KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH KẾT TỦA PROTEIN TỪ DỊCH TRÍCH PROTEIN BÈO TẤM BẰNG MUỐI AMONISULFATE, CỒN VÀ ACID

Với mỗi loại tác nhân, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dungmôi:cơ chất, nồng độ dung môi sử dụng, nhiệt độ và thời gian tủa của từng tác nhânđến hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH KẾT TỦA PROTEIN

TỪ DỊCH TRÍCH PROTEIN BÈO TẤM BẰNG MUỐI AMONISULFATE, CỒN VÀ ACID

Giảng viên hướng dẫn: TRẦN CHÍ HẢI

Sinh viên thực hiện:

NGUYỄN THỊ THU NGÂN MSSV: 2005150003 LỚP: 06DHTP3

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH KẾT TỦA PROTEIN

TỪ DỊCH TRÍCH PROTEIN BÈO TẤM BẰNG MUỐI AMONISULFATE, CỒN VÀ ACID

Giảng viên hướng dẫn: TRẦN CHÍ HẢI

Sinh viên thực hiện:

NGUYỄN THỊ THU NGÂN MSSV: 2005150003 LỚP: 06DHTP3

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC

PHẨM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA

VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT Khóa luận tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp

1 Những thông tin chung:

Họ và tên sinh viên được giao đề tài (Số lượng sinh viên: 02)

(2) Nguyễn Thị Thu Ngân MSSV: 2005150003 Lớp: 06DHTP3

Tên đề tài:

(1) Khảo sát quá trình kết tủa protein từ dịch trích protein bèo tấm bằng cồn và acid (2) Khảo sát quá trình kết tủa protein từ dịch trích protein bèo tấm bằng muối amonisulfate

2 Nhận xét của giảng viên hướng dẫn:

- Về tinh thần, thái độ làm việc của sinh viên:

- Về nội dung và kết quả nghiên cứu:

- Ý kiến khác:

3 Ý kiến của giảng viên hướng dẫn về việc SV bảo vệ trước Hội đồng:

TP Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019

GVHD

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi cam đoan rằng báo cáo khóa luận tốt nghiệp này là do chính chúng tôi thựchiện dưới sự hướng dẫn của thầy ThS Trần Chí Hải Các số liệu và kết quả phân tíchtrong báo cáo là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào

TP.HCM, tháng 06 năm 2019

Sinh viên thực hiện

(Kí và ghi rõ họ tên)

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành kết tủa dịch trích protein từ bèo tấm bằngcác tác nhân kết tủa như muối amonisulfate, acid và cồn Sau đó, kết tủa được tiếnhành tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích để thu nhận chế phẩm proteinconcentrate/isolate Với mỗi loại tác nhân, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dungmôi:cơ chất, nồng độ dung môi sử dụng, nhiệt độ và thời gian tủa của từng tác nhânđến hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa Sau quá trình thực hiện, chúng tôi đãthu được những kết quả sau:

Đối với phương pháp kết tủa protein bằng muối amonisulfate (NH4)2SO4 tỉ lệ muối:dịch trích là 5:1, nồng độ bão hòa của dung dịch muối sử dụng là 80%, thời gian tủa

120 phút và nhiệt độ 30oC Với những điều kiện trên, quá trình thu hồi protein có thểđạt hiệu suất là 83,93% và độ tinh sạch là 66,17% Đối với tác nhân cồn, hiệu suất thuhồi đạt được 61,05% và độ tinh sạch 61,03 % trong điều kiện nồng độ cồn 90%, tỉ lệcồn: dịch trích là 4:1, thời gian tủa 50 phút và nhiệt độ 5oC Đối với tác nhân là acid,chúng tôi tiến hành khảo sát và đã chọn được ở pH 4, thời gian tủa 90 phút và nhiệt độ

35oC có thể đạt được hiệu suất kết tủa protein 76,11% và độ tinh sạch là 44,45% Kết quả nghiên cứu cho thấy muối (NH4)2SO4 là lựa chọn tốt nhất để tủa protein từdịch trích bèo tấm Do đó, kết tủa ptotein bởi muối (NH4)2SO4 được thẩm tích nhằmtăng độ tinh sạch cho phần tủa này Quá trình thẩm tích được tiến hành với 12 chu kì

bổ sung nước (60 phút/chu kì), lúc này độ tinh sạch đạt 95,65%, tăng 1,44 lần so vớimẫu trước khi thẩm tích

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu về kết tủa và tinh sạchprotein ở quy mô công nghiệp cũng như là áp dụng trên các đối tượng protein từ thựcvật khác

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, trước hết chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đếnquý thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại học Công nghiệp thựcphẩm Tp Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho chúng emtrong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường

Trong quá trình thực hiện đề tài chúng em đã gặp không ít khó khăn Nhưng với sựđộng viên giúp đỡ của quý thầy cô, người thân và bạn bè, chúng em cũng đã hoànthành tốt đề tài nghiên cứu của mình và có được những kinh nghiệm, kiến thức hữu íchcho bản thân

Cảm ơn các thầy cô Trung tâm thí nghiệm thực hành đã tạo luôn điều kiện thuận lợi đểchúng em có thể hoàn thành các thí nghiệm của mình Đặc biệt chúng em xin gởi lờicảm ơn sâu sắc đến thầy Trần Chí Hải, người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp

đỡ chúng em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Dù đã cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những sai sót Rất mong sự thông cảm vàđóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện

Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô và các bạn sức khỏe, luôn thành công trong côngviệc và cuộc sống

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, tháng 06, năm 2019

SVTH

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

TÓM TẮT KHÓA LUẬN ii

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU x

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về bèo tấm 1

1.1.1 Giới thiệu 1

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

1.1.3 Đặc điểm sinh học 4

1.1.4 Đặc điểm môi trường sống 5

1.1.5 Thành phần dinh dưỡng bèo tấm 6

1.1.6 Các nghiên cứu ứng dụng của bèo tấm 9

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu bèo tấm ở Việt Nam hiện nay 13

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài về bèo tấm 14

1.2 Tổng quan về protein 17

1.2.1 Giới thiệu về protein 15

1.2.2 Protein trong bèo tấm 17

1.2.3 Protein concentrate/isolate 17

1.3 Các phương pháp thu nhận kết tủa protein 18

1.3.1 Kết tủa bằng muối trung tính 19

1.3.2 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ 20

1.3.3 Kết tủa protein tại điểm đẳng điện 21

1.3.4 Kết tủa bằng các loại polymer và bằng chất đa điện phân 22

1.3.5 Tinh sạch protein bằng phương pháp thẩm tích 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 24

2.2 Vật liệu nghiên cứu 24

2.2.1 Nguyên liệu 24

2.2.2 Hóa chất 25

2.2.3 Thiết bị 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 27

2.3.2 Sơ đồ quy trình công nghệ 28

2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 29

2.4.1 Chuẩn bị dịch trích 29

2.4.1 Phương pháp kết tủa protein bằng muối amonisulfate 29

2.4.1.1 Khảo sát tỉ lệ muối: dịch trích đến quá trình kết tủa 29

2.4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối đến quá trình kết tủa 30

2.4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết kết tủa 31

2.4.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tủa 31

2.4.2 Phương pháp kết tủa protein bằng cồn 32

2.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cồn: dịch trích đến quá trình kết tủa 32

2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến quá trình kết tủa 33

2.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tủa 34

2.4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tủa 35

2.4.3 Phương pháp kết tủa protein bằng acid 36

2.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình kết tủa 36

2.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tủa 37

2.4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tủa 37

2.4.4 Khảo sát thời gian thẩm tích 38

2.4.4.1 Chuẩn bị kết tủa 38

2.4.4.2 Khảo sát thời gian thẩm tích 38

2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 39

2.5.1 Phương pháp phân tích 39

2.5.1.1 Xác đinh hàm lượng protein 39

2.5.1.2 Xác định khối lượng chất khô của tủa bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi 39

2.5.1.3 Xác định tổng carbohydrate trong mẫu theo phương pháp phenolsulfuric 39 2.5.2 Phương pháp xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 Kết quả khảo sát phương pháp kết tủa protein bằng muối amonisulfate 40

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ muối: dịch trích đến quá trình tủa 40

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối amonisulfate đến quá trình tủa 41

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tủa 42

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tủa 44

3.2 Kết quả khảo sát phương pháp kết tủa protein bằng cồn 45

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cồn: dịch trích đến quá trình tủa 45

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến quá trình tủa 47

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tủa 48

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tủa 50

3.3 Kết quả khảo sát phương pháp kết tủa protein bằng acid 51

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với quá trình tủa 51

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tủa tại điểm đẳng điện 52

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tủa tại điểm đẳng điện 54

3.4 So sánh các phương pháp kết tủa 55

3.5 Kết quả của quá trình thẩm tích 57

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC A: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ 7

