KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ BÈO TẤM BẰNG ENZYME

Khi khảo sát các yếu tố như pH, nhiệt độ, tỷ lệ enzyme so vớinguyên liệu và thời gian thủy phân lên hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân.Kết quả cho thấy, mẫu được thủy phân bằng e

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ

ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ BÈO TẤM BẰNG ENZYME

GVHD: TRẦN CHÍ HẢI

SVTH:

NGÔ THỊ TRÚC LINH MSSV: 2005150231 LỚP: 06DHTP2 NGUYỄN CHÚC KHUYÊN MSSV: 2005150215 LỚP: 06DHTP2 PHẠM THỊ THANH MAI MSSV: 2005150408 LỚP: 06DHTP1

TP HỒ CHÍ MINH, 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ BÈO TẤM BẰNG ENZYME

GVHD: TRẦN CHÍ HẢI

SVTH:

NGÔ THỊ TRÚC LINH MSSV: 2005150231 LỚP: 06DHTP2 NGUYỄN CHÚC KHUYÊN MSSV: 2005150215 LỚP: 06DHTP2 PHẠM THỊ THANH MAI MSSV: 2005150408 LỚP: 06DHTP1

TP HỒ CHÍ MINH, 2019

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT

Khóa luận tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp

1 Những thông tin chung:

Họ và tên sinh viên được giao đề tài (Số lượng sinh viên: 03)

(1) NGÔ THỊ TRÚC LINH MSSV: 2005150231 Lớp: 06DHTP2

(2) NGUYỄN CHÚC KHUYÊN MSSV: 2005150215 Lớp: 06DHTP2

(3) PHẠM THỊ THANH MAI MSSV: 2005150408 Lớp: 06DHTP1

Tên đề tài: KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ BÈO TẤM BẰNG ENZYME

2 Nhận xét của giảng viên hướng dẫn:

- Về tinh thần, thái độ làm việc của sinh viên:

- Về nội dung và kết quả nghiên cứu:

- Ý kiến khác:

3 Ý kiến của giảng viên hướng dẫn về việc SV bảo vệ trước Hội đồng:

TP Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019

GVHD

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi cam đoan rằng báo cáo khóa luận tốt nghiệp này là do chính chúng tôi thựchiện dưới sự hướng dẫn của thầy Trần Chí Hải Các số liệu và kết quả phân tích trongbáo cáo là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào

TP.HCM, tháng 06 năm 2019SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Kí và ghi rõ họ tên)

i

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Nghiên cứu này tập trung khảo sát quá trình thủy phân bèo tấm bởi các chế phẩmprotease như Alcalase, Protamex và Favourzyme để thu nhận protein hydrolysate cóhoạt tính sinh học cao Khi khảo sát các yếu tố như pH, nhiệt độ, tỷ lệ enzyme so vớinguyên liệu và thời gian thủy phân lên hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân.Kết quả cho thấy, mẫu được thủy phân bằng enzyme Alcalase có hoạt tính sinh họccao nhất với điều kiện thủy phân tối ưu tại pH 8; nhiệt độ 40oC; nồng độ 0.91%; thờigian 1.78 giờ và hoạt tính kháng oxy hóa đạt 29.21 mg TE/g protein EnzymeProtamex ở điều kiện thủy phân tối ưu tại pH 6; nhiệt độ 58.35oC; nồng độ 1.03%; thờigian 3 giờ có hoạt tính kháng oxy hóa đạt 27.17 mg TE/g protein và enzymeFlavourzyme ở điều kiện thủy phân tối ưu tại pH 6.73; nhiệt độ 50oC, nồng độ 1.85%;thời gian 3 giờ có hoạt tính kháng oxy hóa đạt 27.50 mg TE/g protein

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, trước hết chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đếnquý thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại học Công nghiệp Thựcphẩm TP Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho chúng tôitrong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường

Trong quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã gặp không ít khó khăn Nhưng với sựđộng viên giúp đỡ của quý thầy cô, người thân và bạn bè, chúng tôi cũng đã hoànthành tốt đề tài nghiên cứu của mình và có được những kinh nghiệm, kiến thức hữu íchcho bản thân

Cảm ơn các thầy cô Trung tâm thí nghiệm thực hành đã tạo luôn điều kiện thuận lợi đểchúng tôi có thể hoàn thành các thí nghiệm của mình

Đặc biệt chúng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Trần Chí Hải, người đã trựctiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Dù đã cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những sai sót Rất mong sự thông cảm vàđóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện

Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô và các bạn sức khỏe, luôn thành công trong côngviệc và cuộc sống

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, tháng 06, năm 2019

SVTH

iii

MỤC LỤC

Đặt vấn đề 1

Mục tiêu của đề tài 1

Nội dung đề tài 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3 1.1 Tổng quan về bèo tấm 3

1.1.1 Mô tả thực vật 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố 4

1.1.4 Thành phần hoá học của bèo tấm 5

1.1.5 Các hướng nghiên cứu ứng dụng trên bèo tấm 7

1.2 Tổng quan về protein 9

1.2.1 Giới thiệu và phân loại 9

1.2.2 Vai trò sinh học của protein 9

1.2.3 Phân loại 11

1.3 Quá trình oxy hóa 11

1.4 Peptide có hoạt tính sinh học 12

1.4.1 Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa 12

1.4.2 Cơ chế hình thành hoạt tính sinh học của các peptide 15

1.5 Sử dụng enzyme để sản xuất các peptide có hoạt tính sinh học 16

1.6 Khả năng ứng dụng sinh học của các peptide có hoạt tính sinh học 17

1.7 Tình hình nghiên cứu thu nhận các chất có hoạt tính sinh học từ bèo ở Việt Nam 19

1.8 Thủy phân protein từ bèo tấm bằng phương pháp enzyme để thu các peptide có hoạt tính sinh học 19

1.9 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Thời gian và địa điểm làm đề tài 23

2.2 Nguyên liệu và thiết bị 23

2.2.1 Protein từ bèo tấm 23

2.2.2 Quy trình chuẩn bị nguyên liệu: 24

2.2.3 Thuyết minh quy trình chuẩn bị nguyên liệu 24

2.2.4 Enzyme 25

2.2.5 Các thiết bị sử dụng trong quá trình trích ly và thu nhận protein 26

iv

2.2.6 Hoá chất sử dụng 27

2.3 Phương pháp đánh giá sơ bộ hoạt tính sinh học của dịch protein thuỷ phân thu nhận từ bèo tấm bằng 3 loại enzyme 27

2.4 Khảo sát quá trình thủy phân protein của bèo tấm bằng enzyme Flavourzyme, Protamex và Alcalase 28

2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ các chế phẩm enzyme đến hoạt tính sinh học của dịch protein thuỷ phân thu nhận từ bèo tấm 28

2.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính sinh học của dịch protein thuỷ phân thu nhận từ bèo tấm 29

2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến hoạt tính sinh học của dịch protein thuỷ phân thu nhận từ bèo tấm 31

2.4.4 Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân bằng các chế phẩm enzyme Protease đến hoạt tính sinh học của dịch protein thuỷ phân thu nhận từ bèo tấm 33

2.4.5 Quy trình thủy phân protein từ bèo tấm 35

2.4.6 Thuyết minh quy trình: 35

2.4.7 Phương pháp phân tích 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein từ bèo tấm Lemnoideae 37

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein thu nhận từ bèo tấm Lemnoideae 37

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein thu nhận từ bèo tấm Lemnoideae 40

3.1.3 Ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình thủy phân protein từ bèo tấm Lemnoideae để thu các peptide sinh học 42

3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hoạt tính sinh học của dịch protein thuỷ phân thu nhận từ bèo tấm Lemnoideae 45

3.2 Chọn lựa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein từ bèo tấm bằng enzyme 47

3.2.1 Enzyme Alcalase: 47

3.2.2 Enzyme Flavourzyme 49

3.2.3 Enzyme Protamex: 51

3.3 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ bèo tấm Lemnoideae 53

3.3.1 Enzyme Alcalase 53

3.3.2 Enzyme Flavourzyme 56

3.3.3 Enzyme Protamex 59

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 4.1 Kết luận 63

4.2 Kiến nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC A: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1

v

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ 5 PHỤ LỤC C: HÌNH ẢNH 79

vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.2 Các loài đại diện của 5 chi bèo tấm với kích thước hệ gen tương ứng 4

