại bỏ bụi bẩn và hạt lép, sau đó ngâm trong nước sạch khoảng 3 giờ để mềm Tiếp theo, cho thóc vào nồi và luộc đến khi vỏ hạt nứt để đảm bảo thóc chín đều Sau khi luộc, vớt thóc ra để khô trong vòng 20-30 phút nhằm giảm độ ẩm và giúp thóc ráo nước Tiếp theo, trộn đều thóc với mùn cưa theo tỷ lệ lần lượt 0%, 5%, 10%, 15% và 20% Cho hỗn hợp vào túi nilon vừa đủ rồi tiến hành hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 3 giờ dưới áp suất 1 atm để đảm bảo tiêu diệt vi khuẩn Cuối cùng, sử dụng kẹp hơ trên ngọn lửa đèn cồn để làm nguội và hoàn thiện quy trình xử lý thóc và mùn cưa sạch sẽ, an toàn.
Để thực hiện phương pháp nuôi cấy hệ sợi trên tăm bông, chúng ta bắt đầu bằng cách cấy hai chiếc tăm bông vào hai mặt đối diện của túi thóc Sau đó, buộc kín miệng túi để tránh nhiễm khuẩn và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nuôi cấy Quá trình nuôi cấy diễn ra trong điều kiện ánh sáng yếu nhằm đảm bảo sự phát triển tối ưu của hệ sợi nấm hoặc vi sinh vật mong muốn, từ đó nâng cao hiệu quả nghiên cứu hoặc ứng dụng sản xuất.
3.3.3 Nội dung 3: Sản xuất thể quả nấm Linh chi
Thí nghiệm 1: Sản xuất thể quả nấm Linh chi sử dụng lớp đất che phủ
Nguyên liệu sản xuất thể quả trong nghiên cứu bao gồm mùn cưa và thân gỗ keo, trong đó các đoạn gỗ keo có đường kính khoảng 10 cm trở lên được cắt thành đoạn ngắn khoảng 20-30 cm, ngâm trong nước 12 giờ, sau đó để ráo nước và hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 3 giờ dưới áp suất 1atm Quá trình cấy giống cấp 2 sử dụng khoảng 2-3 thìa giống cho mỗi bịch nấm, được nuôi ở nhiệt độ phòng, ít hoặc không có ánh sáng Khi sợi nấm lan phủ kín cơ chất, túi bóng được loại bỏ, rồi chuyển vào các khay đất ẩm có lỗ thoát nước, với phần đầu của khối gỗ keo để hở lên mặt đất Quá trình nuôi cấy diễn ra dưới bóng cây, được tưới nước đẫm để duy trì độ ẩm nhưng không để bề mặt đất khô.
Với cơ chất mùn cưa, phối trộn cám tỉ lệ 5%, hấp khử trùng 121 0 C trong