Tham dinh phuong phap doc VIỆN KIỂM NGHIỆM AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM QUỐC GIA THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌC VÀ VI SINH VẬT NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT HÀ NỘI Chủ biên DS Trần Cao.
CÁC YÊU CẦU CHUNG
Khái niệm về thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp là quá trình kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan để xác nhận rằng phương pháp đáp ứng các yêu cầu đặt ra (fitness for the purpose) Kết quả của quá trình thẩm định giúp đánh giá chất lượng và độ tin cậy của kết quả phân tích, đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của dữ liệu thu được Thẩm định phương pháp phân tích là bước không thể thiếu trong quá trình đảm bảo chất lượng, giúp nâng cao độ tin cậy của các kết quả phân tích trong nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn.
Hiện nay, nhiều thuật ngữ khác nhau được sử dụng để chỉ khái niệm thẩm định phương pháp, như định trị phương pháp, đánh giá phương pháp, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp hay phê duyệt phương pháp Tất cả những thuật ngữ này đều đề cập đến quá trình xác nhận tính chính xác, độ chính xác và phù hợp của phương pháp phân tích, đảm bảo tính khả thi và độ tin cậy trong ứng dụng Thẩm định phương pháp (method validation) là bước quan trọng trong quá trình phát triển phương pháp phân tích để đảm bảo chất lượng và độ chính xác của kết quả.
Phòng thử nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau Dựa vào nguồn gốc có thể phân loại các phương pháp thành hai nhóm:
Các phương pháp tiêu chuẩn là những phương pháp thử nghiệm được công nhận rộng rãi trên toàn thế giới, bao gồm các tiêu chuẩn quốc gia như TCVN, các tiêu chuẩn quốc tế như ISO, ASTM và AOAC Đây đảm bảo tính chính xác, độ tin cậy và khả năng giao nhận kết quả trong các hoạt động thử nghiệm, nghiên cứu khoa học và sản xuất Việc áp dụng các phương pháp chuẩn này giúp nâng cao chất lượng sản phẩm và đảm bảo tiêu chuẩn an toàn theo quy định của các tổ chức quốc tế và trong nước.
Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ (non-standard/alternative/in-house method) bao gồm các phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng, dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị hoặc theo các tài liệu, tạp chí chuyên ngành Những phương pháp này thường được sử dụng trong quá trình thử nghiệm để đáp ứng các yêu cầu đặc thù hoặc khi không có tiêu chuẩn chính thức áp dụng, đảm bảo tính linh hoạt và phù hợp với từng điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm.
Theo yêu cầu của ISO 17025, phương pháp phân tích phải được thẩm định hoặc thẩm định lại khi:
- Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn (non- standard method)
- Phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa vào sử dụng thành thường quy
- Có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp dụng của phương pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn
Có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được thẩm định, chẳng hạn như sử dụng thiết bị phân tích mới với đặc tính khác, nền mẫu thay đổi hoặc người phân tích khác, điều này có thể ảnh hưởng đến độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn (method verification)
Trước khi áp dụng một phương pháp phân tích, cần có chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng các yêu cầu đặt ra thông qua quá trình thẩm định, đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả Quá trình thẩm định này không chỉ áp dụng cho các phương pháp thử nội bộ mà còn quan trọng đối với các phương pháp tiêu chuẩn, nhằm đảm bảo phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế và yêu cầu cụ thể của từng lĩnh vực Tuy nhiên, thẩm định phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp nội bộ có những khác biệt rõ ràng, do đó, việc lập kế hoạch thẩm định cần phải được thực hiện cẩn thận để đảm bảo tính hợp lệ và hiệu quả của quá trình đánh giá.
Có hai yêu cầu chủ yếu của việc thẩm định phương pháp tiêu chuẩn:
- Phải có kết quả thẩm định của phương pháp tiêu chuẩn, và kết quả này phải phù hợp với yêu cầu của phòng thử nghiệm
- Phòng thử nghiệm cần đảm bảo có thể đạt được các thông số được mô tả trong phương pháp tiêu chuẩn
Theo yêu cầu của ISO 17025, các phòng thử nghiệm muốn áp dụng phương pháp tiêu chuẩn cần có hồ sơ đánh giá các điều kiện cơ bản và nguồn lực phù hợp Việc này nhằm đảm bảo kết quả thử nghiệm đạt độ chính xác yêu cầu hoặc mong muốn của phòng thử Đối với các phương pháp thử đã ban hành nhưng thiếu dữ liệu về độ chính xác, phòng thử nghiệm phải xác định dữ liệu này dựa trên dữ liệu nghiên cứu thử nghiệm Để xây dựng quy trình thẩm định phương pháp tiêu chuẩn, cần thực hiện kiểm tra các bước cụ thể trong quy trình đánh giá.
1 Phương pháp đã được thẩm định hay chưa, thẩm định toàn bộ hay một phần?
2 Nền mẫu có giống nhau hay không?
3 Khoảng làm việc của phương pháp có phù hợp với yêu cầu của phòng thử nghiệm hay không?
4 Có cùng loại thiết bị (hãng sản xuất, model) hay không? Phương pháp tiêu chuẩn có cho sử dụng các loại thiết bị khác không?
5 Có những lưu ý gì đặc biệt của phương pháp tiêu chuẩn mà phòng thử nghiệm không thể đáp ứng không?
Trong quá trình đánh giá phương pháp, nếu một trong các yếu tố không phù hợp, phòng thử nghiệm cần thực hiện các phép thử để xác định lại độ phù hợp của phương pháp Các kết quả đánh giá này phải tương ứng với kết quả thẩm định của phương pháp chuẩn, nhằm đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của phương pháp Trong trường hợp kết quả không phù hợp, cần thẩm định lại toàn bộ phương pháp để đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng và tuân thủ quy định.
Việc đánh giá bao gồm:
1 Khẳng định tình trạng đầy đủ thiết bị, nhân viên, thuốc thử, môi trường và các điều kiện khác để thực hiện phép thử
2 Kiểm tra các thông số cơ bản nhất của phương pháp, theo yêu cầu cụ thể của từng lĩnh vực hóa học và vi sinh sẽ được mô tả chi tiết trong các chương sau.
Thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn (method validation)
Phương pháp không tiêu chuẩn đòi hỏi quy trình thẩm định phức tạp hơn, bắt đầu từ nghiên cứu khảo sát, sau đó tối ưu hóa phương pháp đến khi hoàn thiện Thẩm định phương pháp là yêu cầu bắt buộc để đảm bảo tính khả thi trước khi phát triển và ứng dụng các phương pháp không tiêu chuẩn vào thực tiễn Các bước thẩm định bao gồm nhiều giai đoạn, nhằm đảm bảo chất lượng và độ chính xác của phương pháp trước khi đưa vào sử dụng thường quy.