PHỤ LỤC C: HÌNH ẢNH 45

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Bèo tấm 1

Hình 1.2 Các đại diện của 5 chi bèo tấm với kích thước hệ gen tương ứng 2

Hình 1.3 Bản đồ phân bố địa lý của bèo tấm năm 1986 [5] 3

Hình 1.4 Thành phần hóa học của 6 loài 8

Hình 1.5 Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH 22

Hình 1.6 Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein 23

Hình 2.1 Bèo tấm tại đầm rau nhút 24

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 27

Hình 2.3 Quy trình công nghệ 28

Hình 3.1 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa ở thí nghiệm khảo sát tỉ lệ muối: dịch trích 40

Hình 3.2 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa trong thí nghiệm khảo sát nồng độ muối amonisulfate 41

Hình 3.3 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa trong thí nghiệm khảo sát thời gian kết tủa 43

Hình 3.4 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa trong thí nghiệm khảo sát nhiệt độ kết tủa 44

Hình 3.5 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa trong thí nghiệm khảo sát tỉ lệ cồn: dịch trích 45

Hình 3.6 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa tong thí nghiệm khảo sát nồng độ cồn .47

Hình 3.7 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa trong tí nghiệm khảo sát thời gian 48

Hình 3.8 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa trong thí nghiệm khảo sát nhiệt độ 50

Hình 3.9 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa trong thí nghiệm khảo sát pH 51

Hình 3.10 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa trong thí nghiệm khảo sát nhiệt độ tủa tại điểm đẳng điện 53

Hình 3.11 Hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch protein tủa trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình tủa tại điểm đẳng điện 54

Hình 3.12 Kết quả tủa protein bằng các tác nhân khác nhau 56

Hình 3.13 Độ tinh sạch của protein theo thời gian thẩm tích 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo [9] 7

Bảng 1.2 Kết quả khảo sát hàm lượng các vi lượng có trong một số loài bèo và được thu ở những vùng khác nhau 8

Bảng 1.3 Những mốc quan trọng trong nghiên cứu cơ bản trên bèo tấm 12

Bảng 1.3 Thành phần acid amine của bèo tấm (g/100g) 17

Bảng 2.1 Thành phần hóa học trong nguyên liệu 24

Bảng 2.2 Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 25

Bảng 2.3 Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 26

Bảng 2.4 Thiết kế thí nghiệm khảo sát tỉ lệ muối: dịch trích đến quá trình kết tủa 29

Bảng 2.1 Thiết kế thí nghiệm khảo sát nồng độ muối đến quá trình kết tủa 30

Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tủa 31

Bảng 2.3 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tủa 32

Bảng 2.4 Thiết kế thí nghiệm khảo sát tỷ lệ cồn: dịch trích đến quá trình kết tủa 33

Bảng 2.9 Thiết kế thí nghiệm khảo sát nồng độ cồn đến quá trình kết tủa 34

Bảng 2.5 Thiết kế thí nghiệm khảo sát thời gian đến quá trình kết tủa bằng cồn 34

Bảng 2.6 Thiết kế thí nghiệm khảo sát nhiệt độ đến quá trình kết tủa bằng cồn 35

Bảng 2.7 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình kết tủa 36

Bảng 2.8 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tủa 37

Bảng 2.9 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tủa 38

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ muối: dịch trích đến quá trình tủa 40

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối bão hòa đến quá trình tủa 41

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tủa 43

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tủa 44

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ cồn: dịch trích đến quá trình tủa 45

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến quá trình tủa 47

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tủa 49

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tủa 50

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH đến quá trình tủa 51

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tủa tại điểm đẳng điện 53

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tủa tại điểm đẳng điện 54

Bảng 3.12 So sánh kết quả các phương pháp tủa 55

PI: Protein isolate

PGS.TS: Phó giáo sư- Tiến sĩ

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Protein chiếm tới 15-20% trọng lượng cơ thể có vai trò vô cùng quan trọng Chúng làthành phần chính của bạch cầu, hoạt động chống lại vi khuẩn, đồng thời tạo nên cáckháng thể, làm tăng khả năng miễn dịch trước sự tác động của các vật lạ bên ngoài.Thiếu protein, cơ thể không thể duy trì các hoạt động sống Đó là loại vật chất cầnthiết để cơ thể thực hiện các chức năng từ tiêu hóa đến sinh sản Nó cũng cần để sảnxuất chất dẫn truyền thần kinh tác động đến tinh thần và suy nghĩ của chúng ta Mỗingày, chúng ta đang cố gắng bổ sung đạm (protein) qua nhiều thực phẩm khác nhau,chủ yếu là thịt bò, thịt gia cầm, hải sản, trứng, rau, các loại ngũ cốc… và dường nhưnguồn protein từ động vật đang được chú trọng hơn cả Trong khi đó, dù rất cần thiết,nhưng protein động vật chỉ nên được sử dụng vừa phải, bởi trong chúng chứa khánhiều chất béo bão hòa và cholesterol không có lợi cho tim mạch và huyết áp Với nhucầu ngày càng tăng về thực phẩm của thế giới sẽ đòi hỏi sự phát triển của các nguồnprotein thực vật mới Vậy làm thế nào chúng ta có thể sản xuất đủ protein cho tất cảdân số thế giới? Trong một hội nghị về công nghệ thực phẩm tại Chicago (Mỹ), cácnhà khoa học của Pháp và Tây Ban Nha đã tiết lộ phương pháp làm khô bèo tấm

(Lemnoideae) và nghiền nó thành bột protein Bèo tấm được biết đến là một trong

những loài sản xuất sinh khối nhanh nhất trên thế giới, dễ nuôi và giàu protein Ở nước

ta bèo tấm chủ yếu được dùng làm thức ăn cho gia cầm và lợn, chưa mang đến nhiềugiá trị về mặt kinh tế Để tân dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền với giá trị tiềm ẩn cao

này, nhóm “Nghiên cứu sản xuất protein concentrate/isolate từ bèo tấm Lemnoideae”

đã được thành lập Trong quá trình nghiên cứu để thu nhận protein thì công đoạn kếttủa protein từ dịch trích là vô cùng quan trọng Vì thời gian có hạn nên trong đề tài này

chúng tôi chỉ thực hiện nội dụng “Khảo sát quá trình kết tủa protein từ dịch trích protein bèo tấm bằng các tác nhân amonisulfate, cồn và acid” để xác định tác nhân

và điều kiện tối ưu nhất để hiệu suất quá trình kết tủa protein từ dịch trích bèo là tốtnhất

Mục tiêu đề tài

+ Đưa ra các thông số (tỷ lệ dung môi:dịch trích, nhiệt độ và thời gian) phù hợpcủa từng phương pháp kết tủa protein (bằng tác nhân muối amonisulfate, tácnhân cồn và acid) và quy luật tác động của các thông số đến quá trình kết tủaprotein từ dịch trích protein bèo tấm

+ Khảo sát quá trình tinh sạch bằng thẩm tích đối với protein sau khi tủa bằngmuối amonisulfate.

Mục đích nghiên cứu

Làm cơ sở để sản xuất protein concentrate/isolate từ bèo tấm (Lemnoideae) mang lại

hiệu quả kinh tế trong công nghiệp

Giới hạn đề tài

Vì lý do giới hạn về thời gian và kinh tế, đề tài chỉ thực hiện tủa protein với 3 tác nhânmuối amonisulfate, cồn và điểm đẳng điện bằng acid, tinh sạch protein bằng phươngpháp thẩm tích màng cellophane và nguyên liệu sử dụng là dịch trích từ bèo tấm đượcthu nhận bằng phương pháp trích ly bằng kiềm NaOH 1%, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi

là 1:20 (w/v), nhiệt độ 550C và thời gian trích ly là 75 phút ở quy mô phòng thínghiệm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

+ Xác định được các thông số công nghệ tối ưu của tỉ lệ dung môi/dịch trích,nồng độ dung môi sử dụng, nhiệt độ và thời gian kết tủa protein của từng tácnhân kết tủa đem lại hiệu quả về hiệu suất cũng như độ tinh sạch của protein

Từ đó lựa chọn phương pháp tủa sử dụng tác nhân nào là hiệu quả nhất nhằmhướng tới quy mô công nghiệp

+ Ứng dụng thành công phương pháp thẩm tích để tinh sạch protein nhằm tăng độtinh sạch của chế phẩm protein thu được mang lại hiệu quả kinh tế cao

Nội dung nghiên cứu

+ Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cồn: dịch trích; tỷ lệ muối amonisulfate: dịch trích+ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tủa của các tác nhân acid; cồn; muốiamonisulfate

+ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tủa của các tác nhân acid; cồn; muốiamonisulfate

+ Khảo sát thời gian thẩm tích

Đề tài được trình bày trong 62 trang, chia làm 5 chương bao gồm:

Chương 1: Mở đầu (03 trang)

Chương 2: Tổng quan (21 trang)

Chương 3: Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu (16 trang)Chương 4: Kết quả và bàn luận (20 trang)

Chương 5: Kết luận và kiến nghị (02 trang)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về bèo tấm

1.1.1 Giới thiệu

Bèo tấm là nhóm thực vật thủy sinh một lá mầm có phổ phân bố rất rộng cùng với tốc

độ sinh trưởng nhanh, có tiềm năng kinh tế cao Cùng với tốc độ tăng trưởng sinh khốicao sinh khối bèo tấm còn chứa hàm lượng protein cao là nguồn thức ăn quan trọngcho vật nuôi Đặc biệt, bèo tấm được nuôi trồng trên ao hồ trở thành một thành phầntrong mô hình vườn - ao - chuồng mà không làm ảnh hưởng đến diện tích đất trồngcây lương thực truyền thống Ngoài ra, bèo tấm là thực vật thủy sinh ưa thích được sửdụng để làm sạch các nguồn nước thải Chính vì những đặc điểm khác biệt so với cácđối tượng thực vật khác mà bèo tấm ngày càng nhận được sự quan tâm nghiên cứu củacác nhà khoa học ở nhiều quốc gia trên thế giới

 Phân họ (subfamilia): Lemnoideae

Hiện nay, phân họ bèo tấm (Lemnoideae) có 37 loài thuộc 5 chi: Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffiella và Wolffia [1]

Hình 1.2 Các đại diện của 5 chi bèo tấm với kích thước hệ gen tương ứng

Mặc dù một bài báo vào năm 2002 từ nhóm Don Les đã liệt kê có 38 loài, nhưng saumột cuộc hội thảo gần đây với Klaus Appenroth thì điều đó được xác nhận là 37 loài vì

Lemna ecuadoriensis được kết hợp với Lemna obscura bởi Elias Landolt [2].