Hình 1.4 Sự tương tác của các peptide có hoạt tính sinh học trên màng tế bào 16

Hình 1.5 Ảnh hưởng của các peptide có hoạt tính sinh học lên cơ thể 18

Hình 2.2 Quy trình thủy phân 35

Hình 3.1 Khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân từ protein của bèo tấm bằng

Hình 3.2 Mức độ thủy phân của dịch thủy phân từ protein của bèo tấm bằng Alcalase,

Hình 3.3 Khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân từ protein của bèo tấm bằng

Hình 3.4 Mức độ thủy phân của dịch thủy phân từ protein của bèo tấm bằng Alcalase,

Hình 3.5 Khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân từ protein của bèo tấm bằng

Hình 3.6 Mức độ thủy phân của dịch thủy phân từ protein của bèo tấm bằng Alcalase,

Hình 3.7 Khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân từ protein của bèo tấm bằng

Hình 3.8 Mức độ thủy phân của dịch thủy phân từ protein của bèo tấm bằng Alcalase,

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến khả năng kháng

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến khả năng

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và nhiệt độ đến khả năng kháng oxy hóa

vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.2 Kết quả khảo sát hàm lượng các vi lượng có trong một số loài bèo và được 5

Bảng 1.3 Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa từ một số nguồn khác nhau 13

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 27

Bảng 2.2 Các thông số tối ưu của các loại enzyme protease 28

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt tính sinh học của dịch thủy phânprotein thu nhận từ bèo tấm 38Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính sinh học của dịch thủy

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính sinh học của dịch thủy phân

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hoạt tính sinh học của dịch thủy

Bảng 3.6 Kết quả xử lý thống kê của bố trí thí nghiệm theo mô hình Plackett-Burman

49

Bảng 3.8 Kết quả xử lý thống kê của bố trí thí nghiệm theo mô hình Plackett-Burman

51

Bảng 3.10 Kết quả xử lý thống kê của bố trí thí nghiệm theo mô hình

Bảng 3.12 Kết quả hồi quy đa biến khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân 55

Bảng 3.14 Kết quả hồi quy đa biến khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân 58

viii

Bảng 3.15 Kết quả bố trí thí nghiệm tối ưu hóa (Protamex) 59Bảng 3.16 Kết quả hồi qui đa biến khả năng kháng oxy hóa của dịch thủy phân

ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

x

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Bèo tấm là nhóm thực vật một lá mầm thủy sinh có phổ phân bố rất rộng cùng với tốc

độ sinh trưởng nhanh Với hàm lượng protein khá cao thì bèo tấm đang là một trongnhững hướng nghiên cứu đầy triển vọng trong cuộc chiến lương thực sạch ngày nay

Các loài của bèo tấm, Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffiella và Wolffia đã được phân

tích về hàm lượng protein, chất béo và tinh bột, acid amine và acid béo của chúng Nếuđược sinh trưởng trong điều kiện tối ưu về dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy thìhàm lượng protein trong bèo tấm đạt đến 45% trọng lượng chất khô Hàm lượngprotein rất cao so với các loài thực vật khác và tương đương với hàm lượng protein cótrong đậu nành

Trong bữa ăn hằng ngày protein được coi là một nguồn cung cấp năng lượng và cácacid amine thiết cần cho sự tăng trưởng và duy trì các chức năng sinh lý Gần đây, cókhá nhiều nghiên cứu đã chứng minh các lợi ích từ các peptide có hoạt tính sinh học cónguồn gốc từ thực vật Peptide hoạt tính sinh học là các mảnh protein đặc biệt vàchúng không có hoạt tính khi còn nằm trong một đại phân tử protein Sau khi chúngđược giải phóng bởi các enzyme thủy phân thì chúng mới thể hiện các chức năng sinh

lý khác nhau

Hơn nữa, các nghiên cứu chỉ ra rằng khả năng kháng oxy hóa tăng lên khi sử dụng cácchế phẩm protease để thủy phân protein do sự giảm kích thước của các peptide thuđược Sự thay đổi về kích cỡ, mức độ và thành phần của các acid amine và các peptide

có mối quan hệ mật thiết với khả năng chống oxy hoá của dịch protein thủy phân Từ

những vấn đề nêu trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Khảo sát các yếu tố công

nghệ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein từ bèo tấm bằng enzyme”.

Mục tiêu của đề tài

 Đưa ra quy luật tác động của một số thông số công nghệ trong quá trình thủy phân protein với sự hỗ trợ của enzyme Alcalase, enzyme Flavourzyme, enzyme

Protamex

 Xác định được điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân thu nhận peptide sinh học từprotein của bèo tấm

Nội dung đề tài

Phần 1: Mở đầu: trang 1 đến trang 2

Phần 2: Tổng quan: từ trang 3 đến trang 22

xi

Phần 3: Vật liệu và phương pháp: từ trang 23 đến trang 36.Phần 4: Kết quả và bàn luận: từ trang 37 đến trang 62.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị: từ trang 63

Phần 6: Tài liệu tham khảo: từ trang 64

Phần 7: Phụ lục: từ trang 1 đến trang 81

Địa bàn khảo sát: xã Nhật Tảo, huyện Tân Trụ, tỉnh Long An.

xii

 Loài: Lemna minor

 Tên khoa học Lemna minor

Các loài thực vật này rất đơn giản,

chúng thiếu thân hoặc lá, nhưng bao

gồm cấu trúc nhỏ giống như lưỡi lam

trôi nổi trên hoặc chỉ ngay dưới bề mặt

nước, có hoặc không có các rễ con đơn giản Sự sinh sản của chúng diễn ra chủ yếu là

vô tính, nhờ nảy chồi, nhưng thỉnh thoảng thì hoa, bao gồm 2 nhị hoa và một nhụy hoa(đôi khi gọi nó là cụm hoa gồm 3 hoa đơn tính) cũng được sinh ra Quả là loại túi nhỏ,một cái túi chứa không khí và hạt, nhằm mục đích có thể nổi được Hoa của chi

Wolffia là nhỏ nhất trong thế giới các loài hoa, nó chỉ dài 0.3 mm.

1.1.2 Phân loại

Phân họ Bèo tấm được phần lớn các hệ thống phân loại thực vật công nhận, nhưng lạikhông được hệ thống APG II công nhận: trong hệ thống này người ta đưa chúng vào

họ Araceae (các loài ráy, khoai nước, ) Các chi trong phân họ bèo tấm bao gồm:

Spirodela: Gồm các loài S intermedia, S oligorrhiza, S polyrrhiza, S punctate, S.

sichuanensi… Các loài này có tản xoan hay tròn, rộng 6 – 8 mm dài hơn ngang 1 – 1.5

lần, gân 7 – 16, khó nhận, mặt dưới đỏ, mỗi tản mang 7 – 21 rễ Mo có hai môi; buồngmang hai nhị; noãn 1 – 2, đứng trong lá noãn, mọc trà trộn với các loại bèo khác trên

ao hồ, ruộng khắp nơi

Landoltia: Loài đặc trưng là bèo đốm (L.punctata), có hình thái trung gian giữa Lemna

và các loài Spirodela khác

Lemna: Gồm các loài L.minor, L.trisulca, L.disperma, L.tenera, L perpusllta,

L.gibba… Các loài này này gồm 1 – 4 lá hình bầu dục trên một thân, màu xanh lục

nhạt, nổi trên mặt nước Chúng sinh sản vô tính là chủ yếu

xiii

Hình 1.1 Bèo tấm

Wolffiella: Gồm các loài W.caudata, W.denticulate, W.gladiate, W.hyaline,

W.lingulata, W.neotropica, W.oblonga, W.repanda, W.rotunda, W.welwitschii… Các

loài này không có rễ, hình thái lật ngược cho phép duy trì định hướng trong nước.Chúng sinh sản chủ yếu bằng vô tính, một số loài có khả năng sinh sản hữu tính

Wolffia: gồm các loài W.angusta, W.arrhiza, W.australiana, W.borealis,

W.brasiliensis, W.Columbiana, W.cylindracea, W.elongate, W.globosa, W.microscopica, W.neglecta…là loài thực vật có hoa nhỏ nhất, không có rễ, trôi nổi tự

do

Tại Việt Nam, người ta đã phát hiện 3 chi bèo (Spirodela, Lemna, Wolffia) với hơn 7

loài khác nhau Các loài này phân bố khá phổ biến trên các vùng mặt nước, ao hồ đồngruộng chủ yếu ở các đồng bằng Bắc Bộ và Nam Bộ

Hình 1.2 Các loài đại diện của 5 chi bèo tấm với kích thước hệ gen tương ứng.