1 Xây dựng SOP dự kiến (theo các tài liệu tham khảo hoặc theo các nghiên cứu xây dựng phương pháp mới)
2 Xây dựng đề cương (kế hoạch) thẩm định bao gồm: a Xác định thời gian và người thực hiện b Chất cần phân tích: tên chất, dự đoán hàm lượng trong mẫu c Xác định đối tượng thẩm định: nền mẫu d Xác định mục đích cần phải đạt: yêu cầu về giới hạn cho phép (nếu có), cần đạt LOD, LOQ, độ chính xác bao nhiêu? e Xác định các thông số cần thẩm định và khoảng chấp nhận f Xác định các thí nghiệm cần thực hiện
3 Kiểm tra các điều kiện cần cho công việc thẩm định a Các yêu cầu về trang thiết bị b Hóa chất, thuốc thử c Mẫu thí nghiệm
4 Thực hiện thẩm định a Các phép thử thẩm định sơ bộ b Thay đổi các thông số của phương pháp (nếu cần) c Thực hiện thẩm định hoàn thiện
5 Hoàn thiện SOP của phương pháp
6 Báo cáo thẩm định: cần có các thông tin sau a Tên người thẩm định, thời gian thẩm định b Tóm tắt phương pháp: nguyên lý, thiết bị, hóa chất, quy trình, các lưu ý c Các kết quả thẩm định d Các yêu cầu cần đáp ứng để đưa phương pháp vào thực hiện thường xuyên (routine): kiểm tra tính tương thích của hệ thống, mẫu QC, ước lượng độ không đảm bảo đo của kết quả e Xác định các thông số và thời gian cần thẩm định lại f Tài liệu tham khảo (nếu có) g Kết luận và đề xuất (nếu có) h Ký tên, ngày của người làm báo cáo i Ký phê duyệt của người có thẩm quyền
Thẩm định lại
Thẩm định phương pháp cần được thực hiện liên tục trong quá trình áp dụng, không chỉ một lần trong giai đoạn phát triển ban đầu Các điều kiện thực hiện phương pháp có thể thay đổi như đối tượng áp dụng, địa điểm, nhân viên, thiết bị, điều kiện môi trường, dung môi, hóa chất thử, và các yếu tố nhỏ khác như nhiệt độ cột phân tích hay pH pha động Khi kết quả phân tích kiểm tra chất lượng hoặc đánh giá hệ thống vượt quá giới hạn cho phép, phương pháp phải được thẩm định lại để đảm bảo tính chính xác Phòng thử nghiệm nên tích hợp quy trình thẩm định lại phương pháp với quá trình kiểm tra độ ổn định của phương pháp trong vận hành hàng ngày Các thông số cần thẩm định lại phụ thuộc vào mức độ ảnh hưởng của các thay đổi đối với phương pháp; chủ yếu là các tham số cơ bản như trong các phương pháp tiêu chuẩn, và nếu kết quả thẩm định mới khác biệt lớn so với ban đầu, cần thực hiện thẩm định toàn bộ phương pháp.
Các chương sau sẽ cung cấp các khái niệm chính liên quan đến thẩm định phương pháp phân tích hóa học và vi sinh, giúp độc giả hiểu rõ hơn về quy trình và tiêu chuẩn kỹ thuật Đồng thời, nội dung còn hướng dẫn các cách bố trí thí nghiệm tối ưu để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích Ngoài ra, phần này cũng trình bày các phương pháp kiểm soát chất lượng nhằm đảm bảo kết quả thử nghiệm đạt tiêu chuẩn và phục vụ tốt cho công tác đánh giá chất lượng.
THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC
Tính đặc hiệu/chọn lọc
Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện chính xác chất phân tích khi có mặt các tạp chất như tiền chất, chất chuyển hóa, chất tương tự và tạp chất khác Trong phân tích định tính, yêu cầu là phải chứng minh được kết quả dương tính khi chất phân tích có mặt và âm tính khi không có mặt, đồng thời không bị ảnh hưởng bởi các chất cấu trúc gần giống để đảm bảo tính chính xác Đối với phân tích định lượng, tính đặc hiệu thể hiện khả năng xác định chính xác nồng độ chất phân tích trong mẫu, ngay cả khi mẫu có chứa các yếu tố gây nhiễu, nhằm đảm bảo kết quả phân tích chính xác và tin cậy.
Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích
Tính chọn lọc là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, phản ánh khả năng phân biệt và xác định chính xác một hoặc nhiều chất trong cùng một quy trình phân tích Khi chất cần xác định phải phân biệt rõ với các chất khác, phương pháp phân tích cần có tính chọn lọc cao để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích Tính chọn lọc đóng vai trò quan trọng trong các phương pháp phân tích hóa học nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện và định lượng các hợp chất cụ thể trong mẫu phân tích phức tạp.
Tính chọn lọc thường bao trùm cả tính đặc hiệu trong quá trình phân tích Do các phương pháp phân tích thường phát hiện nhiều chất cùng xuất hiện, nên khái niệm về tính chọn lọc thường mang tính tổng quát hơn Việc hiểu rõ tính chọn lọc giúp nâng cao hiệu quả phân tích và xác định chính xác các thành phần cần thiết trong mẫu phân tích.
1.2.1 Trường hợp chung Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp định tính, định lượng cần bố trí các thí nghiệm như sau:
Trong quá trình phân tích mẫu, cần chú ý đến các mẫu trắng và đảm bảo chúng xuất hiện tối thiểu 6 lần đối với từng loại nền mẫu để đảm bảo độ chính xác Mẫu trắng không được đưa vào phân tích tín hiệu nhằm tránh gây nhiễu hoặc sai lệch kết quả Nếu mẫu trắng xuất hiện hơn 10% các mẫu dương tính hoặc có tín hiệu rõ ràng, cần thay đổi phương pháp phân tích để loại bỏ tác động của mẫu trắng, từ đó nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích Việc kiểm soát các mẫu trắng đóng vai trò quan trọng trong quy trình phân tích, giúp giảm thiểu ảnh hưởng của các yếu tố nhiễu và đảm bảo phản ánh đúng trạng thái của mẫu thử.
Phân tích mẫu thử hoặc mẫu trắng thêm chuẩn ở hàm lượng gần giới hạn phát hiện tối thiểu (LOQ) với ít nhất 6 lần lặp lại để đảm bảo độ chính xác và đáng tin cậy của kết quả Trong quá trình phân tích, cần so sánh các kết quả thu được với mẫu trắng để xác định sự hiện diện của tín hiệu của chất cần phân tích, đảm bảo phương pháp phân tích đáp ứng các yêu cầu về độ nhạy và độ độ lặp lại.
Phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu (co-chromatography) thường được áp dụng trong các phương pháp sắc ký để đánh giá tính đặc hiệu và chọn lọc của phương pháp phân tích Sau khi chuẩn bị mẫu (mẫu trắng hoặc mẫu thực) và phân tích trên thiết bị sắc ký, ta thu được các pic sắc ký; sau đó, thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất và phân tích lại So sánh sắc ký đồ của hai mẫu giúp xác định mức độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp phân tích, từ đó nâng cao độ chính xác và tin cậy trong kết quả phân tích.
Trong phân tích mẫu không có chất phân tích nhưng chứa chất cấu trúc tương tự chất phân tích, kết quả cần phải cho ra âm tính theo phương pháp định tính và không làm ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả định lượng của chất phân tích Điều này đảm bảo độ tin cậy và chính xác của quá trình phân tích, phù hợp với các quy chuẩn kiểm nghiệm.
Trong trường hợp không có mẫu trắng để xác định tính chọn lọc hoặc đặc hiệu của chỉ tiêu phân tích, có thể sử dụng mẫu trắng thuốc thử (reagent blank) để thực hiện các thí nghiệm Phương pháp này bao gồm phân tích các bước tương tự như khi phân tích mẫu thực tế, nhưng không có mẫu thử, giúp đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
1.2.2 Các trường hợp đặc biệt
• Sắc ký lỏng sử dụng detector DAD (mảng diod)
Tính chọn lọc trong sắc ký lỏng được cải thiện nhờ lựa chọn cột phù hợp, điều kiện sắc ký tối ưu, nhiệt độ cột và bước sóng phù hợp Việc tối ưu hóa giai đoạn xử lý mẫu cũng đóng vai trò quan trọng để đạt được độ chọn lọc cao nhất Trong quá trình phân tích, cần xác định rõ liệu píc sắc ký là một píc đơn hay có chứa các tạp chất khác để đảm bảo độ chính xác kết quả Các hệ thống sắc ký có detector mảng di độ (DAD) giúp đánh giá tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết của píc hoặc so sánh phổ của píc với thư viện phổ đã lưu, từ đó nâng cao độ tin cậy của phân tích.