Bèo tấm là một trong số các cây trồng có sự phát triển nhanh nhất bởi chúng có khảnăng sinh sản rất mạnh Nó được xem là loài cây nhỏ nhất, hoa hiếm khi nhìn thấyđược do kích thước nhỏ và nở chậm Bèo tấm chủ yếu được sinh sản vô tính bằng cáchnảy chồi nơi mà mỗi cây gốc tạo ra cây mới Những lá mới hình thành vẫn còn gắn với

lá cây mẹ trong giai đoạn phát triển ban đầu và do đó các cây này dường như bao gồmnhiều lá Mỗi một cá thể có thể sinh ra tới 20 cây con trong suốt cuộc đời, kéo dàitrong 10 ngày đến vài tuần.Với chế độ sinh sản này có thể cho phép chúng bao phủmặt hồ một cách nhanh chóng trong thời gian rất ngắn

“Quái vật của Darwin” (Darwinian Demon) là thuật ngữ được dùng để nói đến nhữngsinh vật có khả nắng sinh sản gần như là ngay lập tức sau khi được sinh ra, có trạngthái sinh lý khỏe mạnh nhất và được xem như là trường sinh Sử dụng các phương

pháp phân tích định lượng để nghiên cứu trên S polyrhiza, các nhà khoa học đã chứng

minh rằng bèo tấm là loại thực vật hạt kín có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất so với tỷ lệ

cơ thể Vì vậy, bèo tấm được dùng để minh họa cho khái niệm “Quái vật của Darwin”[3]

Nhiều loài có thể tạo ra các hạt và chồi (hoặc búp) để vượt qua mùa đông; lá được tạo

ra từ hạt Chồi là cấu trúc đã được thay đổi để bèo có thể chìm xuống đáy hồ, đó là nơichúng sống qua mùa đông, cho đến khi nước ấm mới kích hoạt sự tăng trưởng bìnhthường, nhưng không phải tất cả các loại bèo đều có thể mọc chồi

Bèo tấm phân bố trên khắp thế giới nhưng phổ biến và đa dạng nhất là ở các khu vựcnhiệt đới và cận nhiệt đới Còn ở các vùng ôn đới và hàn đới thì chúng chủ yếu pháttriển mạnh trong các tháng hè Bèo tấm thường xuất hiện ở các khu vực nước đọnghoặc có dòng chảy chậm Sự tăng trưởng nhanh thường được ghi nhận ở các ao hồnhỏ, đầm lầy vì đây là những khu vực có nguồn dinh dưỡng dồi dào Đặc biệt là ở khuvực có cá sấu sinh sống thì tốc độ tăng trưởng của bèo tấm là cực đại Một vài loài

cũng tồn tại trong môi trường nước nhiễm mặn (tối đa 2,5% NaCl đối với Lemna

minor), tuy nhiên chúng không tích lũy ion Na+ trong quá trình sinh trưởng [4]

Hình 1.3 Bản đồ phân bố địa lý của bèo tấm năm 1986 [5]

Chú thích: khu vực có bèo tấm; 1, 2, 3, 5: khu vực không có bèo tấm (1: quá khô; 2:quá ẩm; 3: quá lạnh; 5: chưa được khảo sát

vật trong chi này có cấu trúc phức tạp nhất, có hoa và nhiều rễ trên mỗi lá Bèo tấm chi

Landoltia tương tự với chi Spirodela, nhưng có kích thước nhỏ hơn (khoảng một phần ba), có ít rễ (từ một vài đến một lá) và khác với chi Landoltia, chi Spirodela có các chấm nhỏ đặc trưng trên bề mặt lá Bèo tấm trong chi Lemna, có một hoặc một vài lá

trong cấu trúc và chỉ có duy nhất một rễ, kích thước nhỏ hơn các thành viên của chi

Landoltia Có kích thước nhỏ nhất và cấu trúc đơn giản nhất là chi Wolffia và chi Wolffiella (không có rễ, hoa đơn giản), các chi này có thể được phân biệt bởi các đặc điểm như Wolffiella dài và cứng, Wolffia thì có hình oval Mặc dù khá dễ dàng để phân

biệt giữa các chi với nhau nhưng việc xác định các loài trong từng chi thì khá khó

khăn, đặc biệt là chi Lemna.

Các loài bèo tấm thường được tìm thấy ở những vùng nước giàu chất dinh dưỡng, vàcác quần thể chứa hàng chục nghìn cá thể có thể phát triển mạnh trong các ao hồ nhỏhoặc rãnh nhỏ Một số loài bèo tấm có thể sống ở nhiệt độ lạnh (nhưng không đóngbăng) và tăng độ mặn có thể kích thích sự phát triển, mặc dù độ mặn quá mức có thể

ức chế sự tăng trưởng hoặc giết chúng Bèo tấm có thể cung cấp môi trường sống chonhiều sinh vật dưới nước như côn trùng và ếch và là nguồn thực phẩm quan trọng chođộng vật hoang dã, bao gồm cả cá và chim [6]

Theo R A Leng và cộng sự, thì bèo tấm có cấu trúc đơn giản hóa bởi chọn lọc tựnhiên Lá của bèo tấm có dạng phẳng và hình trứng, rễ của một số loài bèo tấm có xuhướng dài ra khi nguồn dinh dưỡng hay khoáng chất đang cạn kiệt Theo Trần Thị

Kim Dung thì Lemna thuộc nhóm cây một lá mầm nhỏ nhất, phần lớn có cả lá, rễ, hoa,

quả, những cây trưởng thành không có thân cây; lá (cánh bèo) có kích thước khác nhauphụ thuộc vào từng chi, từng loài [7]

Kích thước và số lượng rễ trên một cánh bèo ở các loài bèo tấm không giống nhau và

phụ thuộc vào từng loài Đa số những loài thuộc họ Lemna chỉ có một rễ, S.polyrrhiza

có từ 7-12 rễ hoặc nhiều hơn và có thể dài đến 10 mm, Landoltia có 2-3 rễ và có thể

lên tới 5 rễ với chiều dài tối đa có thể đạt được 6 mm Ngoại trừ điều kiện khắc nghiệt,trong điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay các khoáng chất thì rễ sẽ dài hơn Trong khi

đó, trong môi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn hơn thậm chí có loài không hìnhthành rễ Cấu trúc rễ của bèo tấm cũng hết sức đơn giản, không có các rễ con và không

phản ánh sự tăng trưởng cũng như sự tạo nhánh Vì lẽ đó rễ của bèo tấm rất mảnh vànhỏ Cũng giống như các loại rễ phổ biến khác, rễ bèo tấm có cấu tạo gồm 4 phầnchính: đỉnh rễ, vùng mô phân sinh, vùng kéo dài và vùng các tế bào thuần thục [7].Hoa của các loài bèo tấm đã được nghiên cứu tương đối kĩ Chúng thường hình thành

và tồn tại trong thời gian ngắn và hiếm khi quan sát thấy Hoa các loại bèo có thể hìnhthành trong thời gian ngắn hay dài khác nhau tùy thuộc vào loài Mỗi hoa thường có 2nhị hoa và 1 vòi nhụy hoa duy nhất Các nhụy hoa thường ngắn và khó quan sát hơn

Hoa của chi Wolffia là nhỏ nhất trong thế giới các loài hoa, nó chỉ dài 0,3 mm.