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố

Bèo tấm có nguồn gốc ở hầu hết khắp châu Phi, châu Á, châu Âu và Bắc Mỹ Nhữngnơi có ao nước ngọt và các dòng chảy chậm, ngoại trừ vùng khí hậu Bắc Cực và cậncực

Bèo tấm là nhóm thực vật một lá mầm thủy sinh có phổ phân bố rất rộng cùng với tốc

độ sinh trưởng nhanh Hiện nay, phân họ Bèo tấm (Lemnoideae) có 37 loài thuộc 5 chi: Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffiella và Wolffia Dễ dàng thấy rằng, từ cách

đây 30 năm, các nhà khoa học đã phát hiện ra sự có mặt của bèo tấm ở tất cả các châulục, trừ các địa cực Bèo tấm thường xuất hiện ở các khu vực nước đọng hoặc có dòngchảy chậm Sự tăng trưởng nhanh thường được ghi nhận ở các ao hồ nhỏ, đầm lầy vìđây là những khu vực có nguồn dinh dưỡng dồi dào Đặc biệt, ở khu vực có cá sấusinh sống thì tốc độ tăng trưởng của bèo tấm là cực đại Một vài loài cũng tồn tại trong

xiv

môi trường nước nhiễm mặn (tối đa 2.5% NaCl đối với Lemna minor), tuy nhiên

chúng không tích lũy ion Na+ trong quá trình sinh trưởng Ở điều kiện sinh trưởng tối

ưu (về nhiệt độ nước, pH, chiếu sáng, nguồn dinh dưỡng), bèo tấm có thể tăng gấp đôisinh khối trong vòng 16 – 24 giờ Theo tính toán lý thuyết, với tốc độ sinh trưởng nhưvậy thì chỉ sau 50 ngày, bèo tấm có thể mọc kín 1 ha nuôi trồng với lượng ban đầu chỉ

10 cm2 và sau 60 ngày thì sẽ phủ kín toàn bộ diện tích 32 ha

Việc nuôi trồng bèo tấm ở Việt Nam thường được thực hiện ở quy mô gia đình Phâncủa vật nuôi được thu nhận trong một cái bể nhỏ, sau đó lượng nước chảy ra từ bể nàyđược đưa vào trong 1 bể lớn hơn, tại bể này người dân nuôi 1 lớp mỏng bèo tấm ở trênmặt Bèo được thu hoạch hàng ngày và trộn với phế phẩm, phụ phẩm nông nghiệp đểlàm thức ăn cho vịt

1.1.4 Thành phần hoá học của bèo tấm

Bèo tấm có chứa các chất dinh dưỡng với sự đa dạng về cả thành phần và hàm lượng.Sinh khối bèo tấm có chứa các vitamin A, B1, B2,…và các amino acid không thay thếđược (trừ methionine) Hầu hết các loài bèo tấm chứa hàm lượng protein đạt từ 20 –45%, phụ thuộc và điều kiện sinh trưởng và phát triển Ở điều kiện nuôi trồng tối ưu,hàm lượng protein trong bèo tấm có thể đạt giá trị cực đại tương đương lượng protein

có trong đậu nành

Bảng 1.1 Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong bèo tấm

Thành phần Hàm lượng (% trọng lượng chất khô)

Trong những năm qua, công ty Parabel đã điều tra thành phần dinh dưỡng của bèo vàcác sản phẩm có nguồn gốc từ cây thủy sinh Một báo cáo gần đây phân tích thành

phần hóa học của sáu loài đại diện cho tất cả năm chi Spirodela polyrhiza, Landoltia

punctata, Lemna gibba, Lemna minor, Wolffiella hyalina, Wolffia microscopica Kết

quả của nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng lượng chất khô 6 loài dao động từ 4 đến

xv

8%; protein dao động từ 20 đến 35% (dw), thấp nhất là L punctata và cao nhất là W.

hyalina; hàm lượng chất béo từ 4 đến 7% (dw), acid béo bão hòa khoảng 25 đến 46 %

tổng hàm lượng chất béo và tinh bột từ 4 đến 10% (dw) Ngoài ra trong bèo còn chứa

vi chất dinh dưỡng bao gồm khoáng chất và chất dinh dưỡng thực vật Nồng độ và tính

chất của các nguyên tố vi lượng có trong Lemnaceae cũng phụ thuộc phần lớn vào

nguồn nước nơi bèo tấm phát triển

Hình 1.3 Thành phần hóa học của 6 loài

(A) Trọng lượng khô, (B) Hàm lượng protein tổng số, (C) Hàm lượng axit béo, (D)Hàm lượng tinh bột Dữ liệu (B – D) có liên quan đến trọng lượng khô Nồng độ và

tính chất của các nguyên tố vi lượng có trong Lemnaceae cũng phụ thuộc phần lớn vào

nguồn nước nơi bèo tấm phát triển

xvi

Bảng 1.2 Kết quả khảo sát hàm lượng các vi lượng có trong một số loài bèo và được 5

NR

1.1.5 Các hướng nghiên cứu ứng dụng trên bèo tấm

Sử dụng bèo tấm để sản xuất bioethanol và biobutanol

Có nhiều nghiên cứu tập trung vào việc gia tăng hàm lượng tinh bột trong bèo tấmdùng cho sản xuất nhiên liệu sinh học Có hai quá trình tác động tới sự tích lũy tinh bộttrong sinh khối bèo tấm, đó là quá trình quang hợp để hình thành tinh bột và sự tiêuhao tinh bột trong các quá trình trao đổi chất Với các kỹ thuật nuôi trồng bèo tấm hiệnnay, hàm lượng tinh bột được tổng hợp nhờ quá trình quang hợp là rất lớn, vì thế cácnghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc hạn chế các quá trình phân giải tinh bột Cácnghiên cứu chính bao gồm:

(1) Sự thiếu hụt P, K và N là nguyên nhân làm giảm quá trình dị hóa, từ đó gia tănghàm lượng tinh bột tích lũy trong cây Năm 2009, Cheng và Stomp đã nghiên cứu và

xvii

thấy rằng khi cấy chuyển bèo tấm từ môi trường giàu dinh dưỡng sang môi trường chỉ

có nước máy thì hàm lượng tinh bột tích lũy trong S polyrhiza tăng lên từ 20- 45,8%

sau 5 ngày

(2) Năm 2011, Cui và cộng sự đã công bố điều kiện nhiệt độ thấp và thời gian chiếu

sáng kéo dài sẽ gia tăng sự tích lũy tinh bột ở S polyrhiza Cụ thể, khi nhiệt độ ban

ngày không thay đổi thì nhiệt độ thấp vào ban đêm sẽ kích thích sự tích lũy tinh bột.Ngược lại, hàm lượng tinh bột không khác biệt trong điều kiện thay đổi nhiệt độ banngày và giữ nguyên nhiệt độ ban đêm

(3) Năm 1976, McLaren và Smith đã nghiên cứu và thấy rằng: sau 6 ngày nuôi cấy L.

minor trong môi trường có mặt 10 - 6M ABA thì trọng lượng tươi giảm 60% nhưng

sinh khối khô tăng 220% và tinh bột trong sinh khối khô tăng gần 500% Đặc biệt, Xu

và cộng sự đã chỉ ra rằng bèo tấm là một cơ chất có tiềm năng trong quá trình lên men

vì dưới tác động của nấm men chúng không những được chuyển hóa thành ethanol màcòn tạo ra các alcohol cao năng lượng khác để sản xuất nhiên liệu sinh học

Bên cạnh đó, việc thử nghiệm sản xuất sinh khối trên quy mô lớn cũng đã được thựchiện Năm 2012, Xu và cộng sự đã xây dựng hệ thống nuôi và thu sinh khối bèo tấmđầu tiên để sản xuất ethanol tại North Carolina, Mỹ Năm 2012, Farrell đã nuôi bèotấm trong một đầm (phá) rộng 23 ha và thấy rằng trong điều kiện thiếu dinh dưỡng thìhàm lượng tinh bột gia tăng từ 10% lên đến trung bình 19% Các yếu tố chính cầnquan tâm khi nuôi trồng là: mật độ bèo, thời gian thu hoạch và bổ sung dinh dưỡng

Sử dụng bèo tấm để sản xuất khí sinh học (biogas)

Sử dụng quá trình lên men kỵ khí các chất thải nông nghiệp và chăn nuôi để sản xuấtkhí sinh học đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay Triscari và cộng sự cho thấy chỉcần bổ sung 0,5 – 2,0% bèo tấm thì tổng lượng khí sinh học gia tăng rất lớn, nhưngnếu bổ sung hơn 2% thì sự gia tăng không còn tiếp tục