Độ tinh khiết của píc trong sắc ký lỏng HPLC-DAD được xác định bằng cách so sánh phổ tại các điểm khác nhau trên píc, phổ biến nhất là tại đỉnh píc (apex) và hai điểm bên sườn (upslope và downslope), thường chọn tại 2/3 độ rộng của píc về hai phía Hiện nay, nhiều thiết bị HPLC hiện đại tích hợp phần mềm tự động tính toán độ tinh khiết dựa trên 3, 5, 7 điểm hoặc toàn bộ các điểm của píc, giúp đo lường chính xác và nhanh chóng hơn.
Hình 2: Các cách xác định độ tinh khiết của pic sắc ký HPLC-DAD
So sánh phổ của píc với phổ chuẩn là phương pháp phổ biến để xác định độ tinh khiết của píc Một píc được xem là không tinh khiết khi hệ số match không đạt gần 100%, tuy nhiên, giá trị này càng gần 100% cũng không đảm bảo chắc chắn về độ tinh khiết do có thể xuất phát từ các nguyên nhân khác nhau.
- Tạp chất tồn tại với lượng thấp hơn nhiều so với chất phân tích do đó phổ UV-Vis không ảnh hưởng nhiều đến phổ của chất phân tích
- Phổ của tạp chất và chất phân tích tương tự nhau
Các thiết bị sắc ký khí tích hợp detector MS giúp phân tích chính xác các hợp chất hóa học Quá trình so sánh phổ của chất phân tích với phổ chuẩn trong thư viện hoặc phổ của chất chuẩn tương ứng là bước quan trọng để xác định thành phần mẫu Việc này đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong phân tích, nâng cao hiệu quả của phương pháp sắc ký khí.
Sử dụng các phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất hiệu quả để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp phân tích Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) nhằm xác định chính xác sự hiện diện của một chất trong mẫu Cách tính điểm IP cho các kỹ thuật khối phổ khác nhau được quy định rõ ràng, giúp đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong quá trình phân tích.
Bảng 3: Quan hệ giữa các kỹ thuật khối phổ và số điểm IP đạt được
Kỹ thuật khối phổ Số điểm IP đạt được với 1 ion
MS phân giải thấp (LR-MS) 1,0
MS phân giải cao (HR-MS) 2,0
Bảng 4: Ví dụ về số điểm IP đạt được đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau
Kỹ thuật Số ion Số điểm IP
GCMS (EI và CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4
GCMS (EI hoặc CI) hai dẫn xuất
GC-MS-MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4
LC-MS-MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4
GC-MS-MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5
LC-MS-MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5
LC-MS-MS-MS 1 ion mẹ, 1 ion con và 2 ion cháu 5,5
GC-MS và LC-MS 2+2 4
Các thiết bị sắc ký khí tích hợp detector MS cho phép phân tích chính xác các hợp chất, bằng cách so sánh phổ của chất phân tích với phổ chuẩn có trong thư viện hoặc phổ của chất chuẩn tương ứng Điều này giúp xác định thành phần hóa học một cách nhanh chóng và chính xác, nâng cao độ tin cậy trong quá trình phân tích mẫu Sử dụng phương pháp so sánh phổ này là bước quan trọng trong công nghiệp phân tích chất lượng và nghiên cứu khoa học hương liệu, dược phẩm, và môi trường.
Phương pháp phân tích chloramphenicol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai bước cho phép xác định chính xác chất độc hại trong mẫu Trong quá trình phân tích, người ta thực hiện bắn phá ion mẹ m/z 321 và định lượng dựa trên ion con tạo thành là 152 và 194, đảm bảo độ chính xác cao Theo quy trình tính điểm IP, với mỗi ion mẹ và ion con thu được, phương pháp đạt 4 điểm IP, cho thấy khả năng đáp ứng yêu cầu về độ đặc hiệu và độ nhạy Đây là phương pháp phân tích đáng tin cậy, phù hợp trong kiểm nghiệm thực phẩm và dược phẩm.
Cần thực hiện thêm các phép thử trên mẫu trắng (n ³ 6) và mẫu có nồng độ gần LOQ (n ³ 6) để xác định chắc chắn phương pháp có tính đặc hiệu cao
Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là phạm vi nồng độ trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ của chất phân tích Đây là yếu tố rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích hóa học Khi nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính, các phép đo sẽ phản ánh chính xác mối quan hệ giữa các đại lượng, giúp các nhà phân tích đưa ra kết luận chính xác về hàm lượng chất cần xác định.
Khoảng làm việc của phương pháp phân tích là phạm vi nồng độ của chất phân tích nằm giữa giới hạn trên và giới hạn dưới, trong đó phương pháp đạt độ chính xác, độ đúng và độ tuyến tính đã xác định Điều này đảm bảo phương pháp phân tích có thể xác định chính xác nồng độ của chất cần phân tích trong phạm vi đã xác định Để dễ hình dung, hai khái niệm liên quan được minh họa rõ ràng trong hình 3 dưới đây, giúp làm rõ phạm vi hoạt động của phương pháp phân tích trong phân tích hóa học.
Hình 3: Khoảng tuyến tính (linear range) và khoảng làm việc
2.2 Cách xác đị nh kho ả ng tuy ế n tính Đối với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện việc xác định khoảng tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và kỹ thuật sử dụng Các chất khác nhau có khoảng tuyến tính khác nhau do sự khác nhau về tính chất lý hóa Trong khi các kỹ thuật sử dụng khác nhau ảnh hưởng lớn đến độ dài ngắn của khoảng tuyến tính Ví dụ, kỹ thuật HPLC nếu sử dụng detector UV-Vis hoặc DAD có thể cho khoảng tuyến tính đến 10 6 thậm chí đến 10 7 , trong khi nếu sử dụng detector huỳnh quang hay chỉ số khúc xạ thì chỉ cho khoảng tuyến tính khoảng 10 4 –
2.3 Xây d ự ng đườ ng chu ẩ n
Trong quá trình phân tích, cần xác định khoảng tuyến tính để xây dựng đường chuẩn phù hợp và hệ số hồi quy tương quan chính xác Để tối ưu hóa quá trình phân tích, có thể tạo các đường chuẩn ngắn trùm lên vùng nồng độ trong mẫu thay vì xây dựng đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính, giúp tiết kiệm thời gian và công sức Nồng độ trong mẫu phải nằm trong giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn, lý tưởng nhất là ở vùng giữa của đường chuẩn để đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích.
Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ thuật khác nhau, sau đây là các loại đường chuẩn chủ yếu:
2.3.1 Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết
Để xây dựng dãy nồng độ chuẩn, cần chuẩn bị tối thiểu 6 mức nồng độ khác nhau Tiếp theo, xác định các giá trị đo được y ứng với từng nồng độ x, thực hiện lặp lại ít nhất hai lần để tính trung bình các kết quả Nếu dữ liệu cho thấy mối quan hệ tuyến tính, ta có thể mô tả bằng phương trình y = ax + b, giúp dự đoán giá trị y dựa trên giá trị nồng độ x một cách chính xác.
