Luận án phát hiện người mang đột biến gen atp7b trong các thành viên gia đình bệnh nhân wilson

Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson .... Trong khi xét nghiệm di truyền dựa trên phát hiện đột biến gen ATP7B không những là phương pháp duy n

Lời cảm ơn

Nghiên cứu được thực hiện dưới sự hỗ trợ, giúp đỡ của rất nhiều người Tôi xin được trân trọng cảm ơn và luôn luôn ghi nhớ!

Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi đến toàn bộ bệnh nhân Wilson và gia đình

họ Nếu không có sự hợp tác nhiệt tình của họ, tôi đã không thể hoàn thành được nghiên cứu này

Tôi xin trân trọng cảm ơn hai người thầy: GS.TS Tạ Thành Văn, Trường Đại học Y Hà Nội và GS.TS Phan Văn Chi, Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong thời gian qua

Tôi vô cùng biết ơn PGS.TS Trần Vân Khánh, Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý tận tình cho tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương và các anh, chị đồng nghiệp, đặc biệt là TS.BS Nguyễn Phạm Anh Hoa, Trưởng Khoa Gan-Mật đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu Tôi thực sự xúc động và tự hào bởi sự hỗ trợ nhiệt tình, sự động viên, chia sẻ của lãnh đạo và các đồng nghiệp tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, nơi tôi đang công tác, để tôi hoàn thành nhiệm vụ và nghiên cứu của tôi!

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô và các anh, chị tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi trong những chặng đường đã qua

Bố, mẹ đã mang tôi đến với cuộc sống, luôn dõi theo, cổ vũ và hỗ trợ! Tôi xin dành tặng kết quả nhỏ bé này tới bố mẹ tôi! Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự chia sẻ, giúp đỡ của các em tôi, của những người bạn dành cho tôi Họ là động lực để tôi luôn luôn cố gắng không ngừng

Chồng và các con của tôi là những người thân yêu nhất ở bên cạnh tôi, luôn động viên và yêu thương vô bờ bến! Đặc biệt, tôi muốn được chia sẻ niềm vui này với một thiên thần nhỏ trong gia đình tôi, con là lý do để tôi sống tốt hơn mỗi ngày

Vì con, tôi nguyện cố gắng để làm được những điều có ý nghĩa với gia đình, với cuộc sống và đặc biệt là với bệnh nhân của tôi

Nguyễn Thị Mai Hương

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả phối hợp với một số đồng nghiệp khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Hà Nội, ngày 29 tháng 06 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Mai Hương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson 3

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 6

1.2 Dịch tễ học và phân loại bệnh Wilson 8

1.2.1 Dịch tễ học 8

1.2.2 Phân loại bệnh 9

1.3 Cơ sở di truyền phân tử bệnh Wilson 9

1.3.1 Vị trí, cấu trúc phân tử gen ATP7B 9

1.3.2 Cấu trúc và chức năng protein ATP7B 9

1.3.3 Đặc điểm đột biến gen ATP7B 11

1.4 Cơ chế bệnh sinh bệnh Wilson 14

1.5 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán, điều trị bệnh Wilson 18

1.5.1 Đặc điểm lâm sàng 18

1.5.2 Đặc điểm cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán và điều trị bệnh Wilson

23 1.6 Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 26

1.6.1 Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến 26

1.6.2 Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 27

1.7 Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong chẩn đoán xác định bệnh Wilson 28

biến gen ATP7B

1.7.3 Phương pháp phân tích đột biến mới 31

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.1 Nhóm bệnh nhân và các thành viên trong gia đình 33

2.1.2 Nhóm chẩn đoán trước sinh 33

2.1.3 Tiêu chuẩn lựa chọn 33

2.1.4 Tiêu chuẩn loại trừ 35

2.2 Hóa chất và thiết bị 36

2.2.1 Hóa chất 36

2.2.2 Thiết bị và các loại tiêu hao 38

2.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 38

2.3.2 Xây dựng phả hệ và thu thập mẫu 38

2.3.3 Phương pháp sử dụng trong phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhân Wilson và các thành viên trong gia đình