Nguồn thực phẩm cho con người và thức ăn chăn nuôi

Dân số thế giới tăng gần gấp đôi trong giai đoạn 1950 – 2000 (từ 2,7 đến 6 tỷ người)nhưng nhu cầu về thịt lại tăng gấp 5 lần (từ 45 triệu tấn lên 233 triệu tấn/năm) Tổchức Lương thực và Nông nghiệp Thế giới (FAO, ước tính đến năm 2050) dự đoánrằng khi dân số tăng lên 9 tỷ người thì sản lượng thịt phải đạt 410 triệu tấn/năm Trongkhi đó, nguồn protein từ thịt chỉ mới đáp ứng được 40% nhu cầu về protein hàng ngàycủa con người Do vậy, vấn đề đảm bảo nguồn thực phẩm đáp ứng cho nhu cầu củacon người là một vấn đề vô cùng cấp bách

Nguồn cung cấp protein động vật chính cho con người là thịt, cá, trứng, sữa và proteinthực vật chủ yếu là đậu nành, lúa mì, khoai tây, rau xanh… Tuy nhiên, ngày nay nhiều

xviii

nguồn cung cấp protein khác cũng được chú ý đến như côn trùng (dế hay một số loài

ấu trùng), tảo và vi tảo (Spirulina, Arthrospira…), rong biển (Ulva Monostroma,

Laminaria…), cải dầu và bèo tấm… Trên khắp thế giới, đặc biệt là ở châu Á, người

dân thường thu hoạch các thực vật thủy sinh tự nhiên như rau diếp biển (Pistia), bèo tây (Eichhcornia), bèo dâu (Azolla) và bèo tấm (Lemna) để làm thức ăn chăn nuôi,

phân chuồng và cả thực phẩm cho con người Bèo tấm tích lũy một lượng rất lớnprotein (từ 6.8 – 45% trọng lượng khô tùy theo loài) và gần như tương đương với đậu

tương Các nhóm hoạt chất sinh học và tiềm năng làm dược liệu của L minor cũng

được khảo sát

1.2 Tổng quan về protein

1.2.1 Giới thiệu và phân loại

Protein là một nhóm các hợp chất đại phân tử sinh học, cùng với polysaccharide, lipid

và nucleic acid, tạo nên các hợp phần chủ yếu của cơ thể sống Một cách cụ thể,protein là các polymer được tạo nên từ các trình tự các amino acid xác định Protein làhợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống Về mặt số lượng,protein chiếm không dưới 50% trọng lượng khô của tế bào Từ lâu người ta đã biếtrằng protein tham gia mọi hoạt động sống trong cơ thể sinh vật Ngoài vai trò là thànhphần chính trong cấu trúc của tế bào và mô, protein còn có nhiều chức năng phong phúkhác quyết định những đặc điểm cơ bản của sự sống như sự truyền đạt thông tin ditruyền, sự chuyển hoá các chất Thật vậy, các enzyme, các kháng thể chống lại bệnhtật, các hormon dẫn truyền các tín hiệu trong tế bào, đều có bản chất là protein Ngàynay, khi hiểu rõ vai trò to lớn của protein đối với cơ thể sống, người ta càng thấy rõtính chất duy vật và ý nghĩa của định nghĩa thiên tài của Engels P.: “Sự sống làphương thức tồn tại của những thể protein” Với sự phát triển của khoa học, vai trò và

ý nghĩa của protein đối với sự sống ngày càng được khẳng định Cùng với nucleicacid, protein là cơ sở vật chất của sự sống

1.2.2 Vai trò sinh học của protein

Tạo hình

Ngoài các protein làm nhiệm vụ cấu trúc như vỏ virus, màng tế bào, còn gặp nhữngprotein thường có dạng sợi như: sclerotin có trong lớp vỏ ngoài sâu bọ; fibrolin của tơtằm, nhện; collagen, elastin của mô liên kết, mô xương Collagen đảm bảo cho độ bền

và tính mềm dẻo của mô liên kết

Xúc tác

Hầu hết tất cả các phản ứng xảy ra trong cơ thể đều do các protein đặc biệt đóng vaitrò xúc tác Những protein này được gọi là các enzyme Mặc dù gần đây người ta đã

xix

phát hiện được một loại RNA có khả năng xúc tác quá trình chuyển hoá tiền RNAthông tin (pre-mRNA) thành RNA thông tin (mRNA), nghĩa là enzyme không nhấtthiết phải là protein Tuy nhiên, hầu hết các phản ứng diễn ra trong các cơ thể sống đềuđược xúc tác bởi các enzyme có bản chất protein Bởi vậy, định nghĩa có tính chất kinhđiển: enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hoáhọc, là chất xúc tác sinh học vẫn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Hiện nay người ta biếtđược khoảng 3.500 enzyme khác nhau, trong số đó nhiều enzyme đã được tinh sạch,kết tinh và nghiên cứu cấu trúc.

Bảo vệ

Ngoài vai trò là chất xúc tác và tạo cấu trúc cho tế bào và mô, protein còn có chứcnăng chống lại bệnh tật để bảo vệ cơ thể Đó là các protein tham gia vào hệ thống miễndịch Đặc biệt nhiều loại protein thực hiện các chức năng riêng biệt tạo nên hiệu quảmiễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu Các protein miễn dịch được nhắc đến nhiều hơn

cả là các kháng thể, bổ thể và các cytokine Ngoài ra, một số protein còn tham gia vàoquá trình đông máu để chống mất máu cho cơ thể Một số loài có thể sản xuất ra nhữngđộc tố có bản chất protein như enzyme nọc rắn, lectin, có khả năng tiêu diệt kẻ thù

Dẫn truyền tín hiệu thần kinh

Nhiều loại protein tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu thần kinh đối với cáckích thích đặc hiệu như sắc tố thị giác rodopsin ở võng mạc mắt

Điều hoà

xx

Nhiều protein có khả năng điều hoà quá trình trao đổi chất thông qua việc tác động lên

bộ máy thông tin di truyền như các hormon, các protein ức chế đặc hiệu enzyme Một

ví dụ điển hình là các protein repressor ở vi khuẩn có thể làm ngừng quá trình sinhtổng hợp enzyme từ các gene tương ứng

Cung cấp năng lượng

Protein là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể sống Khi thủy phân protein, sảnphẩm tạo thành là các amino acid, từ đó tiếp tục tạo thành hàng loạt các sản phẩmtrong đó có các keto acid, aldehyd và carboxylic acid Các chất này đều bị oxy hoá dầndần tạo thành CO2 và H2O đồng thời giải phóng ra năng lượng

1.2.3 Phân loại

Căn cứ vào sự có mặt hay vắng mặt của một số thành phần có bản chất không phảiprotein mà người ta chia protein thành hai nhóm lớn:

Protein đơn giản

Là những phân tử mà thành phần cấu tạo của nó gồm hoàn toàn amino acid Dựa theokhả năng hòa tan trong nước hoặc trong dung dịch đệm muối, kiềm hoặc dung môihữu cơ người ta có thể chia các protein đơn giản ra một số nhóm nhỏ như: albumin,globulin, prolamin, glutenin và histon

Protein phức tạp

Là những protein mà thành phần phân tử của nó ngoài các amino acid còn có thêmthành phần khác có bản chất không phải là protein còn gọi là nhóm ngoại Tùy thuộcvào bản chất của nhóm ngoại, người ta chia các protein phức tạp ra các nhóm nhỏ vàthường gọi tên các protein đó theo bản chất nhóm ngoại:

 Lipoprotein: Nhóm ngoại là lipid

 Nucleoprotein: Nhóm ngoại là acid nucleic

 Glycoprotein: Nhóm ngoại là carbohydrate và dẫn xuất của nó

 Phosphoprotein: Nhóm ngoại là acid phosphoric

 Cromoprotein: Nhóm ngoại là hợp chất có màu Tùy theo tính chất của từng nhóm ngoại mà có những màu sắc khác nhau như đỏ (ở hemoglobin), vàng (ở

flavoprotein)…

1.3 Quá trình oxy hóa

Trong những năm gần đây, thuật ngữ “oxy hóa” và “gốc tự do” ngày càng phát triển.Oxy hóa là một quá trình tự nhiên sản sinh các gốc tự do, luôn luôn diễn ra và đượcđiều hòa trong cơ thể Tuy nhiên, các gốc tự do không ổn định và dễ hoạt động quámức: mỗi gốc tự do có một electron tự do, do đó nó luôn có xu hướng thoát khỏi trạng

xxi

thái này bằng cách gắn vào các phân tử kế cận kể cả những phân tử quan trọng và nhạycảm như protein, chất béo thậm chí là vật liệu di truyền DNA Ngay khi gắn vào cácphân tử kế cận, các gốc tự do làm biến đổi các phân tử này thành gốc tự do và mộthiệu ứng dây chuyền diễn ra vô hạn Nếu không ngăn chặn hiệu ứng này kịp thời sẽdẫn đến các bệnh ung thư, bệnh mãn tính và sự lão hóa, bao gồm sự lão hóa của da,một trong những cơ quan thường xuyên tiếp xúc với các tác nhân gây hại như tia UV,gió lạnh, các vi sinh vật và tác nhân gây ô nhiễm môi trường , , Quá trình oxy hóachất béo trong chế biến và bảo quản làm giảm chất lượng của sản phẩm thực phẩm Các gốc tự do được hình thành thông qua các phản ứng bình thường trong cơ thể trongquá trình hô hấp ở các sinh vật hiếu khí, đặc biệt là vật có xương sống và con người.,Các chất oxy hóa ngoài việc được sinh ra tự nhiên trong cơ thể và các phản ứng thứcấp, còn có nhiều nguồn khác hình thành các chất oxy hóa.

Trong điều kiện bình thường, hệ thống chống oxy hóa có thể loại bỏ các phản ứng đặcbiệt thông qua enzyme (như superoxyde dismutase và glutathione peroxydase) và chấtchống oxy hóa phi enzyme (như vitamin chống oxy hóa, nguyên tố vi lượng, cáccoenzyme và cofactor) Tuy nhiên, trong một số trường hợp các hệ thống phòng thủnội sinh không bảo vệ cơ thể chống lại phản ứng của các gốc tự do của cơ thể sinh ra

Từ đó cho thấy sự cần thiết của chất chống oxy hóa tổng hợp và tự nhiên, có thể ngănchặn quá trình oxy hoá và tác hại của nó Chất chống oxy hóa tổng hợp vừa rẻ và hiệuquả nhưng không tốt cho sức khỏe con người Trong các lĩnh vực dinh dưỡng của conngười và hóa sinh, chất chống oxy hóa tự nhiên có nguồn gốc từ các nguồn thực phẩm

đã được chú ý nhiều hơn vì các lợi ích sức khỏe của chúng, không có hoặc ít tác dụngphụ

1.4 Peptide có hoạt tính sinh học

1.4.1 Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa

Đã có những nghiên cứu về các peptide có hoạt tính chống oxy hóa có trong sản phẩmthủy phân đậu nành hay các peptide có hoạt tính chống oxy hóa có trong sản phẩmthủy phân nhau thai cừu Một số nghiên cứu đã được thực hiện các chất chống oxy hóapeptide tiềm năng trong gelatin da cá Ngoài ra một số dịch thủy phân protein từ nguồnđộng vật và thực vật cũng đã được tìm thấy có hoạt động chống oxy hóa

Chúng có một số ưu điểm so với các chất chống oxy hóa enzyme đó là với cấu trúcđơn giản chúng có sự ổn định hơn trong tình huống khác nhau và không có phản ứngmiễn dịch nguy hiểm Hơn thế nữa, chúng còn thể hiện tính chất dinh dưỡng và chứcnăng., Nhiều nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng đến sức khỏe của các peptide có hoạttính sinh học, các nghiên cứu này được tiến hành trên dịch thủy phân từ protein hoặccác peptide có hoạt tính sinh học

xxii

Dịch thủy phân là một hỗn hợp chủ yếu bao gồm các peptide và acid amine được sảnxuất thông qua quá trình thủy phân protein của enzyme, xử lý acid hoặc kiềm hoặc lênmen Khi sự phân giải protein được gây ra bởi các protease nội sinh, thuật ngữ "tựphân" thường được sử dụng chứ không phải là "thủy phân".

Trong lĩnh vực khoa học dinh dưỡng ứng dụng, dịch thủy phân protein không tinhkhiết có thể có một số lợi ích nhất định hơn so với những peptide tinh khiết do việchấp thụ các oligopeptide có thể được tăng lên khi có sự hiện diện của đường và aminoacid Hơn nữa, nó đã được chứng minh rằng thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa caohơn so với các peptide tinh khiết

Bảng 1.3 trình bày một danh sách các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa cũng nhưtính chất cấu trúc của chuỗi acid amine và dịch thủy phân

Bảng 1.3 Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa từ một số nguồn khác nhau

Ức chế quá trình tựoxy hóa, khả năngquét gốc tự doDPPH, superoxyde

và hydroxyl

Zhang vàcộng sự,2010

Tính khử, ức chếquá trình oxy hóaLDL ở người, khảnăng quét gốc tự doDPPH và khả năngtạo phức với kimloại

Hwang vàcộng sự,2010

và hydroxyl, bảo

vệ DNA

Sheih vàcộng sự,2009

Peptide từ

da ếch

neutrase,pepsin,papain, α-chymotryp

trypsin

Ức chế oxy hóalipid, khả năngquét gốc tự doDPPH, peroxyl,superoxyde vàhydroxyl

và arginine

Pepsin vàpancreatin

Khả năng tạo phứcvới Cu

Megias vàcộng sự,2008

xxiii

500-41.12% amino acidđược thủy phân và

amnie thơm

quét gốc tự do, ứcchế oxy hóa lipid

>10kDa

Phân đoạnbằng UF vàthủy phânbằng

Flavourzyme

Hệ nhũ tương cóhoạt tính chốngoxy hóa, khả năngquét gốc tự do, tínhkhử

Moure vàcộng sự,2005

Cơ chế chống oxy hóa chính xác của các peptide vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn,nhưng các nghiên cứu khác nhau đã cho thấy rằng các peptide là những chất ức chếquá trình oxy hóa lipid , khả năng quét gốc tự do và tạo phức với kim loại Ngoài ra,

các peptide chống oxy hóa bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại do ROS qua sự cảm ứng củagen Vì di-peptide Met-Tyr từ cơ thịt của cá sardine ngăn ngừa oxy hóa bằng cách kíchthích biểu hiện của heme oxygenase-1 (HO-1) và ferritin (protein chống oxy hóa)trong các tế bào nội mô Hơn nữa, kết quả từ một nghiên cứu cho thấy protein cá cókhả năng tăng cường hoạt động của glutathione peroxydase (GSH-Px) và superoxydedismutase (SOD) và giảm nồng độ malondialdehyde (MDA) in vivo

Đặc tính chống oxy hóa của các peptide có liên quan đến thành phần, cấu trúc, và tính

kị nước Tyr, Trp, Met, Lys, Cys, và His là ví dụ của các acid amine gây ra hoạt tínhchống oxy hóa Các amino acid có vòng thơm có thể tặng proton cho các gốc thiếuđiện tử Đặc tính này cải thiện các tính chất quét gốc tự do của các amino acid Điềunày có thể chứng minh rằng hoạt tính chống oxy hóa của các peptide có chứa His cóliên quan đến khả năng tặng hydro, bắt gốc tự do hoặc có khả năng tạo phức với kimloại của nhóm imidazol Mặt khác, nhóm -SH của cysteine có một hành động chốngoxy hóa quan trọng độc lập do sự tương tác trực tiếp với các gốc tự do

Ngoài sự hiện diện của các acid amine thích hợp, vị trí của chúng trong chuỗi peptideđóng một vai trò quan trọng trong hoạt động chống oxy hóa của các peptide Chen vàcộng sự (1996) đã tiến hành tổng hợp 28 peptide theo cấu trúc của một peptide chống

xxiv

oxy hóa (Leu-Leu-Pro-His-His) từ dịch thủy phân của protein đậu nành Kết quả nàycho thấy khả năng chống oxy hóa của peptide phụ thuộc nhiều vào phân đoạn His-Histrong chuỗi Leu-Leu-Pro-His-His và hoạt tính của nó giảm khi loại bỏ một gốc Hiscuối cùng của chuỗi Cũng theo kết quả nghiên cứu này, Pro-His-His cho thấy hoạttính chống oxy cao nhất trong số tất cả các peptide được thử nghiệm Saito và cộng sự(2003) đã báo cáo rằng bất kỳ sự thay đổi trong việc sắp xếp trình tự các acid aminetrong tripeptit dẫn đến các khả năng chống oxy hóa khác nhau