Trong đó: a: giá trị độ dốc slope; b: giá trị hệ số chặn intercept và hệ số tương quan:
Nếu 0,995 < R ≤ 1: Có tương quan tuyến tính rõ rệt
Có thể khảo sát độ tuyến tính dựa vào tính hệ số đáp ứng (đồ thị dưới) Khoảng tuyến tính nằm trong khoảng đồ thị nằm ngang
Hình 4: Các cách lập đường chuẩn tuyến tính
2.3.2 Đường chuẩn trên mẫu trắng
Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ khác nhau (ít nhất 6 nồng độ), trong khoảng tuyến tính ước lượng ở trên, mỗi nồng độ làm 3 lần
Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ (trục hoành x) Tính các hệ số hồi quy (a, b trong phương trình hồi quy y
Đường chuẩn thường được xây dựng dựa trên nền mẫu trắng để đạt độ tin cậy cao hơn, vì có thể loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu, đặc biệt khi sử dụng hệ số tương quan (R) tương tự như các phương pháp trước đó Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khó tìm được mẫu trắng phù hợp mà không chứa chất phân tích, nên phương pháp lập đường chuẩn trên nền mẫu thực được xem như một giải pháp thay thế Phương pháp này giúp đảm bảo chính xác và khả năng phù hợp trong phân tích, đặc biệt khi điều kiện mẫu trắng không thuận lợi.
2.3.3 Đường chuẩn trên mẫu thực
Phân tích mẫu thực có thể thực hiện bằng cách thêm các nồng độ chuẩn khác nhau như trong phần làm với mẫu trắng để xây dựng đường chuẩn Vẽ đồ thị tín hiệu đo (trục tung y) so với nồng độ chuẩn thêm (trục hoành x) giúp xác định mối quan hệ giữa tín hiệu và nồng độ Dạng đường chuẩn trên nền mẫu thực thường có dạng như hình 5, thể hiện sự tỷ lệ thuận giữa tín hiệu đo và nồng độ chuẩn, giúp xác định chính xác nồng độ của mẫu thực.
Hình 5: Đường chuẩn trên nền mẫu thực
Sử dụng đường chuẩn trên nền mẫu thực giúp loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích, đảm bảo độ chính xác cao hơn Sau khi xác định phương trình đường chuẩn dạng y = ax + b, dễ dàng tính nồng độ chất cần phân tích theo công thức X = b/a Việc này giúp nâng cao độ tin cậy của phân tích và tối ưu quá trình đo lường trong phòng thí nghiệm.
2.3.4 Đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn
Trong phân tích hiện đại, phương pháp sử dụng nội chuẩn là một kỹ thuật rất hữu ích để nâng cao độ chính xác của kết quả đo Nội chuẩn được thêm vào dung dịch chuẩn với nồng độ phù hợp và đồng đều (CIS), giúp chuẩn hóa quá trình phân tích Để thực hiện, bạn vẽ đường cong phụ thể hiện mối quan hệ giữa tỷ lệ tín hiệu của ngoại chuẩn so với nội chuẩn (trục tung y) và nồng độ của ngoại chuẩn (trục hoành x) Từ đó, tính các hệ số hồi quy (a, b trong phương trình y = ax + b) và hệ số tương quan (R) để xác định độ phù hợp của mô hình phân tích Phương pháp này giúp cải thiện chính xác và độ tin cậy trong phân tích hóa học hiện đại.
Hình 6: Ví dụ đường chuẩn sử dụng chất nội chuẩn
Trong phân tích mẫu, việc thêm nội chuẩn từ đầu, sau khi cân và đong, là rất quan trọng để đảm bảo nồng độ cuối cùng bằng nồng độ nội chuẩn trong các dung dịch chuẩn, giúp hạn chế ảnh hưởng của quá trình phân tích lên kết quả Đặc biệt trong các kỹ thuật phân tích hiện đại như khối phổ, việc sử dụng nội chuẩn là điều bắt buộc để nâng cao độ chính xác Các chất nội chuẩn thường được lựa chọn là các chất đồng vị như 2H (D), 13C, 15N, giúp đảm bảo tính đặc hiệu cao trong phân tích Ví dụ, khi phân tích chloramphenicol, ngoài chất chuẩn ngoại là chloramphenicol, sử dụng thêm chloramphenicol-d5; với clenbuterol, dùng clenbuterol-d9; còn melamin thường sử dụng nội chuẩn melamin-đồng vị.
Các đồng vị 13C và 15N có ưu điểm nổi bật là tính chất hóa lý gần như tương tự chất phân tích, giúp chúng là những chất đại diện tốt trong quá trình phân tích Ngoài ra, trong một số trường hợp, có thể chọn các chất nội chuẩn khác miễn là chúng có các đặc tính cơ bản giống với chất phân tích và có thể phân tích bằng phương pháp đang áp dụng, đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả phân tích.
2.4 Các l ư u ý khi xây d ự ng đườ ng chu ẩ n
Để đảm bảo độ chính xác của phân tích, cần xác định nồng độ chuẩn chính xác tuyệt đối, vì đường chuẩn là yếu tố quyết định tính đúng đắn của kết quả Việc kiểm soát độ chính xác của nồng độ chuẩn bắt đầu bằng việc sử dụng chất chuẩn mua từ nhà sản xuất với hàm lượng và độ tinh khiết đã được chứng nhận, phù hợp với tiêu chuẩn ISO 17025 Trong một số trường hợp, có thể tiến hành các thí nghiệm để đánh giá chất lượng của chất chuẩn trước khi sử dụng, nhằm đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phân tích.
Trong quá trình thẩm định phương pháp, việc đo nhiều lần mỗi nồng độ (thường là ba lần) là cần thiết để đảm bảo độ lặp lại của các kết quả, giúp xác nhận tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích Tín hiệu của các lần đo phải thể hiện sự nhất quán và ổn định, đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại nhằm đảm bảo kết quả phân tích chính xác và có thể lặp lại được trong các điều kiện thử nghiệm khác nhau.
Trong quá trình phân tích, việc loại trừ sai số thô (ngẫu nhiên) là cần thiết trong một số trường hợp để đảm bảo độ chính xác của kết quả Các điểm có sai số thô có thể ảnh hưởng đến đường chuẩn không đáp ứng yêu cầu, do đó cân nhắc loại trừ chúng giúp nâng cao độ tin cậy của phân tích và giảm thiểu sai số trong dữ liệu.
2.5 Gi ớ i h ạ n ch ấ p nh ậ n c ủ a đườ ng chu ẩ n
Hệ số hồi quy tuyến tính (R) là chỉ tiêu quan trọng đầu tiên để đánh giá mức độ phù hợp của đường chuẩn trong phân tích Để đảm bảo độ chính xác và tin cậy, hệ số tương quan hồi quy R phải đạt theo các tiêu chuẩn đề ra, giúp xác định mức độ liên hệ chặt chẽ giữa các biến trong mô hình Việc kiểm tra hệ số này là bước quan trọng để xác nhận rằng đường chuẩn phản ánh đúng mối liên hệ giữa các yếu tố nghiên cứu.
Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể được phát hiện mà không vượt quá độ không đảm bảo đo của phương pháp Đây là ngưỡng quan trọng trong phân tích hóa học, xác định khả năng phát hiện của phương pháp xét nghiệm Đặc biệt, giới hạn phát hiện cho phép xác định sự có mặt của chất phân tích dù chưa thể định lượng chính xác Tối thiểu, khi nồng độ mẫu vượt qua giới hạn phát hiện, phương pháp có thể đảm bảo sự nhạy cảm và độ chính xác trong phép đo.
3.2.1 LOD của phương pháp định tính
Cần xác định được nồng độ nào mà tại đó sẽ xác định chắc chắn sự có mặt của chất phân tích
Phân tích các mẫu trống chuẩn ở các nồng độ khác nhau nhằm đánh giá độ nhạy của phương pháp xét nghiệm Mỗi nồng độ được thực hiện lặp lại 10 lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả Tỷ lệ phần trăm các lần phát hiện (dương tính) hoặc không phát hiện (âm tính) được xác định để đánh giá giới hạn phát hiện của phương pháp Kết quả này giúp xác định độ nhạy của phương pháp xét nghiệm ở các nồng độ nhỏ, từ đó nâng cao độ chính xác trong quá trình phân tích.