Quả của bèo đa phần là nhỏ, có lớp vỏ ngoài khô, một số trong đó có thể được quan sátthấy bằng mắt thường Quả bèo thường có dạng như một túi có răng cưa, đôi khi códạng dọc hơi phẳng, và thường chứa từ 1-6 hạt Quả có dạng túi nhỏ chứa không khí

và hạt, nhằm mục đích giúp cây có thể nổi được trên mặt nước [5]

Bèo tấm có hai phương thức sinh sản để duy trì nòi giống là sinh sản hữu tính và sinhsản vô tính Sinh sản vô tính chiếm ưu thế hơn so với sinh sản hữu tính Hình thức sinhsản hữu tính của bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất lợi để bảo tồn nòigiống [7] Bèo tấm sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân sinhnằm trong xoang ở vùng gốc cánh Ở điều kiện tối ưu, tốc độ sinh sản vô tính của bèotấm gần đạt mức tăng theo hàm số mũ Lượng cánh bèo có thể tăng gấp đôi chỉ sau 24

giờ nuôi cấy ở các loài sinh trưởng nhanh như L aequimoctialis, W microscopica Với

sinh sản vô tính thì thời gian một vòng đời của cánh bèo chỉ vài tuần

1.1.4 Đặc điểm môi trường sống

Hầu hết các loài bèo được tìm thấy ở các vùng khí hậu nhiệt đới và ôn đới Ở vùng sa

mạc và vùng ẩm ướt, chúng rất hiếm Ví dụ, Lemna spp rất hiếm ở những vùng có

lượng mưa cao hoặc rất thấp và không tìm thấy ở đảo Greenland hay Aleutian Mặc dùnhiều loài có thể sống sót ở nhiệt độ cao, chúng thường phát triển nhanh hơn trongđiều kiện ấm và nắng Hầu hết các loài cho thấy sự tăng trưởng mạnh ở vùng nhiệt đới.Các yếu tố khí hậu khác nhau như cường độ ánh sáng, độ muối, nhiệt độ khu vực khác

nhau có thể ảnh hưởng đến sự phân bố của các loài Lemnaceae Chim và lũ lụt thường

phân tán các loại bèo đến các khu vực địa lý khác nhau

Bèo tấm cũng cần năng lượng mặt trời và một số chất khoáng để thực hiện quá trìnhsinh tổng hợp như các đối tượng thực vật khác Tuy nhiên, nếu trong môi trường cóchứa đường hoặc tinh bột thì bèo tấm có thể sinh trưởng được mà không cần ánh sángmặt trời (trong trường hợp sử dụng bèo tấm để xử lý nước thải của các cơ sở sản xuấtđường hoặc tinh bột…)

Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của bèo tấm [6]:

 Nhiệt độ nước: nhiệt độ thích hợp cho điều kiện phát triển phụ thuộc vào giốngloài Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển tối đa của hầu hết các nhóm thường nằmgiữa 17,5-300C Dù một số loài có thể chịu được nhiệt độ gần nhiệt độ đóngbăng nhưng tốc độ tăng trưởng sẽ giảm Dưới 170C một số giống bèo cho thấytốc độ tăng trưởng giảm Hầu hết các loài gần như sẽ chết nếu nhiệt độ nướctăng lên trên 350C Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự tăng trưởng sẽ bị ảnhhưởng bởi cường độ ánh sáng, nghĩa là khi ánh sáng tăng, tốc độ tăng trưởngtăng từ 10 đến 300C

 pH nước: giá trị pH nước phù hợp nhất là 6,5-7 Các loại bèo tấm thường đượccoi là có sự thích nghi trong khoản pH rộng Chúng tồn tại tốt ở pH từ 5 đến 9,mặc dù một số tác giả đưa ra phạm vi từ 3 đến 10 Tuy nhiên, giới hạn độ pHcủa các loài khác nhau sẽ khác nhau

 Nồng độ khoáng: bèo tấm cũng cần dinh dưỡng và chất khoáng để sinh trưởngphát triển, tuy nhiên ở môi trường có nồng độ khoáng và chất dinh dưỡng caothì bèo tấm lại sinh trưởng chậm hơn so với những vùng nước có hàm lượngkhoáng thấp

 Độ sâu của nước: ở điều kiện thời tiết ấm thì độ sâu của nước không ảnh hưởngnhiều đến sự sinh trưởng và phát triển của bèo tấm Tuy nhiên đây lại là vấn đềlớn ở những vùng có khí hậu nóng hoặc lạnh, vì nhiệt độ nước sẽ biến động rấtlớn và không giữ được ở khoảng nhiệt độ tối thích Bên cạnh đó, độ sâu củanước còn ảnh hưởng đến cả việc thu hoạch Trên thực tế, độ sâu của vùng nướcnuôi trồng bèo tấm cần phải được tính toán kỹ lưỡng hơn so với yếu tố hàmlượng dinh dưỡng, pH nước, đồng thời việc thu hoạch có thể được điều chỉnhtùy thuộc vào tốc độ sinh trưởng, sự thay đổi khí hậu và dòng dinh dưỡng trong

hệ thống

Ở điều kiện sinh trưởng tối ưu (về nhiệt độ nước, pH, chiếu sáng, nguồn dinh dưỡng),bèo tấm có thể tăng gấp đôi sinh khối trong vòng 16-24 giờ Theo tính toán lý thuyết,với tốc độ sinh trưởng như vậy thì chỉ sau 50 ngày, bèo tấm có thể mọc kín 1 ha nuôitrồng với lượng ban đầu chỉ 10 cm2 và sau 60 ngày thì sẽ phủ kín toàn bộ diện tích 32

ha [4]

1.1.5 Thành phần dinh dưỡng bèo tấm

Theo Landolt và Kandeler, hàm lượng chất dinh dưỡng trong bèo tấm rất cao Bèo tấm

có chứa các vitamin A, B1, B2, và các axit amin không thay thế, trừ methionin Bèo

tấm được nuôi ở điều kiện tối ưu là một trong những loài thực vật có hàm lượngprotein tổng số đạt cao nhất Hầu hết các loại bèo có hàm lượng protein đạt từ 6,8 –45% phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện nuôi cấy Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượngprotein trong cánh bèo bao gồm: ánh sáng, nhiệt độ, thành phần và hàm lượng khoángchất trong môi trường nuôi Hàm lượng protein và các thành phần hữu cơ khác cótrong cánh bèo được liệt kê theo bảng sau:

Bảng 1.1 Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo [9]

Trong những năm qua, công ty Parabel đã điều tra thành phần dinh dưỡng của bèo vàcác sản phẩm có nguồn gốc từ cây thủy sinh Một báo cáo gần đây phân tích thành

phần hóa học của sáu loài đại diện cho tất cả năm chi Spirodela polyrhiza, Landoltia punctata, Lemna gibba, Lemna minor, Wolffiella hyalina, Wolffia microscopica Kết

quả của nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng lượng chất khô 6 loài dao động từ 4 đến

8%; protein dao động từ 20 đến 35% (dw), thấp nhất là L punctata và cao nhất là W hyalina; hàm lượng chất béo từ 4 đến 7% (dw), acid béo bão hòa khoảng 25 đến 46 %

tổng hàm lượng chất béo; và tinh bột từ 4 đến 10% (dw) Ngoài ra trong bèo còn chứa

vi chất dinh dưỡng bao gồm khoáng chất và chất dinh dưỡng thực vật Nồng độ và tính

chất của các nguyên tố vi lượng có trong Lemnaceae cũng phụ thuộc phần lớn vào

nguồn nước nơi bèo tấm phát triển [10]

Hình 1.4 Thành phần hóa học của 6 loài

(A) Trọng lượng khô, (B) Hàm lượng protein tổng số, (C) Hàm lượng axit béo, (D)Hàm lượng tinh bột Dữ liệu (B – D) có liên quan đến trọng lượng khô Có nghĩa là ±

độ lệch chuẩn được đưa ra

Nồng độ và tính chất của các nguyên tố vi lượng có trong Lemnaceae cũng phụ thuộc

phần lớn vào nguồn nước nơi bèo tấm phát triển

paucicos

tata

0,65-1,03

1.1.6 Các nghiên cứu ứng dụng của bèo tấm

Do tốc độ gia tăng dân số cũng như sự phát triển của các khu công nghiệp lớn nên nhucầu về lương thực và năng lượng trên toàn thế giới tăng rất nhanh Với những ưu điểmcủa mình (thực vật thủy sinh, tốc độ sinh trưởng nhanh, có thể phát triển được trongmôi trường nước ô nhiễm, khả năng hấp thụ N, P cao, hàm lượng tinh bột nhiều, hàmlượng protein…), bèo tấm là một lựa chọn tiềm năng làm nguồn nguyên liệu thay thế

Sử dụng bèo tấm để sản xuất bioethanol và biobutanol

Có nhiều nghiên cứu tập trung vào việc gia tăng hàm lượng tinh bột trong bèotấm dùng cho sản xuất nhiên liệu sinh học Có hai quá trình tác động tới sự tích lũytinh bột trong sinh khối bèo tấm, đó là quá trình quang hợp để hình thành tinh bột và

sự tiêu hao tinh bột trong các quá trình trao đổi chất Với các kỹ thuật nuôi trồng bèotấm hiện nay, hàm lượng tinh bột được tổng hợp nhờ quá trình quang hợp là rất lớn, vìthế các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc hạn chế các quá trình phân giải tinh bột.Các nghiên cứu chính bao gồm:

(1) Sự thiếu hụt P, K và N là nguyên nhân làm giảm quá trình dị hóa, từ đó gia tănghàm lượng tinh bột tích lũy trong cây Năm 2009, Cheng và Stomp đã nghiên cứu vàthấy rằng khi cấy chuyển bèo tấm từ môi trường giàu dinh dưỡng sang môi trường chỉ

có nước máy thì hàm lượng tinh bột tích lũy trong S polyrhiza tăng lên từ 20-45,8%sau 5 ngày [11]

(2) Năm 2011, Cui và cộng sự đã công bố điều kiện nhiệt độ thấp và thời gian chiếusáng kéo dài sẽ gia tăng sự tích lũy tinh bột ở S polyrhiza [12] Cụ thể, khi nhiệt độban ngày không thay đổi thì nhiệt độ thấp vào ban đêm sẽ kích thích sự tích lũy tinh

bột Ngược lại, hàm lượng tinh bột không khác biệt trong điều kiện thay đổi nhiệt độban ngày và giữ nguyên nhiệt độ ban đêm.