Peptide liên kết hoặc đặc điểm cấu trúc cụ thể của các peptide đã được khẳng định ảnhhưởng đến khả năng chống oxy hóa Ví dụ, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các acidamine có thể phát huy tính chống oxy hóa cao hơn khi chúng hình thành các di-peptide Trái ngược với những phát hiện này, các kết quả khác cho thấy liên kếtpeptide hoặc cấu trúc của nó có thể làm giảm khả năng chống oxy hóa của các acidamine cấu thành

Ngoài ra, cấu hình của peptide cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa.Chen và cộng sự (1996) đã tìm thấy sự thay thế của L-His bởi D-His trong một peptidechống oxy hóa dẫn đến giảm hoạt tính Các tác giả kết luận vị trí chính xác của nhómimidazole là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa

Ngoài những gì đã được đề cập ở trên, các yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến khả năngchống oxy hóa của các peptide có hoạt tính sinh học Hoạt tính chống oxy hóa có thể

bị ảnh hưởng bởi các điều kiện phân tách các protein, mức độ thủy phân, loại protease,, cấu trúc peptide và nồng độ peptide Ảnh hưởng của nồng độ protein trên khả năngchống oxy hóa đã được công bố trong một nghiên cứu về thủy phân protein đậu phộng.Ngoài ra, trọng lượng phân tử (MW) của peptide có thể ảnh hưởng đến khả năngchống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân từ gluten ngô có liênquan đến nồng độ và trọng lượng phân tử của các thành phần trong thủy phân Khảnăng chống oxy hóa của các peptide có MW 500-1500 Da thì mạnh hơn so với cácpeptide trên 1500 Da và peptide dưới 500 Da

1.4.2 Cơ chế hình thành hoạt tính sinh học của các peptide

Cơ chế tác động của các peptide kháng khuẩn tích điện dương đang được tích cựcnghiên cứu và các thông tin có sẵn tiếp tục phát triển Phần lớn các thí nghiệm cho đếnnay đều tập trung chủ yếu vào sự tương tác của các peptide tích điện dương với hệthống màng tế bào Các nghiên cứu khác cũng đã được tiến hành trên toàn bộ tế bào vikhuẩn chủ yếu là sử dụng màng tế bào có xu hướng nhạy cảm thuốc nhuộm và cácpeptide gắn huỳnh quang Các nghiên cứu này đã chỉ ra rằng tất cả các peptide kháng

vi sinh vật tương tác với màng tế bào theo hai nhóm cơ chế là phá vỡ màng và không

xxv

phá vỡ.

Một quan điểm khác cho rằng chỉ có một nhóm, các peptide kháng khuẩn tích điệndương có nhiều tác động trên các tế bào khác nhau từ sự thẩm thấu của màng đến vách

tế bào và hiệu quả phân chia tế bào đến ức chế sự tổng hợp đại phân tử và các tác động

đó giúp tiêu diệt vi khuẩn ở nồng độ hiệu quả tối thiểu thay đổi theo các loại peptidekhác nhau và giống vi sinh vật

Cơ chế tác dụng trên vi khuẩn gram âm được nghiên cứu nhiều nhất Tổng quan về sựtương tác của peptide với màng bao của vi khuẩn gram âm được hiển thị như hình 1.4

Sự kết hợp ban đầu của các peptide với màng vi khuẩn xảy ra thông qua các tương táctĩnh điện giữa các peptide tích điện dương và lipopolysaccharide tích điện âm (LPS)trên màng ngoài dẫn đến xáo trộn màng tế bào

Hình 1.4 Sự tương tác của các peptide có hoạt tính sinh học trên màng tế bào

Điều này chứng minh rằng peptide tích điện dương có ái lực cao đối với LPS trong lớpđơn bên ngoài của lớp màng kép tế bào vi khuẩn gram âm hơn so với các cation hóa trịhai như Mg2+ và Ca2+ Các peptide tích điện dương dịch chuyển các cation từ LPSmang điện âm dẫn đến sự xáo trộn cục bộ trong màng ngoài Điều này tạo điều kiệncho sự hình thành các khu vực mất ổn định thông qua đó các peptide đổi vị trí màngngoài trong một quá trình hấp thu

1.5 Sử dụng enzyme để sản xuất các peptide có hoạt tính sinh học

Về cơ bản, các peptide có hoạt tính sinh học có thể được tạo ra từ các protein theonhiều cách như là thủy phân bằng enzyme (bởi các enzyme tiêu hóa hoặc các enzyme

có nguồn gốc từ vi sinh vật và thực vật) và quá trình lên men của vi sinh vật Ở cácnước Đông Nam Á như Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc, quá trình lên men được

sử dụng rộng rãi như là cách thức cổ xưa nhất để bảo quản thực phẩm Người ta tinrằng quá trình lên men có thể kéo dài thời gian bảo quản và làm tăng giá trị dinhdưỡng của thực phẩm có thể là do sự phân mảnh của protein thành các peptide có hoạttính sinh học bằng protease vi sinh vật Tuy nhiên, sự phân cắt của liên kết peptide

xxvi

tăng cường số lượng của các nhóm amino và cacboxyl tự do dẫn đến tăng cường khảnăng hòa tan Do đó, quá trình thủy phân có thể tăng hoặc giảm tính kị nước mà chủyếu phụ thuộc vào bản chất của các protein được thủy phân và trọng lượng phân tử củacác peptide được tạo ra Hơn nữa, quá trình thủy phân dẫn đến hình thành các peptidenhỏ có hoạt tính sinh học , và các peptide đắng dưới 1000 Da Tuy nhiên, quá trìnhthủy phân sâu sắc có thể ảnh hưởng xấu đến tính chất chức năng của peptide.

Mặc dù protein của lá đinh lăng giá trị dinh dưỡng cao nhưng nó ít được sử dụng do độhòa tan kém; màu sắc, hương vị và kết cấu không được đánh giá cao Hạn chế này cóthể được khắc phục bằng cách sử dụng các enzyme thủy phân

Protease tác động đến kích thước, số lượng, cấu tạo của acid amine tự do và cácpeptide và trình tự amino acid của chúng do đó ảnh hưởng đến khả năng chống oxyhóa của dịch thủy phân., , Trong nghiên cứu của Penta-Ramos và cộng sự các tác giả

sử dụng các enzym khác nhau để thủy phân protein đậu nành (SPI) có nguồn gốc bản

xứ Kết quả của các tác giả này cho thấy việc sử dụng các enzyme khác nhau dẫn đến

sự hình thành của một hỗn hợp của các peptide với mức độ thủy phân khác nhau vàtheo đó dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa khác nhau

Trong các nghiên cứu khác nhau, hoạt tính kháng oxy của dịch thủy phân bằngenzyme Alcalase cao hơn so với các dịch thủy phân bằng các loại enzyme khác Cácpeptide được sản xuất bởi Alcalase có hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm hoạt tínhkháng oxy hóa Hơn nữa, so với các protease khác, thủy phân bằng Alcalase thu đượccác peptide có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn và các peptide ngắn hơn Kết quả làcác peptide có hoạt tính sinh học có khả năng kháng enzyme tiêu hóa tốt hơn

1.6 Khả năng ứng dụng sinh học của các peptide có hoạt tính sinh học

Nhiều peptide có hoạt tính sinh học đặc biệt đang được sử dụng rộng rãi trong thựctiễn y học Peptide có hoạt tính sinh học (bioactive peptide/biologically active peptide)

là những peptide mà ngoài giá trị dinh dưỡng chúng còn có một số ảnh hưởng đặc biệtđến chức năng sinh lý của cơ thể Tính chất này được quy định bởi thành phần và thứ

tự của các amino acid trong peptide Mellander (1950) là người đầu tiên đưa ra thuậtngữ peptide có hoạt tính sinh học khi ông nhận thấy các peptide bị phosphoryl hóa cónguồn gốc từ casein hoạt động như chất mang các chất khoáng Những nghiên cứu vềpeptide đã có những bước tiến đáng kể trong vài thập niên gần đây Những hiểu biết vềtác dụng và cơ chế tác dụng của peptide đã làm cho nó ngày càng nhận được nhiều sựquan tâm đặc biệt trong lĩnh vực y dược Ngoài ra, peptide có hoạt tính sinh học cònđược sử dụng trong các loại thực phẩm chức năng, nhất là các thực phẩm chức năng cónguồn gốc từ sữa

xxvii

Hình 1.5 Ảnh hưởng của các peptide có hoạt tính sinh học lên cơ thể

Khả năng chữa bệnh của peptide là rất cao Đến bây giờ trên thị trường đã có 9 sảnphẩm sử dụng peptide và trên 100 công ty đang sản xuất ra nhiều sản phẩm peptidemới và đưa vào thử nghiệm