Bảng 5: Ví dụ cách tính LOD của phương pháp định tính
Số lần thử Tỷ lệ dương tính/âm tính Tỷ lệ %
Trong ví dụ trên, với nồng độ dưới 100 ppm kết luận dương tính không còn chắc chắn 100%, giới hạn phát hiện trong trường hợp này là 100 ppm
3.2.2 LOD của phương pháp định lượng
Có nhiều cách xác định Mức độ Chi tiết (LOD) khác nhau tùy thuộc vào phương pháp áp dụng, dù là sử dụng công cụ hay phương pháp thủ công Các phương pháp tiếp cận này đều có thể chấp nhận được và phù hợp với từng yêu cầu cụ thể trong quá trình xây dựng mô hình Việc lựa chọn cách xác định LOD phù hợp giúp đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong quá trình phát triển dự án.
Dựa trên độ lệch chuẩn
Cách 1 Làm trên mẫu trắng (mẫu trắng có thành phần như mẫu thử nhưng không có chất phân tích)
Phân tích mẫu 10 lần song song, tính độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn này phải khác 0
Trong đó: x − 0 = trung bình của mẫu trắng
SD0 = độ lệch chuẩn của mẫu trắng
Cách 2 Làm trên mẫu thử: Làm 10 lần song song Nên chọn mẫu thử có nồng độ thấp (ví dụ, trong khoảng 5 đến 7 lần LOD ước lượng)
Tính LOD: Tính giá trị trung bình x − , và độ lệch chuẩn SD
= ∑ − Đánh giá LOD đã tính được: tính R = x − / LOD
• Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy
Nếu giá trị R hoàn toàn nhỏ hơn 4, bạn cần sử dụng dung dịch thử đậm đặc hơn hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã sử dụng, sau đó tiến hành lại thí nghiệm và tính lại giá trị R để đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích.
• Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại
Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)
Cách này chỉ áp dụng cho các quy trình phân tích có sử dụng công cụ gặp nhiễu đường nền Phương pháp tính toán này thường được áp dụng phổ biến trong các kỹ thuật phân tích như sắc ký và điện di, giúp cải thiện độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
Ở nồng độ thấp, phân tích mẫu gồm mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn có thể vẫn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Quá trình phân tích cần lặp lại ít nhất 4 lần để đảm bảo độ chính xác Xác định tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) là bước quan trọng, trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, giúp đánh giá độ nhạy và độ chính xác của phương pháp phân tích.
Nhiễu đường nền nên được tính toán về hai phía của đường nền để đảm bảo độ chính xác trong đo lường Phương pháp tốt nhất là xác định nhiễu lân cận ở mỗi bên của đỉnh, với bề rộng tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của đỉnh tại nửa chiều cao Điều này giúp phân biệt rõ ràng giữa tín hiệu chính và nhiễu, nâng cao độ chính xác của các phép đo khi phân tích dữ liệu quang phổ hoặc tín hiệu.
LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3
Hình 7: Xác định LOD bằng cách tính S/N
Dựa trên đường chuẩn (tham khảo)
Chỉ áp dụng được cho các phương pháp có xây dựng đường chuẩn
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo a
Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu a: Độ dốc của đường chuẩn
Giá trị a có thể dễ dàng tính được từ đường chuẩn, giá trị SD có thể được tính theo nhiều cách khác nhau, bao gồm:
- Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng: Phân tích mẫu trắng lặp lại
10 lần và tính SD tương ứng;
- Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD, lặp lại 10 lần (xem phần kiểm tra ở phía trên) và tính SD;
- Dựa trên hệ số chặn của đường chuẩn, làm nhiều lần để tính SD của giá trị b (intercept);
- Dựa trên độ lệch chuẩn của khoảng cách các giá trị đo thực với đường chuẩn.
Giới hạn định lượng
LOQ (Limit of Quantification) là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử có thể được xác định chính xác và có độ chụm mong muốn khi áp dụng phương pháp phân tích Đây là yếu tố quan trọng để đảm bảo độ nhạy và độ tin cậy của phương pháp khảo sát trong phân tích hóa học Việc xác định LOQ giúp đánh giá khả năng phát hiện và định lượng các hợp chất ở mức độ thấp nhất có thể của phương pháp phân tích sử dụng.
LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng
Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể mà lựa chọn cho phù hợp
Việc xác định LOQ cần tính đến các yếu tố ảnh hưởng trong mẫu phân tích, do đó cần thực hiện trên nền mẫu thật
LOQ trong nhiểu trường hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính Hình 8 mô tả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính
Hình 8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính
Việc bố trí thí nghiệm để xác định LOQ thường kết hợp với tính LOD
Có nhiều cách khác nhau để tính LOQ như sau:
Dựa trên độ lệch chuẩn:
Có hai trường hợp như trong phần tính LOD là thực hiện trên mẫu trắng và thực hiện trên mẫu thử Các công thức tính toán như sau:
Tính trên mẫu trắng: LOQ = x − 0 +10SD 0
Tính trên mẫu thử: LOQ = 10 SD
Để xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích metanol trong rượu, cần thực hiện phân tích mẫu trắng có hàm lượng metanol rất thấp, gần giới hạn dưới của đường chuẩn Quá trình này bao gồm phân tích 10 lần lặp lại mẫu để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả Sau đó, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn để xác định chính xác giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích metanol trong rượu, đảm bảo tuân thủ các quy chuẩn an toàn thực phẩm.
Trung bình (mg/l) SD (mg/l)
Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu:
Phương pháp này chỉ áp dụng cho các quy trình phân tích sử dụng công cụ có nhiễu đường nền Quá trình tính toán được thực hiện hoàn toàn giống như phương pháp tính LOD, đảm bảo độ chính xác trong kết quả phân tích.
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N = 10
Xác định LOD của phương pháp phân tích axit benzoic trong nước giải khát bằng HPLC dựa trên việc phân tích các mẫu trắng có thêm chuẩn axit benzoic với nồng độ thấp dưới giới hạn phát hiện của phương pháp Để tính LOD, người ta đo chiều cao của pic sắc ký (H = tín hiệu S) và chiều cao của nhiễu nền (h = 2N) ở hai phía của đỉnh chuẩn Các kết quả thu được giúp xác định ngưỡng phát hiện thấp nhất của phương pháp phân tích axit benzoic, đảm bảo độ nhạy và chính xác trong việc xác định hàm lượng chất này trong mẫu.
(mg/kg) Lần Chiều cao pic
Như vậy LOD = 0,02 mg/kg
Cách tính tương tự như trong phần LOD nhưng theo công thức sau: a
Lưu ý, ngoài việc tính toán như trên, cần quan tâm đến độ lặp lại tại giới hạn phát hiện (LOQ), tùy theo từng phương pháp, giá trị RSD% phải đạt mức yêu cầu cụ thể Việc kiểm tra độ chụm và độ chính xác liên quan đến yêu cầu RSD% cho từng nồng độ giúp đảm bảo tính khả thi và độ chính xác của phân tích Tham khảo phần hướng dẫn về yêu cầu RSD% cho từng nồng độ để đảm bảo kết quả phân tích đạt tiêu chuẩn.
Độ chính xác (độ đúng và độ chụm)
Hiện nay, có nhiều cách hiểu khác nhau về thuật ngữ độ chính xác, trong đó nhiều tài liệu trước đây và hiện nay phân biệt "độ đúng" và "độ chính xác" như hai khái niệm riêng biệt Theo tiêu chuẩn quốc tế ISO 5725-1 đến 6:1994 và tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6910-1 đến 6:2005, "độ đúng" đề cập đến mức độ gần giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm với giá trị thực hoặc chấp nhận được Trong khi đó, "độ chụm" thể hiện mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh trị giá trung bình Hình 9 mô tả mối quan hệ giữa độ chụm, độ đúng và độ chính xác, trong đó độ chính xác được định nghĩa là tổng của độ chụm và độ đúng, phản ánh toàn diện mức độ đúng và ổn định của kết quả phân tích.