(3) Năm 1976, McLaren và Smith đã nghiên cứu và thấy rằng: sau 6 ngày nuôi cấy L.minor trong môi trường có mặt 10-6M ABA thì trọng lượng tươi giảm 60% nhưngsinh khối khô tăng 220% và tinh bột trong sinh khối khô tăng gần 500% [13]

Đặc biệt, Su và cộng sự đã chỉ ra rằng bèo tấm là một cơ chất có tiềm năng trong quátrình lên men vì dưới tác động của nấm men chúng không những được chuyển hóathành ethanol mà còn tạo ra các alcohol cao năng lượng khác để sản xuất nhiên liệusinh học [14]

Bên cạnh đó, việc thử nghiệm sản xuất sinh khối trên quy mô lớn cũng đã được thựchiện Năm 2011, Xu và cs đã xây dựng hệ thống nuôi và thu sinh khối bèo tấm đầutiên để sản xuất ethanol tại North Carolina, Mỹ Năm 2012, Farrell đã nuôi bèotấm trong một đầm (phá) rộng 23 ha và thấy rằng trong điều kiện thiếu dinh dưỡng thìhàm lượng tinh bột gia tăng từ >10% lên đến trung bình 19% Các yếu tố chính cầnquan tâm khi nuôi trồng là: mật độ bèo, thời gian thu hoạch và bổ sung dinh dưỡng

 Sử dụng bèo tấm để sản xuất khí sinh học (biogas)

sử dụng quá trình lên men kỵ khí các chất thải nông nghiệp và chăn nuôi để sản xuấtkhí sinh học đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay Clack đã thấy rằng bổ sung thêmbèo tấm trong giá thể lên men đã làm gia tăng đáng kể lượng khí sinh học tạo ra (hơn44% so với đối chứng) [15] Triscari và cộng sự cho thấy chỉ cần bổ sung 0,5-2,0%bèo tấm thì tổng lượng khí sinh học và methanol gia tăng rất lớn, nhưng nếu bổ sunghơn 2% thì sự gia tăng không còn tiếp tục Nghiên cứu tiếp theo của Huang và cộng sựcũng tiếp tục khẳng định vai trò của bèo tấm trong quá trình lên men tạo biogas Trongnghiên cứu của mình, Cu đã tiến hành đề tài khảo sát sự hình thành biogas từ cácnguồn nguyên liệu phổ biến tại Việt Nam: phân gia súc, chất thải lò mổ, phế phụ phẩm

nông nghiệp… Kết quả nghiên cứu cho thấy, S polyrhiza cho hàm lượng CH4 (340

l/kg) cao hơn so với cỏ (220 l/kg) và rau muống (110,6 l/kg) [16]

 Xử lý nước thải

Thực trạng thiếu hụt nguồn nước sạch sinh hoạt đã và đang trực tiếp ảnh hưởng đếnhơn 1 tỷ người trên toàn thế giới Việc sử dụng một số loài thực vật thủy sinh có khảnăng hấp thụ và chuyển hóa các chất trong nước thải được xem như là liệu pháp sinhhọc có nhiều hứa hẹn để giải quyết vấn đề ô nhiễm nước thải và tái sử dụng nguồnnước này Do có khả năng sinh trưởng trong môi trường nước thiếu oxy và hấp thụ các

chất dinh dưỡng cần thiết như PO43- và NO3- nên bèo tấm được sử dụng có hiệu quảcho việc xử lý nước thải Vì thế, đây là loài thực vật được sử dụng trong các phươngpháp phân tích sinh học để đánh giá chất lượng nước, để xử lý các loại nước thải bịnhiễm kim loại nặng [17].

Việc tích tụ các kim loại nặng là một vấn đề đáng quan tâm trong xử lý nước thải Tất

cả các loài bèo tấm đều có khả năng hấp thụ và tích lũy trong cơ thể một hàm lượng rấtcao các kim loại nặng như Cd, Cr, Pb… Vì thế, chúng có tiềm năng to lớn trong việc

sử dụng để xử lý các nguồn nước thải hoặc các khu vực bị ô nhiễm bởi kim loại nặngnhư công nghệ thuộc da, hầm mỏ… để hạn chế tối đa sự có mặt của các kim loại nàytrong chuỗi thức ăn Theo nhiều công bố thì bèo tấm có khả năng hấp thụ được Cd, N,

Cr, Zn, Sr, Co, Fe, Mn, Cu, Pb, Al và thậm chí là Au [4] Khả năng hấp thụ Fe của L.minor đã mở ra triển vọng cho việc sử dụng bèo tấm để giải quyết hiện tượng nướcnhiễm Fe ở những khu vực mỏ than bỏ hoang [18] Bên cạnh đó, loài này còn có khảnăng hấp thụ Bo [19], As [20], Cd [21], Cu và Si [22] L gibba cũng là loài phù hợp

để sử dụng trong xử lý nước thải sinh hoạt, đồng thời chúng còn có hàm lượng protein

và carbonhydrate cao, phù hợp cho sản xuất nhiên liệu sinh học

Zhao và cộng sự (2015) đã so sánh tiềm năng ứng dụng của 4 dòng bèo tấm thuộc 4chi khác nhau để xử lý nước thải trong các pilot thử nghiệm trong vòng hơn 1 năm.Kết quả nghiên cứu cho thấy, các dòng bèo tấm có những ưu điểm riêng rất khác biệt:

(a) Lemna japonica 0223 và Landoltia punctata 0224 sinh trưởng quanh năm, trong khi S polyrhiza 0225 và Wolffia globosa 0222 lại không sống sót trong điều kiện lạnh; (b) L japonica 0223 có sinh khối khô, hàm lượng protein thô, amino acid tổng số và

phốt pho là cao nhất, khả năng tích lũy N và P tổng số cũng rất cao; (c) Trong điều

kiện nghèo dinh dưỡng thì L punctata 0224 có hàm lượng tinh bột, sinh khối khô và khả năng tích lũy tinh bột là cao nhất; (d) S polyrhiza 0225 và W globosa 0222 có tỷ

lệ và hàm lượng flavonoid tổng số cao Vì thế, dựa trên kết quả của nghiên cứu này, có

thể lựa chọn các dòng bèo tấm phù hợp cho mục đích sản xuất Ví dụ: L.

japonica 0223 là dòng có khả năng xử lý nước thải và sản suất sinh khối tốt nhất, trong

khi L punctata 0224 lại là đối tượng thích hợp để sản xuất tinh bột [23]

 Nguồn thực phẩm cho con người và thức ăn chăn nuôi

Dân số thế giới tăng gần gấp đôi trong giai đoạn 1950-2000 (từ 2,7 đến 6 tỷ người)nhưng nhu cầu về thịt lại tăng gấp 5 lần (từ 45 triệu tấn lên 233 triệu tấn/năm) Tổchức Lương thực và Nông nghiệp Thế giới (FAO) dự đoán rằng khi dân số tăng lên 9

tỷ người thì sản lượng thịt phải đạt 410 triệu tấn/năm [4]

Trong khi đó, nguồn protein từ thịt chỉ mới đáp ứng được 40% nhu cầu về proteinhàng ngày của con người Do vậy, vấn đề đảm bảo nguồn thực phẩm đáp ứng cho nhucầu của con người là một vấn đề vô cùng cấp bách

Vì có hàm lượng N, P, K cũng như một số chất khoáng và protein cao, bèo tấm đượcnuôi trồng để cung cấp nguồn dinh dưỡng quan trọng trong khẩu phần ăn của lợn, cá

và gia cầm Các thử nghiệm cho thấy, bèo tấm có thể được sử dụng thay thế cho đậunành và cá trong khẩu phần ăn của cả gà trống, gà mái và gà con Gà mái sử dụng 40%bèo tấm trong khẩu phần hàng ngày cho trứng nhiều hơn với chất lượng tốt hơn Việcđảm bảo chất lượng nguồn nước trong nuôi trồng bèo tấm cho mục đích làm thức ănchăn nuôi là một yếu tố vô cùng quan trọng Các yếu tố gây độc (Cd, Se, Ni, Pb…) cầnphải kiểm soát để tránh đi vào chuỗi thức ăn và làm ảnh hưởng đến sự phát triển củavật nuôi [19]