 Peptide – hormon tham gia vào các quá trình trao đổi chất, vận chuyển thông tin hóahọc giữa các tế bào mô và các cơ quan

 Insulin là peptide – hormon điển hình, là phân tử khá lớn, có 51 amino acid tạo thành 2 chuỗi polypeptit nối với nhau bằng cầu disulfid (-S-S)

 Glucagon là một peptide – hormon bao gồm 29 amino acid được tổng hợp từ tuyến tụy, có tác động ngược với insulin

Bảo vệ cơ thể

Chống vi sinh vật

Điều hòa hệ miễn

dịch

 Corticotropin là peptide – hormon bao gồm 39 amino acid, được tạo ra từ phần trước của tuyến yên, có vai trò kích thích hoạt động của vỏ tuyến thượng thận Ngoài ra, còn có nhiều loại peptide mạch ngắn có phổ hoạt động rộng Ví dụ: loạipeptide tổng hợp hóa học L Aspatyl phenylalanin methylester là chất ngọt hơn đườngtới hàng trăm lần hiện đang được dùng rộng rãi trong công nghiệp và chế biến thựcphẩm để thay thế đường Peptide mạch ngắn tự nhiên bao gồm 9 amino acid do vùngnão dưới đồi tiết ra và dự trữ ở thùy sau tuyến yên, có khả năng kích thích dạ con cobóp hoặc peptide ngắn bradykinin gồm 9 amino acid có tác dụng ức chế hiện tượngsưng tấy các mô Một peptide ngắn khác là enkephalin được tạo ra ở não bộ là chất cótác dụng giảm đau Bên cạnh đó còn nhiều loại peptide – hormon khác có tác dụngkhác nhau đối với hoạt động sống của cơ thể.

1.7 Tình hình nghiên cứu thu nhận các chất có hoạt tính sinh học từ bèo ở Việt Nam

Là một nước nhiệt đới, Việt Nam thích hợp cho các hoạt động nghiên cứu và nuôitrồng bèo tấm Có 3 loài bèo tấm thuộc 3 chi khác nhau đã được tìm thấy ở Việt Nam

đó là: Lemna aequinoctialli, S polyrhiza, Wolffia globosa và chúng phân bố nhiều ở

hai đồng bằng Bắc Bộ và Nam Bộ Trong bộ lưu trữ bèo tấm quốc tế RDSC, hiện có

18 dòng bèo tấm đến từ Việt Nam thuộc các loài S polyrhiza, L punctata, L.

aequinoctialis, và Lemna tenera Một số dòng bèo tấm của Việt Nam đã được khảo sát

trong các công trình của các nhóm nghiên cứu đến từ Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,CHLB Đức

Việc nuôi trồng bèo tấm ở Việt Nam thường được thực hiện ở quy mô gia đình Phâncủa vật nuôi được thu nhận trong một cái bể nhỏ, sau đó lượng nước chảy ra từ bể nàyđược đưa vào trong 1 bể lớn hơn, tại bể này người dân nuôi 1 lớp mỏng bèo tấm ở trênmặt Bèo được thu hoạch hàng ngày và trộn với phế phẩm, phụ phẩm nông nghiệp đểlàm thức ăn cho vịt

Nghiên cứu sinh học phân tử trên bèo tấm ở Việt Nam phải kể đến các nghiên cứuthuộc đề tài “Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòngchống bệnh cúm ở gia cầm” của PGS.TS Lê Huy Hàm (Viện Di truyền nông nghiệp)

Các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin từ hai loài bèo tấm L aequinoctialis DB1 và S polyrhiza DB2 đã được phân lập Vũ Văn Tiến và cộng sự đã xây dựng thành công quy trình nuôi cấy callus của L aequinoctialis, đồng thời khảo sát khả

năng sử dụng Agrobacterium để thực hiện chuyển gen vào đối tượng này Một số kếtquả có tiềm năng ứng dụng để sản xuất vaccine phòng cúm từ bèo tấm cũng đã đượccông bố

Việc sử dụng bèo tấm làm đối tượng nghiên cứu tại Việt Nam còn chưa thu được

xxix

nhiều sự quan tâm Đa phần các nghiên cứu tập trung vào những ứng dụng bèo tấmtrong sản xuất nông nghiệp Ví dụ, khi sử dụng bèo tấm trong khẩu phần ăn của vịt thịt

và vịt sinh sản thì mức tăng trọng của vịt thịt, tỷ lệ đẻ và tỷ lệ trứng có phôi của vịtsinh sản đều tương đương với vịt được bổ sung bột đậu nành và bột cá Chúng tôi hầunhư không tìm thấy các nghiên cứu về tính chất chức năng, tính chất dinh dưỡng cũngnhư các protein/peptide có hoạt tính sinh học từ bèo tấm ở Việt Nam

1.8 Thủy phân protein từ bèo tấm bằng phương pháp enzyme để thu các peptide

có hoạt tính sinh học

Tác nhân thủy phân protein có thể là acid mạnh (HCl, H2SO4), kiềm mạnh (NaOH)hoặc enzyme Tuy nhiên việc thủy phân bằng acid và kiềm gặp phải nhiều trở ngại:oxy hóa một số amino acid, gây ra hiện tượng racemic hóa amino acid (amino acidchuyển từ dạng L sang D khiến con người và động vật không hấp thu được), xảy ra cácphản ứng khử amine: một phần cystein và cystin bị phá hỏng, arginin phân hủy thànhornitin và urea, các amino acid có lưu huỳnh bị oxy hóa, tryptophan bị phân hủy hoàntoàn, thậm chí có thể hình thành hợp chất độc như lysino – alanine Hơn nữa quá trìnhthủy phân bằng acid hay kiềm rất khó kiểm soát, thiết bị chịu nhiệt độ cao, áp suất cao,khả năng bị ăn mòn cao, và không an toàn đối với công nhân sản xuất cũng như đốivới môi trường Chính vì thế, hiện nay phương pháp thủy phân bằng acid hay kiềm rấthạn chế sử dụng, thay vào đó là phương pháp sử dụng enzyme protease Ngoài ra, ởmột số nước như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản lên men cũng là một phương pháptruyền thống để chuyển protein thành các protein hydrolysate và peptide sinh học nhờenzyme của vi sinh vật

Nhìn chung quá trình xử lý enzyme đã được áp dụng để cải thiện giá trị dinh dưỡng(tăng khả năng tiêu hóa, giảm tính dị ứng) và tính chất chức năng của protein (như khảnăng hòa tan, khả năng nhũ hóa…) Một số peptide sinh học tồn tại tiềm ẩn trong dungdịch protein ban đầu cũng được hoạt hóa bởi enzyme thủy phân Enzyme có thể gâythủy phân và duỗi mạch protein, làm xuất hiện một số amino acid kỵ nước và do vậy

có thể làm tăng hoạt tính sinh học như tăng khả năng kháng oxy hóa Thủy phânenzyme cũng làm tăng khả năng hòa tan do tạo thành các amino acide tự do và tăng sốlượng các gốc carboxyl Nhìn chung xử lý enzyme có thể làm tăng tính kỵ nước hoặcháo nước của protein, tùy thuộc vào bản chất của protein ban đầu và kích thước phân

tử của các protein hydrolysate Các peptide có kích thước lớn thường có vị đắng;peptide có MW nhỏ hơn 1kDa ít đắng hơn nhưng mức độ thủy phân (DH – degree ofhydrolysis) cao có thể làm giảm hoạt tính sinh học của protein hydrolysate.,

Protein trích ly từ bèo có thể được thủy phân bằng các enzyme protease để tạo ra rấtnhiều các loại peptide có hoạt tính sinh học khác nhau Việc lựa chọn enzyme là mộtyếu tố rất quan trọng trong quá trình thủy phân vì những protease khác nhau có đặc

xxx

tính thủy phân khác nhau, dẫn tới sản phẩm tạo ra có thành phần, phân tử lượng vàtính chất chức năng cũng như sinh học khác nhau Tùy thuộc vào kích thước củaprotein hydrolysate và các biopeptide cần thu nhận, người ta có thể sử dụng riêng rẽhoặc kết hợp 2 loại enzyme endopeptidase (Alcalase 2.4L, Neutrase 0.5L, Corolase