Hình 9: Minh họa khái niệm độ chính xác (độ chụm và độ đúng)
Trong nhiều trường hợp, các phép thử nghiệm trên các đối tượng và điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau do các sai số ngẫu nhiên của quy trình gây ra, mà chúng ta không thể kiểm soát hoàn toàn tất cả các yếu tố ảnh hưởng Để kiểm soát các sai số này, khái niệm độ chụm được sử dụng, phản ánh mức độ phân tán của dữ liệu dựa trên sai số ngẫu nhiên, không liên quan đến giá trị thực Độ chụm là khái niệm định tính và được đo lường bằng mức độ lệch chuẩn hoặc hệ số biến thiên, trong đó độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hoặc hệ số biến thiên càng lớn Phân loại độ chụm gồm ba trường hợp chính, giúp đánh giá mức độ chính xác và ổn định của các phép thử nghiệm.
- Độ chụm trung gian (intermediate precision)
Sự khác nhau giữa các khái niệm độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ tái lập được tóm tắt trong bảng 6
Bảng 6: Sự khác nhau giữa độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ tái lập Điều kiện Độ lặp lại Độ chụm trung gian Độ tái lập
Nền mẫu Khác Khác Khác
Nồng độ Khác Khác Khác
Thiết bị Giống Khác Khác
Người phân tích Giống Khác Khác
Dụng cụ, hóa chất Giống Khác Khác Điều kiện môi trường Giống Khác Khác
Phòng thử nghiệm Giống Giống Khác
Cách 1 Bố trí thí nghiệm
Tiến hành thực hiện ít nhất 6 đến 10 lần thí nghiệm trên cùng một mẫu để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả Mẫu phân tích có thể là mẫu chuẩn hoặc mẫu trắng có bổ sung chuẩn, nhằm kiểm tra độ chính xác của phương pháp Tốt nhất, thực hiện trên mẫu thử hoặc mẫu thử thêm chuẩn để đảm bảo tính xác thực và độ chính xác của dữ liệu phân tích.
Trong từng phòng thử nghiệm, có thể bố trí các thí nghiệm nhằm xác định độ lặp lại hoặc độ chụm trung gian, đảm bảo tính chính xác và đồng nhất của kết quả Ngoài ra, việc tham gia so sánh kết quả với các phòng thử nghiệm khác, như trong các chương trình thử nghiệm thành thạo hoặc các cuộc so sánh liên phòng, giúp nâng cao độ tin cậy và chất lượng của các kết quả thử nghiệm.
Nên tiến hành các phép thử ở các nồng độ khác nhau như trung bình, thấp và cao trong khoảng thời gian làm việc để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả Mỗi nồng độ cần lặp lại ít nhất 6 đến 10 lần để có dữ liệu đủ độ chính xác Sau đó, tính độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD hoặc hệ số biến thiên CV) dựa trên các công thức phù hợp nhằm đánh giá độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp phân tích.
SD: Độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghiệm xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i” x : Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm
RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối CV%: Hệ số biến thiên
Cách 2 Tính toán trên các kết quả phân tích mẫu thực đã làm
Trong một số trường hợp, việc ước lượng độ lặp lại có thể được thực hiện thông qua tính toán dựa trên kết quả phân tích các mẫu thực, giúp đảm bảo độ chính xác và đáng tin cậy của dữ liệu Vì vậy, lưu giữ và quản lý các kết quả phân tích là vô cùng quan trọng để phục vụ cho các bước nghiên cứu và ra quyết định tiếp theo Việc này không chỉ nâng cao hiệu quả công việc mà còn hỗ trợ tối ưu hóa các phương pháp phân tích trong lĩnh vực của bạn.
Dựa trên kết quả phân tích mẫu thực trong nhiều tuần, cần ít nhất 10 mẫu khác nhau về nền mẫu và nồng độ để đảm bảo tính khách quan và chính xác của kết quả Đồng thời, các mẫu này phải cho kết quả lặp lại ít nhất hai lần để xác nhận tính đáng tin cậy của phân tích Việc thực hiện nhiều mẫu và lặp lại kết quả giúp nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của quá trình đánh giá, phù hợp với các quy trình kiểm tra chất lượng theo tiêu chuẩn.
Trong các mẫu có nồng độ, hàm lượng gần như nhau, cần tính độ lệch giữa hai kết quả lặp lại của mỗi mẫu để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phép đo Sau đó, xác định độ lệch trung bình (dtb) để phản ánh mức độ biến động giữa các kết quả Cuối cùng, tính độ lệch chuẩn (s) giúp đánh giá độ phân tán của dữ liệu, hỗ trợ trong việc phân tích và kiểm soát chất lượng mẫu.
Khi các mẫu có nồng độ xi khác nhau đáng kể, ta thay thế độ lệch di bằng độ lệch tương đối Di, sau đó tính độ lệch tương đối trung bình Dtb để đánh giá sự biến động giữa các mẫu Tiếp theo, tính độ lệch chuẩn tương đối để có cái nhìn chính xác hơn về độ phân tán của dữ liệu, giúp nâng cao độ chính xác trong phân tích và đánh giá kết quả nghiên cứu.
5.1.3 Tiêu chí đánh giá Đối chiếu giá trị tính được với giá trị mong muốn hay giá trị yêu cầu hoặc so với RSD% lặp lại cho trong bảng 7 (RSD% tính được không được lớn hơn giá trị trong bảng ở hàm lượng chất tương ứng) Độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD càng lớn
Bảng 7: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)
Ví dụ: Kết quả các lần phân tích lặp lại chỉ tiêu lipit tổng số trong sữa bột:
1,118 1,118 % Ở khoảng nồng độ này, theo AOAC RSD% tối đa chấp nhận được là 1,8%, như vậy phương pháp áp dụng có độ chụm đạt yêu cầu
Trong nội bộ mỗi phòng thử nghiệm, việc tính toán độ lặp lại là cần thiết để đảm bảo độ chính xác của kết quả Bên cạnh đó, cần tổ chức các thí nghiệm để xác định độ chụm trung gian, còn gọi là độ tái lập nội bộ phòng thử nghiệm, nhằm kiểm soát độ tin cậy của quá trình thử nghiệm Các phương pháp thực hiện đo độ chụm trung gian có thể được lựa chọn dựa trên các cách tiếp cận khác nhau nhằm đảm bảo tính nhất quán và độ chính xác của dữ liệu thử nghiệm Việc bố trí thử nghiệm phù hợp giúp nâng cao chất lượng kết quả và đáp ứng các tiêu chuẩn kỹ thuật của phòng thử nghiệm.
- Sử dụng các nhân viên thử nghiệm khác nhau;
Việc sử dụng các thiết bị với các đặc tính khác nhau, chẳng hạn như các hệ thống HPLC của các hãng khác nhau hoặc cùng một hãng nhưng thuộc các model khác nhau, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân tích Điều này giúp đảm bảo tính linh hoạt, phù hợp với nhiều yêu cầu nghiên cứu và kiểm tra chất lượng sản phẩm Sự đa dạng về thiết bị cũng hỗ trợ tối ưu hóa kết quả phân tích, nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của dữ liệu thu thập.