Bèo tấm được biết đến như là loài có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất trong nhóm thựcvật có hoa Tuy nhiên điều thú vị là mỗi dòng địa lý trong một loài có thể có tốc độsinh trưởng khác nhau Điều này nhấn mạnh sự cần thiết của việc tìm kiếm và sàng lọccác dòng địa lý thích hợp cho mỗi một ứng dụng công nghiệp của bèo tấm Đã cónhiều nghiên cứu khoa học cơ bản trên bèo tấm được tiến hành như giải trình tự gen,định danh loài, sử dụng sinh học phân tử Một số điểm mốc đáng chú ý của nghiêncứu cơ bản trên bèo tấm được tóm tắt trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Những mốc quan trọng trong nghiên cứu cơ bản trên bèo tấm

1 1986,1987 Landolt vàcs Chuyên khảo vềHọ Bèo tấm

Tổng hợp các nghiên cứu liênquan đến đa dạng sinh học, ditruyền học và đặc điểm thích nghi

của bèo tấm

2 2001 Yamamotovà cs Thiết lập hệ thốngchuyển gen trên

bèo tấm

Cung cấp những hiểu biết cơ bản

về thực hiện các thao tác di truyền

đối với bèo tấm

3 2008 Cabrera và Mối quan hệ phân Khẳng định vị trí phân loại của

Xác định kích thước hệ gen củanhiều dòng địa lý ở các chi thuộc

bèo tấm

5 2014 Wang và cs của S polyrhiza Giải mã bộ gen

Cung cấp các thông tin về hệ

gen S polyrhiza như là loài chuẩn

cho các nghiên cứu bèo tấm

6 2015 Cao và cs

Mô tả các chỉ thịepigenetics trênnhiễm sắc thể củabèo tấm

Bèo tấm có hình thức tổ chức cácvùng hoạt động và không hoạtđộng trên nhiễm sắc thể đặc biệtkhông phụ thuộc kích thước hệ

gen

7 2015 Pastor và cs Canto- Hoàn thiện phươngpháp chuyển gen

vào bèo tấm

Phương pháp chuyển gen nhanh

và hiệu quả thông quaAgrobacterium tumefaciens

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu bèo tấm ở Việt Nam hiện nay

Việc sử dụng bèo tấm làm đối tượng nghiên cứu tại Việt Nam còn chưa thu đượcnhiều sự quan tâm Đa phần các nghiên cứu tập trung vào những ứng dụng bèo tấmtrong sản xuất nông nghiệp Ví dụ, khi sử dụng bèo tấm trong khẩu phần ăn của vịt thịt

và vịt sinh sản thì mức tăng trọng của vịt thịt, tỷ lệ đẻ và tỷ lệ trứng có phôi của vịtsinh sản đều tương đương với vịt được bổ sung bột đậu nành và bột cá [4]

Nghiên cứu sinh học phân tử trên bèo tấm ở Việt Nam phải kể đến các nghiên cứuthuộc đề tài “Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòngchống bệnh cúm ở gia cầm” của PGS.TS Lê Huy Hàm (Viện Di truyền nông nghiệp)

Các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin từ hai loài bèo tấm L aequinoctialis DB1 và S polyrhiza DB2 đã được phân lập [8] Vũ Văn Tiến và cộng

sự đã xây dựng thành công quy trình nuôi cấy callus của L aequinoctialis, đồng thời

khảo sát khả năng sử dụng Agrobacterium để thực hiện chuyển gen vào đối tượng này[24] Một số kết quả có tiềm năng ứng dụng để sản xuất vaccine phòng cúm từ bèo tấmcũng đã được công bố [25]

Các nghiên cứu trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccineuống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, không những góp

phần giảm giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới của việc ứng dụngCNSH thực vật trong nông nghiệp và y học Trong các loài thực vật được nghiên cứu

để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm (Lemnaceae) đangđược đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: có tốc độ nhân vô tính rất nhanh, có hàmlượng các chất dinh dưỡng cao, rất dễ nuôi trồng, không cần các điều kiện đặc biệtnhư: bảo quản lạnh, chế độ vô trùng… Do các đặc điểm trên, việc nghiên cứu sản xuấtvaccine bằng các đối tượng này là hết sức hấp dẫn và hứa henn nhiều triển vọng.Theo “Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng

kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemn sp/Wolffiasp.)”, được thực hiện trên cở sở hợp tác khoa học với Viện Sinh lý phan tử va Côngnghệ sinh học, ĐHTH Bonn (CHLB Đức) là một trong những cố gắng góp phần giảiquyết các vấn đề trên để tiến tới ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền vào việc sảnxuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ chăn nuôi thú y và bảo vệ sức khỏecon người Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu và thu được những kếtquả chính như sau: Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm (Lemnasp.; Wolffia sp.), xây dựng qui trình chuyển gen đạt hiệu quả cao và bèo tấm [26]

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài về bèo tấm

Các nhà khoa học Pháp và Tây Ban Nha mới đây đã tiết lộ rằng họ có khả năng biếnbèo tấm thành protein để giải quyết cuộc khủng hoảng lương thực

Nguồn thức ăn giàu protein thường thiếu hụt, và ngoài ra thường là những thành phầntốn kém nhất trong khẩu phần ăn của hầu hết các loài động vật ở các nước đang pháttriển Bèo tấm là nguồn cung cấp protein có tiềm năng lớn cho thức ăn cho vật nuôi vàđặc biệt là cá [27]

Theo các nhà khoa học, bèo tấm có thể không ngon miệng nhưng nó có tỉ lệ protein rấtcao, thậm chí còn cao hơn tỉ lệ protein có trong đậu nành (45% so với 36%) Vì vậy,trong một hội nghị về công nghệ thực phẩm tại Chicago (Mỹ), các nhà khoa học Pháp

và Tây Ban Nha đã tiết lộ phương pháp làm khô bèo tấm và nghiền nó thành bộtprotein

Kết quả của quá trình chế biến là một loại thực phẩm màu xanh lá cây, được gọi làLentein, trong đó chứa 68% protein cũng như chất xơ Nó có thể dần dần thay thế cácsản phẩm thực phẩm như sữa bột được làm từ sữa và đậu nành Đặc biệt, chúngcòn khiến người dùng yên tâm vì không phải thực phẩm biến đổi gen

Công ty thực phẩm Parabel hiện đang làm việc trên một phiên bản màu trắng của

đất canh tác Nó có thể được trồng hầu như ở bất cứ nơi nào, miễn là có một nguồnnước Bèo tấm có thể tăng gấp đôi kích thước trong vòng 16 đến 32 giờ và có thể thuhoạch hàng ngày Nó cũng có ưu điểm là sử dụng ít nước hơn so với bất kỳ loại câytrồng nào.

Protein bèo tấm là một nguồn cung cấp lysine tốt Ở nhiều nước, ngô và gạo là nhữngthực phẩm chính được tiêu thụ Những loại thực phẩm này thiếu lysine, chỉ chứa 0,2-0,3% axit amin trên phần trăm chất khô (FAO, 1954; NASNRC,1958), trong khi trongprotein bèo tấm chứa 1,6-2,0% Rõ ràng là protein bèo tấm có tiềm năng để bổ sungvào ngũ cốc–nguồn tiêu của thụ động vật và con người [28]

Một trong những loài bèo tấm nhỏ nhất (Wolffia arrhiza) đã được người Miến Điện,

Loatians và người dân miền Bắc Thái Lan sử dụng làm thực phẩm bổ dưỡng Từnhững năm 1970, bèo tấm đã thu hút được sự chú ý đáng kể đối với hàm lượng proteincao, tích tụ sinh khối nhanh so với thực vật trên mặt đất, và khả năng hấp thu chất dinhdưỡng và các hóa chất khác [29]

Ban chỉ đạo quốc tế về nghiên cứu và ứng dụng bèo tấm (ISCDRA) được thành lậpvào tháng 8 năm Được thành lập với mục tiêu qui định đăng kí quốc tế, tổ chức và hỗtrợ hội thảo nghiên cứu và ứng dụng bèo tấm, tăng cường kết nối các nghiên cứu giữabèo và cộng đồng ứng dụng, giáo dục và nâng cao nhận thức của công chúng về tầmquan trọng của bèo tấm

1.1.7 Giới thiệu về protein

Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là cácaxit amin Hiện đã biết có hơn 21 loại axit amin Trong axit amin có chứa cacbon,hydro, oxy và nitơ, các axit amin khác nhau có thể qua các hình thức tổ hợp khác nhaucấu tạo nên những protein khác nhau

Thành phần hóa học: Về thành phần cấu trúc, protein được tạo thành chủ yếu từ cácamino acid qua liên kết peptide Thông thường trong cấu trúc của protein gồm bốnnguyên tố chính với tỷ lệ như sau Cacbon (C) 50%, Hydro (H) 7%, Oxy (O) 23% và(Nitơ) N 16% Đặc biệt tỷ lệ Nitơ trong protein khá ổn định Nhờ tính chất này người

ta có thể định lượng protein Ngoài ra trong protein còn gặp một số nguyên tố khácnhư S, P, Fe, Zn, Cu…

 Phân loại protein:

Protein gồm hàng trăm, hàng ngàn amino acid nối với nhau bằng liên kết peptide tạonên một hay nhiều chuỗi polypeptide có cấu trúc rất phức tạp Căn cứ sự có mặt hay

vắng mặt của một số thành phần có bản chất không phải protein mà người ta chiaprotein thành hai nhóm lớn:

Protein đơn giản: Là những phân tử mà thành phần cấu tạo của nó gồm hoàn toànamino acid Dựa theo khả năng hoà tan trong nước hoặc trong dung dịch đệm muối,kiềm hoặc dung môi hữu cơ người ta có thể chia các protein đơn giản ra một số nhómnhỏ như: albumin, globulin, prolamin, glutein và histon

Protein phức tạp: Protein phức tạp là những protein mà thành phần phân tử của nóngoài các amino acid còn có thêm thành phần khác có bản chất không phải là proteincòn gọi là nhóm ngoại Tuỳ thuộc vào bản chất của nhóm ngoại, người ta chia cácprotein phức tạp ra các nhóm nhỏ và thường gọi tên các protein đó theo bản chất nhómngoại:

Lipoprotein: nhóm ngoại là lipid

Nucleoprotein: nhóm ngoại là acid nucleic

Glycoprotein: nhóm ngoại là carbohydrate và dẫn xuất của nó

Phosphoprotein: nhóm ngoại là acid phosphoric

Cromoprotein: nhóm ngoại là hợp chất có màu Tuỳ theo tính chất của từng nhómngoại mà có những màu sắc khác nhau như đỏ (ở hemoglobin), vàng (ở flavoprotein)

…

 Vai trò của protein đối với cơ thể sinh vật sống:

Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống, nó thamgia mọi hoạt động sống trong cơ thể sinh vật Protein hình thành, duy trì và thay thếcác tế bào trong cơ thể Protein chiếm tới trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vậtliệu cấu trúc của tế bào Thiếu protein dẫn đến suy dinh dưỡng, chậm lớn, suy giảmmiễn dịch, ảnh hưởng xấu đến chức năng của các cơ quan trong cơ thể Protein thamgia vào thành phần cơ bắp, máu, bạch huyết, hocmôn, men, kháng thể, các tuyến bàitiết và nội tiết Vì vậy, protein có liên quan đến mọi chức năng sống của cơ thể (tuầnhoàn, hô hấp, sinh dục, tiêu hóa, bài tiết hoạt động thần kinh và tinh thần,…)

Ngoài ra, protein cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác, đặcbiệt là các vitamin và chất khoáng Khi thiếu protein, nhiều vitamin không phát huyđầy đủ chức năng của chúng mặc dù không thiếu về số lượng

Protein còn là nguồn năng lượng cho cơ thể và kích thích sự thèm ăn và vì thế nó giữvai trò chính tiếp nhận các chế độ ăn khác nhau Thiếu protein gây ra các rối loạn quan

trọng trong cơ thể như ngừng lớn hoặc chậm phát triển, mỡ hóa gan, rối loạn hoạtđộng nhiều tuyến nội tiết (giáp trạng, sinh dục), thay đổi thành phần protein máu, giảmkhả năng miễn dịch sinh học của cơ thể và tăng tính cảm thụ của cơ thể với các bệnhnhiễm khuẩn.

1.1.8 Protein trong bèo tấm

Theo như công ty Parabel đã nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của bèo và các sảnphẩm có nguồn gốc từ cây thủy sinh, kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượngtrọng lượng khô 6 loài dao động từ 4 đến 8%, protein dao động từ 20 đến 35% (dw).Một báo cáo khác của Damry và cộng sự (2001) trên bèo tấm chỉ ra rằng lượng proteinthô dao động từ 15-45%, tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng và nhấn mạnh rằng

protein thường bao gồm một hồ sơ axit amin đáng chú ý [10].

Bảng 1.3 Thành phần acid amine của bèo tấm (g/100g)

Protein isolate (PI): là sản phẩm protein đã qua tinh chế PI cũng được sản xuất từnguồn nguyên liệu giàu protein, sản phẩm chứa tối thiểu từ 90% protein trở lên.

Các nghiên cứu ứng dụng của protein concentrate/isolate:

Ứng dụng protein concentrate từ hạt cải dầu vào xúc xích để cải thiện hương vị, kếtcấu tốt và hương vị đặc trưng [30]

Việc sử dụng các protein concentrates từ lá cỏ linh lăng như một nguồn protein trong

khẩu phần ăn cho cá rô phi (Oreochromis mossambicus) [31]

Ứng dụng protein isolate, protein concentrate từ đậu phộng (arachis hypogaea linn) có

thể được dùng để thay thế protein đậu nành trong quy trình sản xuất xúc xích để tạo racấu trúc đặc trưng cho sản phẩm [32]

1.3 Các phương pháp thu nhận kết tủa protein

Có 5 phương pháp xử lý dịch trích thường được sử dụng để kết tủa protein: tủa bằngmuối, tủa bằng dung môi hữu cơ, tủa bằng điểm đẳng điện, tủa bằng polymer khôngmang điện và tủa bằng các chất đa điện phân

Kết tủa protein là sự tập hợp thành những phân tử protein đủ lớn, có thể nhìn thấy vàthu nhận được bằng ly tâm Sự phân bố các phần kị nước và ưa nước trên bề mặtprotein quyết định đến tính tan của protein Tính tan của protein là kết quả của sựtương tác các cực với dung môi Tương tác ion với muối và tương tác lực đẩy tĩnh điệnvới những phân tử tích điện cùng dấu Tính chất của dung dịch có thể thay đổi nồng độion hay pH Việc thêm hỗn hợp dung môi hay các chất tan trơ và polymer cùng vớiđiều chỉnh nhiệt độ có thể điều khiển được sự thu nhận các protein mục tiêu [33].Khi protein tập hợp lại thành cấu trúc lớn hơn, lượng nước xung quanh protein giảm,làm tăng sự khác nhau về mật độ của protein và dung dịch Khi sự tập hợp này đủ lớn,chúng sẽ nhanh chóng hình thành kết tủa trong quá trình ly tâm [34]

Kết tủa là một trong những phương pháp tách và phân đoạn protein cổ điển nhất nhữngvẫn được sử dụng rộng rãi cho đến ngày nay Có nhiều phương pháp tủa protein khác

nhau nhưng về cơ bản là thông qua quá trình biến đổi tính chất có hệ thống như nhiệt

độ, lực ion, độ pH, các đặc tính điện môi để tủa protein Phương pháp tủa protein cũngđược sử dụng trong công nghiệp mặc dù có một số hạn chế liên quan đến thiết bị vàquy trình công nghệ Tuy nhiên, ngay cả trong điều kiện tốt nhất vẫn không tránh khỏi

sự tủa của hỗn hợp protein kèm theo các tạp chất khác Do vậy, để thu được proteintinh sạch thì sau khi tủa, việc chiết tách và tinh sạch protein vẫn phải tiếp tục nhờ các

kỹ thuật đặc hiệu hơn

Phương pháp này được ứng dụng khá phổ biến trong phòng thí nghiệm và công nghiệp

để bước đầu thu nhận các hợp chất có giá trị trong tảo biển như thu nhận enzymeprotease [35], thu nhận lectin từ tảo biển [36] [37], thu nhận protein R-phycoerythrin

từ tảo đỏ [12] thu nhận R-phycoerythrin từ tảo Spirulina… [38] [3].

1.3.1 Kết tủa bằng muối trung tính

Bản chất của quá trình là tạo tủa protein nhờ bổ sung vào dịch protein muối trung hòa

ở nồng độ cao Vì protein tồn tại trong dịch nhờ sự cân bằng giữa các tương tác tĩnhđiện và kị nước nên khi bổ sung muối vào sẽ làm thay đổi cân bằng trên dẫn đến sự tạothành tập hợp các phân tử protein và lắng xuống Bình thường các phân tử proteintrong dung dịch đều ngậm nước, khối lượng ngậm nước có thể lớn hơn khối lượng củabản thân nó nhiều lần, do vậy sẽ che chắn một cách hữu hiệu các phần tử kỵ nước trên

bề mặt protein và cản trở các phân tử protein tương tác với nhau Khi xuất hiện nồng

độ ion muối cao, lượng nước ngậm bị giảm đi dẫn đến sự tủa protein

Kết tủa protein bằng muối amonisulfate được phát hiện cách đây hơn 120 năm bởiFranz Hofmeister khi ông để ý rằng nếu thêm các muối khác nhau vào lòng trắng trứngthì thấy có sự hình thành kết tủa Có thể thêm muối amonisulfate vào dung dịch bằngcách thêm muối trực tiếp vào dung dịch protein hoặc là dung dịch muối bão hòa [19]