7089, pepsin) và exopeptidase (Corolase LAP) Ngoài ra một số enzyme chứa đồngthời cả 2 hoạt tính endo - và exo - như papain, bromelain, pancreatine hay các enzymethương mại như Corolase PN-L, Protamex, Flavourzyme 1000L… cũng được sử dụng

để thủy phân protein của bèo Một số nghiên cứu đã thu nhận các peptide và proteinhydrolysate có hoạt tính kháng oxy hóa và giảm huyết áp từ rong biển Kết quả chothấy sử dụng pepsin hoặc chế phẩm Alcalase tạo ra các peptide có hoạt tính kháng oxyhóa cao Hỗn hợp protein hydrolysate bao gồm các oligopeptide, đường và amino acidthể hiện hoạt tính sinh học cao hơn so với các peptide tinh sạch Sản phẩm protein vàpeptide từ bèo tấm thu nhận bằng phương pháp này cũng cho thấy tiềm năng làm giảmcholesterol trong máu, dẫn đến giảm chứng tăng huyết áp và xơ vữa động mạch

xxxi

1.9 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm

Khảo sát các yếu tố công nghệ

Chọn ra yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng

mô hình Blackett Burman

Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein

Nồng độ enzyme

pH môi trường

Thời gian thủy phân

Nhiệt độ thủy phân

Hàm mục tiêu:

Khả năng kháng oxy hóaHàm lượng phenolic tổngMức độ thủy phân

Hiệu suất thu hồi peptide

Hàm mục tiêu:

Khả năng kháng oxy hóa

Hàm mục tiêu:

Khả năng kháng oxy hóa

Alcalase

Protamex

Flavourzyme

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm làm đề tài

Thời gian: 03/01/2019 đến 22/06/2019

Địa điểm thực hiện đề tài: Trung tâm thí nghiệm thực hành trường Đại học Côngnghiệp Thực phẩm Tp.HCM

2.2 Nguyên liệu và thiết bị

2.2.1 Protein từ bèo tấm

Trong một báo cáo mới nhất, các thành phần trong bèo tấm gồm: hàm lượng protein(20 – 35% trọng lượng chất khô) và thành phần acid amine, hàm lượng chất béo (4 –7%) và thành phần acid béo, tinh bột (4 – 10%) Các protein chứa khoảng 5% lysine,3% methionine + cysteine (acid amine chứa lưu huỳnh) và 8% phennylalanine +tyrosine Tất cả các acid amine quan trọng này được WHO khuyến cáo dinh dưỡngcho con người

Bèo tấm có tỉ lệ protein rất cao, thậm chí còn cao hơn tỉ lệ protein có trong đậu nành(45% so với 36%) Trong một hội nghị về công nghệ thực phẩm tại Chicago (Mỹ), cácnhà khoa học của Pháp và Tây Ban Nha đã tiết lộ phương pháp làm khô bèo tấm vànghiền nó thành bột protein Kết quả của quá trình chế biến là một loại thực phẩm màuxanh lá cây, được gọi là Lentein, trong đó chứa 68% protein cũng như chất xơ

2.2.2 Quy trình chuẩn bị nguyên liệu:

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu thủy phân

Bột bèoTrích ly protein

NaOH 1%,

H2O

Lọc sơ bộ

Ly tâmTủa proteinHCl

BãBã

Ly tâmChuẩn bị dịch lọc

2.2.3 Thuyết minh quy trình chuẩn bị nguyên liệu

2.2.3.1 Chuẩn bị bột bèo

Bèo tấm Lemnoideae được thu nhận tại các ao ở xã Nhật Tảo, huyện Tân Trụ, tỉnh

Long An Sau đó bèo được vận chuyển trong ngày lên phòng thí nghiệm tại TP.HCM.Tại phòng thí nghiệm, bèo được rửa để loại bỏ các tạp chất, sau đó được phơi khô vàxay nhỏ bằng máy rồi rây qua rây lưới kích thước 0,3 mm và được bảo quản ở nhiệt độphòng

2.2.3.2 Chuẩn bị dịch trích protein từ bèo tấm

Bột bèo được pha với NaOH (1%) theo tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:20 khuấy vàđiều nhiệt đến nhiệt độ 55oC Quá trình trích ly protein bằng NaOH được thực hiện ở

55oC trong 75 phút, có khuấy trộn Sau đó, ta lọc sơ bộ thu lấy dịch trích Phần bã rắnđược tiếp tục trích ly bằng nước Tại đây, bã được được đem đi trích ly thêm bằngnước với tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10 Hỗn hợp được giữ ở 55oC trong 75 phút,

Bột bèoTrích ly protein

NaOH 1%,

H2O

Lọc sơ bộ

Ly tâmTủa proteinHCl

BãBã

Ly tâmChuẩn bị dịch lọcLọc membrane

Dịch trong

Dịch protein

H2O,

NaOH

có khuấy trộn, rồi lọc sơ bộ thu lấy dịch Phần dịch của phần sau khi trích ly bằngkiềm được trộn chung với phần trích ly bằng nước Hỗn hợp dịch trích sau đó được lytâm tốc độ 5.000 vòng/phút để loại bỏ cặn còn lại

2.2.3.3 Chuẩn bị dịch tủa protein

Dịch trích protein được kết tủa bằng dung dịch HCl 2N Sau đó, để yên hỗn hợp ởnhiệt độ phòng trong 90 phút Protein bị tủa được tách ra khỏi dịch bằng cách ly tâmvới tốc độ 5.000 vòng/phút Tủa protein được tái hòa tan vào nước và điều chỉnh về

pH 9 để tiến hành tinh sạch bằng membrane

2.2.3.4 Lọc membrane

Cách tiến hành:

 Lắp đặt màng 5 kDa vào hệ thống

 Kiểm tra độ kín và tình trạng các thiết bị đo trên hệ thống

 Rửa màng theo quy định (bằng nước tinh khiết qua lọc RO)

 Chuẩn bị dung dịch protein

 Chạy hệ thống lọc, toàn bộ dòng không qua màng và dòng qua màng được hồilưu lại bể nhập liệu cho đến khi hệ thống ổn định, sau đó tách riêng dòng qua màng.Cho dòng không qua màng hồi lưu 100% về nhập liệu

 Xác định thông số lưu lượng dòng qua màng: bằng cách xác định thời gian đểđạt được 50 mL dòng qua màng

 Tập hợp toàn bộ dòng qua màng thu được, trộn đều và lấy mẫu

 Trộn đều thùng nhập liệu và lấy mẫu đại diện cho dòng không qua màng

 Rửa màng theo quy định (bằng nước tinh khiết qua lọc RO) Kiểm tra hiệntượng nghẹt màng

 Mẫu dung dịch nhập liệu, dòng không đi qua màng và dòng qua màng đượcphân tích hàm lượng protein

2.2.4 Enzyme

Các enzyme được sử dụng trong nghiên cứu này là: Flavourzyme 500MG, Protamex1.5 U/g và Alcalase 2.4L Các loại enzyme này đều được mua tại Công ty BrenntagViệt Nam (Số 202, đường Hoàng Văn Thụ, Phường 09, Quận Phú Nhuận, TP Hồ ChíMinh)

Alcalase® 2.4 L là loại endoprotease được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis,

Alcalase 2.4L có hoạt tính riêng là 2,4 AU/g (đơn vị Anson) chế phẩm, tên thường gọi

là subtilisin Carlsberg, điều kiện thích hợp của enzyme là pH = 7 – 9 và nhiệt độ ở 40– 65oC Bảo quản kín, khô ráo, ở nhiệt độ dưới 10oC

ProtamexTM kết hợp cả hai loại endoprotease và exopeptidase được thu nhận từ vi

khuẩn Bacillus licheniormis và Bacillus amyloliqueaciens có hoạt tính 1,5 U/g chế

Enzyme Protamex được bảo quản trong điều kiện khô ráo, kín, ở nhiệt độ 5oC

Flavourzyme 500MG là một hỗn hợp peptidase, vừa có hoạt tính endoprotease, vừa có

hoạt tính exoprotease, được thu nhận từ nấm Aspergillus oryzae có hoạt tính 500 U/g

chế phẩm, điều kiện thích hợp của enzyme là pH = 5 – 7 và nhiệt độ 50 – 55oC Bảoquản trong điều kiện khô, kín, ở nhiệt độ 5oC

2.2.5 Các thiết bị sử dụng trong quá trình trích ly và thu nhận protein

Tủ bảo quản mẫu: tủ lạnh

Thiết bị ly tâm: sử dụng thiết bị ly tâm HERMLE Z206A (6 x 50ml; 5500 v/p)