- Sử dụng các dung môi hóa chất, thuốc thử có chất lượng khác nhau;
- Khác nhau về nhiệt độ và độ ẩm của phòng thử nghiệm;
- Khác nhau các điều kiện cụ thể của thiết bị, ví dụ thành phần dung môi pha động, tốc độ dòng, pH của pha động
Tham gia thử nghiệm thành thạo và so sánh liên phòng là yếu tố then chốt trong quá trình đánh giá phương pháp thử nghiệm Các phòng thử nghiệm cần có kết quả thử nghiệm liên phòng đã đạt tiêu chuẩn trước khi được công nhận theo ISO 17025 và duy trì chứng chỉ này Việc này đảm bảo độ chính xác, đáng tin cậy của kết quả kiểm tra, góp phần nâng cao uy tín và chất lượng của phòng thử nghiệm trên thị trường.
5.2.1 Định nghĩa Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (μ) Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung là giá trị đúng)
Giống như độ chụm, độ đúng là một khái niệm định tính Độ đúng thường được diễn tả bằng độ chệch (bias)
Trong đó: Δ : Độ chệch (bias), %
Xtb: Giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm μ: Giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng
5.2.2 Cách xác định độ đúng
Để xác định độ đúng của phương pháp phân tích, cần tìm ra giá trị đúng của mẫu Có nhiều cách để xác định độ đúng, chẳng hạn như so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả của phương pháp đối chiếu hoặc sử dụng mẫu đã biết nồng độ, như mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn đã được chứng nhận Ngoài ra, phương pháp xác định độ thu hồi (độ tìm lại) cũng được áp dụng để đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích.
Cách 1: So sánh với phương pháp chuẩn/đối chiếu
Độ ổn định (hay độ vững/độ chắc chắn) của phương pháp
6.1 Đị nh ngh ĩ a Độ ổn định của phương pháp là khả năng cung cấp các kết quả có độ chính xác (độ đúng và độ chụm) chấp nhận được dưới những điều kiện có sự thay đổi về một số điều kiện thực hiện phương pháp
Người ta phân biệt hai khái niệm độ vững (robustness) và độ chắc chắn (rugedness) như sau:
Độ vững phản ánh khả năng lặp lại của kết quả phân tích khi thay đổi nhỏ một số thông số trong phương pháp, như pH pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu, thành phần pha động và bước sóng phát hiện trong phương pháp sắc ký lỏng, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của phân tích.
Độ chắc chắn thể hiện khả năng lặp lại kết quả phân tích khi các yếu tố điều kiện thử nghiệm như người thực hiện, thiết bị phân tích, cột sắc ký từ các nhà cung cấp khác nhau, lô hóa chất thử, hay thời điểm tiến hành thí nghiệm thay đổi Thông thường, độ chắc chắn liên quan đến khả năng tính độ chụm trung bình hoặc độ tái lập nội bộ của phòng thử nghiệm, đảm bảo tính nhất quán và đáng tin cậy của kết quả phân tích.
Trong tài liệu này chúng tôi nói đến độ ổn định bao gồm cả hai yếu tố độ vững và độ chắc chắn của phương pháp
Trong nghiên cứu thực nghiệm, việc tổ chức các thí nghiệm để so sánh kết quả trong các điều kiện khác nhau là cần thiết nhằm đảm bảo tính khách quan và chính xác của dữ liệu Để đánh giá sự khác biệt giữa các nhóm, ta thường sử dụng các phương pháp thống kê như kiểm định phương sai (chuẩn F) và kiểm định trung bình (chuẩn t) Ví dụ, so sánh giữa người A và người B hoặc giữa máy A và máy B giúp xác định xem các yếu tố này có ảnh hưởng đáng kể đến kết quả hay không Điều này đảm bảo rằng các kết quả thu được phản ánh đúng thực tế và có thể áp dụng trong các tình huống thực tế một cách chính xác.
B, giữa điều kiện A và điều kiện B Cách tiến hành so sánh giống như trong phần xác định độ đúng khi so sánh hai phương pháp đã nêu ở trên
Trong trường hợp có mẫu CRM, có thể bố trí các thí nghiệm với sự thay đổi điều kiện phân tích hoặc các thông số của phương pháp để đánh giá độ ổn định của phương pháp phân tích Việc này giúp tính kết quả mẫu CRM chính xác và so sánh với kết quả chuẩn, từ đó đảm bảo độ tin cậy và ổn định của phương pháp phân tích trong kiểm nghiệm.
THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH V ẬT
Các yêu cầu chung
Trước khi thẩm định bất kỳ phương pháp nào, phòng thử nghiệm cần có đầy đủ trang thiết bị, dụng cụ và máy móc phù hợp để thực hiện phương pháp đó, đảm bảo các yêu cầu nghiêm ngặt về chất lượng các chỉ số kỹ thuật Các thiết bị và dụng cụ phải được hiệu chuẩn định kỳ bởi đơn vị hiệu chuẩn có đủ năng lực và phù hợp với yêu cầu kỹ thuật Ngoài ra, việc kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cấy và thuốc thử cần tuân thủ theo tiêu chuẩn ISO 11133 phần I và II để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả kiểm nghiệm.
Thẩm định một phương pháp phải do các kiểm nghiệm viên có kiến thức chuyên môn vững vàng, kỹ thuật thao tác chính xác và kinh nghiệm dày dạn trong lĩnh vực phân tích vi sinh vật thực hiện Điều này đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả đánh giá phương pháp, góp phần nâng cao chất lượng kiểm nghiệm vi sinh vật.
Chuẩn bị mẫu cho quá trình thẩm định vi sinh đóng vai trò then chốt do đặc điểm của mẫu vi sinh thường có độ ổn định thấp, đòi hỏi sự lựa chọn kỹ lưỡng để tăng tỷ lệ nhiễm tự nhiên Việc chọn loại thực phẩm phù hợp để thẩm định cần tính toán cẩn thận nhằm đảm bảo độ chính xác của kết quả Trong quá trình thẩm định, cần lựa chọn năm loại thực phẩm khác nhau thuộc năm nhóm khác nhau để đại diện cho đa dạng mẫu Chi tiết về quy trình lựa chọn loại thực phẩm phục vụ thẩm định được mô tả rõ trong phụ lục 3 của tài liệu.
Các mẫu tự nhiên được ưu tiên hàng đầu vì chúng chứa hoặc nhiễm vi sinh vật đích, đảm bảo độ chính xác trong phân tích vi sinh Quá trình bảo quản mẫu cần hạn chế tối đa sự biến đổi của vi sinh vật và trạng thái của chúng để duy trì tính toàn vẹn của mẫu Việc kiểm tra mức độ ổn định hàm lượng vi sinh nhiễm ngay trước thời điểm sử dụng mẫu là bước quan trọng trong quá trình thẩm định, đảm bảo kết quả phân tích chính xác và đáng tin cậy.
Mẫu tự nhiễm bao gồm các dạng mẫu lỏng hoặc sệt có thể được gây nhiễm bằng cách trộn với các sản phẩm tương tự có chứa vi sinh vật tự nhiên Để đảm bảo độ chính xác trong quá trình kiểm tra, cần đảm bảo tính đồng nhất của mẫu sau khi trộn Việc chuẩn bị mẫu tự nhiễm đúng quy trình giúp đánh giá hiệu quả của phương pháp thử và đảm bảo kết quả phân tích chính xác, tin cậy.
Sử dụng các vi sinh vật đích để gây nhiễm vào mẫu trắng là phương pháp hiệu quả để kiểm tra mức độ nhiễm khuẩn Hàm lượng vi sinh vật gây nhiễm cần được kiểm soát để phù hợp với mức thường thấy trong các sản phẩm tự nhiên, đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích.