Để tủa protein người ta sử dụng một số muối khác nhau, khả năng kết tủa của cácanion theo chuỗi Hofmeister với những anion phổ biến theo thứ tự là SCN‾, ClO4‾,NO3‾, Br‾, Cl‾, CH3COO‾, SO4‾, PO4 ‾ Nhưng thông dụng hơn cả là muối sulfate,citrate, phosphate và chloride Theo thứ tự muối phosphate tủa tốt hơn muối sulfatenhưng trong thực tế ở giá trị pH trung tính, khi muối phosphate phần lớn ở dạng hỗnhợp HPO42- và H2PO4-, thì khả năng tạo tủa của chúng lại yếu hơn Tác dụng tủaprotein của ion hóa trị I được sắp xếp theo thứ tự NH4+, K+, Na+ Các loại muối có thểdùng để tủa protein là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4… Người ta nhận thấy muối(NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà còn làm ổn định hầu hết các loại protein.Loại muối này lại rẻ và phổ biến [34]

Ahyar Ahmad và cộng sự sử dụng muối amonisulfate để nghiên cứu thu nhận và xác

định tính chất chức năng của các protein có hoạt tính sinh học từ tảo lục Halimeda macrobola Tiến hành kết tủa protein ở các phân đoạn 0-20%, 20-40%, 40-60% và 60-

80%, sau đó tiến hành thẩm tích loại muối còn lẫn với protein Hoạt tính kháng oxyhóa của protein trong phân đoạn 0-20% với giá trị IC50 là 0,110mg/mL yếu hơn so vớiphân đoạn 20-40%, 40-60% và 60-80% với kết quả 0,360mg/mL, 0,323mg/mL,0,387mg/mL Như vậy phân đoạn muối 60-80% độ bão hòa kết tủa được hiệu quả nhấtprotein có hoạt tính sinh học trên đối tượng đang nghiên cứu [39]

Khi lựa chọn muối để tủa protein phải tính đến giá trị pH để tủa phân đoạn protein Ví

dụ, natri citrate thường được sử dụng ở pH cao hơn 8 trong khi muối amoni lại được

sử dụng ở pH thấp hơn Trong thực tiễn phòng thí nghiệm, muối (NH4)2SO4 được sửdụng nhiều nhất vì nó hòa tan tốt và không đắt tiền Tuy vậy, việc sử dụng muối này ởquy mô sản xuất lớn lại bị hạn chế vì phế thải và protein lẫn tạp nhiều muối Trongphòng thí nghiệm thường phải tiến hành lọc gel hay thẩm tích để tách muối ra khỏiprotein Nồng độ (NH4)2SO4 thường sử dụng nằm trong khoảng 40-80% độ bão hòa[34]

Thu nhận enzyme Phosphoenolpyruvate Carboxylase từ rong lục Selenastrum minutum, enzyme Tryptophan synthase từ sinh khối tảo Euglena gracilis [24] trải qua

công đoạn kết tủa bằng muối amonisulfate trước khi lọc gel [41] [42] Shilpak DilipBele và cộng sự sử dụng tủa muối trước khi lọc gel thu nhận lipase và protease từ rongbiển [14] Stélio R.M Oliveria và cộng sự cũng sử dụng muối (NH4)2SO4 80% độ bãohòa để kết tủa lectin trước khi tinh sạch bằng sắc kí ái lực [43]

Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính enzyme bromelain của chồi ngọn khóm thu hồikhi kết tủa bằng muối amonisulfate 80% bão hòa ở nhiệt độ 270C [44] Đối với trích lyenzyme protease từ thịt đầu tôm, hiệu suất kết tủa bằng amonisulfate ở phân đoạn 55-65% cho hiệu quả tốt nhất [45]

1.3.2 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Kết tủa bằng dung môi hữu cơ có mặt trong nhiều quy trình sản xuất Muốn tủa cóhiệu quả dung môi phải hoàn toàn được trộn đều với nước và phải có tính ưa nước đểtránh làm biến tính protein Tác động cơ bản của việc bổ sung dung môi hữu cơ là làmgiảm khả năng hòa tan của nước bao quanh protein do tác động đẩy ra một khối lượngnước lớn và sự cố định một phần phân tử nước bởi quá trình hydrate hóa các phân tửdung môi hữu cơ Phân tử nước bình thường sắp xếp một cách trật tự xung quanh cácđoạn kỵ nước trên bề mặt protein sẽ được thay thế bằng các phân tử dung môi hữu cơ

làm giảm độ hoàn tan của chúng Các protein kỵ nước mạnh có khả năng tan hoàn toàntrong dung môi hữu cơ Ở điều kiện tạo tủa giống nhau, phân tử protein càng lớn thìcàng dễ tủa Nên lưu ý là dung môi hữu cơ có khả năng làm biến tính protein ngay cả ởnhiệt độ thường Do vậy, quá trình tủa protein bằng dung môi hữu cơ phải được thựchiện ở nhiệt độ thấp 0-50C và chọn lựa dung môi thích hợp [34]

Các dung môi tan trong nước như methanol, ethanol, n-butanol đã được nghiên cứu đểkết tủa whey protein và sấy khô để thu protein concentrate Ethanol là dung môi antoàn hơn hai dung môi còn lại Methanol và n-propanol cho whey protein concentrate

ít tan hơn so với protein concentrate kết tủa từ ethanol trong khi n-butanol cho wheyprotein concentrate chứa nhiều béo và lactose nên gần như không tan trong nước Ethanol 72% kết tủa được 45-60% whey protein và hàm lượng tăng lên 4 lần Nồng độethanol trên 60% được sử dụng để kết tủa lysozyme lòng trắng trứng, khả năng hòa tancủa lysozyme giảm với sự tăng của nồng độ ethanol, mặc dù sự tạo gel ở nồng độ từ60-75% làm hạn chế việc xác định tính tan [46] [47] Bromelin trong dứa được thunhận khi kết tủa bằng cồn 30-70% đạt độ tinh sạch 2,07 lần nhưng bảo toàn được 98%hoạt tính của enzyme trong khi muối amonisulfate ở phân đoạn 20-40% độ bão hòa cóhiệu suất đạt đến 44% và độ tinh sạch tăng 4,4 lần Tuy nhiên phương pháp cồn lạiđược sử dụng phổ biến ở Brazil, nơi sản xuất cồn lớn nhất thế giới [35]

Thu nhận chế phẩm protease từ quả vả khi kết tủa bằng ethanol 96% tỉ lệ 1/4, thời gian

60 phút và ở 30C thu được hàm lượng protein và hoạt tính protease là cao nhất [48].Kết quá nghiên cứu cho thấy, dung môi ethanol tỉ lệ 1/4 với thịt đầu tôm sú, 45 phútcho hiệu suất thu hồi 87,46 % Dung môi acetone tỉ lệ 1/3 đối với thịt đầu tôm sú vớihiệu suất 64,60% [45]

Phương pháp kết hợp TCA/aceton được ứng dụng để thu nhận proteomics từ tảo đỏ

Gracilaria changii [15] và tảo Alexandrium sp [49] cho kết quả tốt.

1.3.3 Kết tủa protein tại điểm đẳng điện

Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi Ở pH thấp,protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton) Ở giá trị pHcao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton(mất H+) Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện.Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác vớimôi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường [50]

Điểm đẳng điện xuất hiện khi tổng điện tích của protein bằng 0, lực tương tác tĩnh điệnthấp nhất là nguyên nhân dẫn đến các phân tử tập hợp lại với nhau [18] Ở điểm đẳngđiện, độ hydrate hóa của protein là cực tiểu làm tăng tương tác giữa các phân tửprotein dẫn đến tạo tủa Khó khăn của phương pháp này là do protein chỉ có giá trị pHđẳng điện giới hạn Vì điểm đẳng điện của dịch trích thô bao gồm của rất nhiều proteinkhác nhau, có thể có cả phức hợp protein và acid nucleic [33] Phương pháp này đạthiệu quả không cao nhưng thường áp dụng kết hợp với các phương pháp khác [34].

Hình 1.5 Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH

Sử dụng kết tủa tại điểm đẳng điện với pH= 4,3-5,7 sau khi trích ly protein từ hạt

Amaranthus Cruentus ở pH= 7,8-9,2 cho protein có hàm lượng cao (protein isolate) và

những tính chất hóa lý tốt [51] Protein isolate từ hạt cải dầu cũng được thu nhận đượcbằng phương pháp trích ly ngược và kết tủa tại điểm đẳng điện [52]

Umar Garba và Sawinder Kaur đã kết tủa protein ở điểm đẳng điện để thu nhận protein

từ đậu nành và cho thấy pH= 4,2 cho lượng kết tủa lớn nhất [50], sau đó mới tiến hànhlọc membrane để nâng cao độ tinh sạch của protein Cách làm tương tự cũng được tiến

hành trên đối tượng là vi tảo Chlorella vulgaris [53] Hay phycobiliprotein từ tảo Porphyra yezoensis kết hợp tủa ở điểm đẳng điện với amonisulfate [54].

Nhóm tác giả Nguyễn Minh Trí đã khẳng định rằng kết tủa enzyme protease bằng pH=4,25 cho hiệu suất thu hồi cao nhất [32]

1.3.4 Kết tủa bằng các loại polymer và bằng chất đa điện phân

Các polymer sử dụng trong kết tủa protein bao gồm: polyacrylic, polysaccharide,polyphosphate Ưu điểm của phương pháp là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, dễthu hồi polymer, hiệu suất kết tủa cao Chi phí cho phương pháp này cao