Mẫu chuẩn, đặc biệt là các mẫu chuẩn đã được chứng nhận, chứa một lượng vi sinh vật đã biết và có độ ổn định cao, đảm bảo độ chính xác trong quá trình phân tích Chúng được sử dụng làm mẫu tham chiếu để thẩm định các phương pháp định lượng, giúp tăng độ chính xác và độ tin cậy của kết quả Trong các phương pháp định tính, việc sử dụng mẫu chuẩn thường không cần thiết, nhưng trong các phương pháp định lượng, mẫu chuẩn đóng vai trò quan trọng trong đảm bảo chất lượng phân tích.
1.2 L ự a ch ọ n thông s ố th ẩ m đị nh
Các phương pháp vi sinh, giống như các phương pháp hóa học, được phân loại thành hai nhóm chính là phương pháp tiêu chuẩn (reference method) và phương pháp không tiêu chuẩn hoặc phương pháp thay thế (alternative method) Hiện nay, phần lớn các phòng thử nghiệm tại Việt Nam sử dụng phương pháp tiêu chuẩn để xác định các chỉ tiêu vi sinh, đảm bảo độ chính xác và đáng tin cậy của kết quả Trong phạm vi tài liệu này, chúng tôi tập trung giới thiệu về quá trình thẩm định đối với phương pháp tiêu chuẩn, bao gồm các thông số cần thiết để đánh giá tính phù hợp và chính xác của phương pháp đó.
Bảng 10: Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp phân tích vi sinh vật
Phương pháp định tính Phương pháp định lượng
Giới hạn phát hiện Độ đặc hiệu, độ nhạy Độ lệch dương, độ lệch âm Độ chính xác (độ đúng)
Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Độ lặp lại Độ tái lập
Thông số thẩm định vi sinh có những điểm khác so với thẩm định hóa học, và những khái niệm này sẽ được làm rõ trong các phần tiếp theo Đối với các phương pháp không tiêu chuẩn, quá trình thẩm định thường phức tạp hơn, cần trải qua hai giai đoạn chính: giai đoạn I là so sánh với phương pháp chuẩn, còn giai đoạn II là so sánh liên phòng thử nghiệm Để hiểu rõ hơn về quy trình thẩm định phương pháp tiêu chuẩn, bạn có thể tham khảo tiêu chuẩn ISO 16140:2003.
2 Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn (method verification)
2.1 Ph ươ ng pháp đị nh tính
2.1.1 Giới hạn phát hiện a Định nghĩa
Giới hạn phát hiện của một phương pháp xác định nồng độ vi sinh vật thấp nhất trong mẫu có thể được nhận diện thành công bằng cách sử dụng phương pháp đó Đối với phương pháp định tính, giới hạn phát hiện được xác định dựa trên mức độ có ít nhất 90% mẫu cho kết quả dương tính, đảm bảo độ nhạy của phương pháp trong việc phát hiện vi sinh vật có trong mẫu Cách xác định giới hạn phát hiện giúp đánh giá chính xác khả năng của phương pháp trong các ứng dụng kiểm nghiệm vi sinh.
Thực hiện theo các bước sau:
- Chọn loại đối tượng mẫu cần thực hiện thẩm định
Thử nghiệm mật độ vi khuẩn cho từng loại vi sinh vật mục tiêu trên mẫu thử, bao gồm cả mẫu chứng âm, được thực hiện theo các mức độ khác nhau Mức độ 1 (Lo) phản ánh kết quả âm tính, chỉ cần thực hiện một lần duy nhất Mức độ 2 xác định khả năng phát hiện vi sinh vật dựa trên giới hạn từ 1 đến 9 CFU/25g, với các mức độ nhiễm khác nhau như L1a, L1b, L1c, trong đó (1 ≤ L1a < ), giúp đánh giá chính xác mức độ ô nhiễm trên mẫu thử.
Mức độ 2 (L1b < L1c ≤ 9) CFU/25g được thực hiện 5 lần trên mỗi mẫu nhiễm để đảm bảo độ chính xác của kết quả Trong khi đó, mức độ 3 (L2) là mức vượt quá giới hạn phát hiện theo lý thuyết, nằm trong khoảng 10-50 CFU/25g, và chỉ cần được đánh giá một lần duy nhất Các kết quả thu được sẽ được tính toán dựa trên các quy định này để đảm bảo độ chính xác và phù hợp với tiêu chuẩn kiểm nghiệm.
LOD của mỗi loại thực phẩm được tính như sau:
LOD = nồng độ vi khuẩn nhiễm vào mẫu mà ở đó có ít nhất 90% mẫu phân tích có kết quả dương tính d Đánh giá kết quả
LOD < 10 là đạt yêu cầu
2.1.2 Xác định độ chính xác (accuracy:AC), độ đặc hiệu
(specificity:SP), độ nhạy (sensitivity:SE), độ lệch dương (positive deviation:PD) và độ lệch âm (negative deviation:ND) a Định nghĩa
- Độ chính xác (hay độ đúng) là mức độ giống nhau giữa kết quả phân tích được với giá trị tham chiếu
- Độ đặc hiệu là khả năng phân biệt vi sinh vật đích với các vi sinh vật khác
- Độ nhạy là tỷ lệ của các vi sinh vật đích có thể được phát hiện b Cách xác định
Đối với từng loại đối tượng, cần chuẩn bị các mẫu khác nhau và phân chia thành hai nhóm chính: nhóm mẫu âm tính và nhóm mẫu được làm nhiễm với nồng độ gấp khoảng 10 lần giới hạn phát hiện (LOD), mà không thông báo cho kiểm nghiệm viên Các kiểm nghiệm viên phân tích độc lập theo cùng một phương pháp để đảm bảo tính khách quan và chính xác của kết quả Quá trình tính kết quả cần tuân thủ đúng các bước chuẩn xác để đảm bảo độ tin cậy trong phân tích và đánh giá mẫu thử.
Tính kết quả theo các công thức sau:
Kết quả Mẫu chứng (+) Mẫu chứng (-)
Mẫu có kết quả dương tính (+) TP FP
Mẫu có kết quả âm tính (-) FN TN
Trong đó: TP (True Positive): Dương tính đúng (Mẫu chứng có kết quả dương tính, kết quả phân tích cho kết quả dương tính)
FP (False Positive): Dương tính giả (Mẫu chứng có kết quả âm tính, kết quả phân tích cho kết quả dương tính)
FN (False Negative): Âm tính giả (Mẫu chứng có kết quả dương tính, kết quả phân tích cho kết quả âm tính)
Trong bài viết này, chúng tôi giới thiệu về khái niệm TN (Âm tính đúng), đề cập đến các mẫu chứng có kết quả âm tính chính xác, và cung cấp tổng số các kết quả phân tích n = TP + FP + FN + TN Đồng thời, chúng tôi nhấn mạnh vai trò của độ chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lệch dương và độ lệch âm trong quá trình đánh giá hiệu quả của các phương pháp xét nghiệm, cùng với công thức tính toán chi tiết để đảm bảo kết quả chính xác 100%.
AC= TP+ × Độ đặc hiệu 100
Các thông số cần được đánh giá theo các chuẩn mực sau:
Ví dụ: Bố trí các thí nghiệm nhằm xác định độ chính xác, độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp vi sinh đã cho kết quả chính xác và tin cậy Những kết quả này giúp đánh giá khả năng phát hiện và phân biệt các vi sinh vật một cách hiệu quả, từ đó nâng cao chất lượng chẩn đoán và ứng dụng trong y học, thực phẩm và môi trường.
- Số mẫu dương tính phát hiện dương tính: 37 (TP)
- Số mẫu âm tính phát hiện dương tính: 3 (FP)
- Số mẫu dương tính phát hiện âm tính: 2 (FN)
- Số mẫu âm tính phát hiện âm tính: 38 (TN)
Ta có các kết quả:
- Độ chính xác: = TP + TN × = 37 + 38 × =
2.2 Ph ươ ng pháp đị nh l ượ ng
2.2.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng a Định nghĩa