42 2.3.4 Phương pháp sử dụng trong chẩn đoán trước sinh cho thai nhi 47

2.4 Đạo đức nghiên cứu 49

2.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 49

2.6 Sơ đồ nghiên cứu 49

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51

3.1 Kết quả xác định đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân Wilson 51

bệnh nhên Wilson

3.2 Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 88

3.2.1 Kết quả tách DNA tổng số từ dòng tế bào ối và PCR 88

3.2.2 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 89

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 93

4.1 Phát hiện đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân Wilson

96 4.1.1 Đặc điểm đột biến gen ATP7B của 78 bệnh nhân Wilson 96

4.1.2 Ý nghĩa của sàng lọc đột biến cho các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson 109

4.2 Ý nghĩa của chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 119

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 122

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 124

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 125

TÀI LIỆU THAM KHẢO 131

PHỤ LỤC 1

Phụ lục 1 Danh sách bệnh nhân, kết quả tách DNA tổng sổ và phân tích đột biến gen của 78 bệnh nhân và các thành viên trong 55 phả hệ 1

Phụ lục 2 Danh sách và kiểu gen của 78 bệnh nhân Wilson 16

Phụ lục 3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 21 exon của gen ATP7B 21

Phụ lục 4 Trình tự đột biến gen của bệnh nhân có đột biến mới IVS20+4A>G 22

Phụ lục 5 Bảng mã di truyền và viết tắt các acid amin 23

Phụ lục 7 Kết quả sàng lọc đột biến đích cho các thành viên trong gia

đình bệnh nhân mã số WBW120501 30 Phụ lục 8 Kết quả tách DNA của 3 mẫu dịch ối sau nuôi cấy 32

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ARMS Amplification refractory mutation

system

Hệ thống đột biến chịu nhiệt nhân bản

ATOX1 Antioxidant protein 1

ATP Adenosine triphosphate

ATP7A ATPase copper transporting alpha ATP vận chuyển đồng,

chuỗi alpha ATP7B ATPase copper transporting beta ATP vận chuyển đồng,

chuỗi beta

CTR1 Copper transporter Chất vận chuyển đồng

MM/MM Missense mutation/ Missense

mutation

Đột biến sai nghĩa/Đột biến sai nghĩa

MRI Magnetic resonance imaging Chụp cộng hưởng từ

RNA Ribonucleic acid

NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

RFLP Restricted fragment length

SM/MM Servere mutation/Missense

mutation

Đột biến nghiêm trọng/Đột biên sai nghĩa

SNPs Single nucleotide polymorphisms Đa hình nucleotid đơn

TGE Thr-Gly-Glu

TGEA Thr-Gly-Glu-Ala

UTR Untranslated region Vùng không dịch mã

WMM Weight Matrix Model Mô hình ma trận trọng lượng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng điểm Leipzig 2001 trong chẩn đoán bệnh Wilson 34

Bảng 2.2 Các cặp mồi dùng trong PCR và giải trình tự gen ATP7B 37

Bảng 2.3 Thành phần PCR 43

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng giải trình tự gen 43

Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân theo giới và độ tuổi phát bệnh trung bình 52

Bảng 3.2 Phân bố bệnh nhân theo địa phương 52

Bảng 3.3 Kiểu gen của 78 bệnh nhân Wilson 53

Bảng 3.4 Tỷ lệ các đột biến gen ATP7B trong nghiên cứu 55

Bảng 3.5 Các đa hình trên gen ATP7B được phát hiện trong nghiên cứu 64

Bảng 3.6 Tỷ lệ phát hiện đột biến trên các vùng gen ATP7B 64

Bảng 3.7 Kết quả phân tích đột biến mới bằng chương trình tin sinh 69

Bảng 3.8 Kiểu gen, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 7 bệnh nhân Wilson có đột biến mới 70

Bảng 3.9 Kết quả phân tích đột biến vùng cắt, nối của gen ATP7B 72

Bảng 3.10 Kết quả sàng lọc đột biến gen ATP7B cho các thành viên của 55 phả hệ 74

Bảng 3.11 Tỷ lệ người mang gen bệnh ở bố, mẹ của bệnh nhân Wilson 75

Bảng 3.12 Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson 75

Bảng 3.13 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 13 trường hợp bị Wilson được phát hiện qua sàng lọc gia đình 76

Bảng 3.14 Đặc điểm cận lâm sàng, kiểu gen và điểm chẩn đoán của 5 trường hợp mắc Wilson chưa có biểu hiện lâm sàng 83

Bảng 3.15 Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm họ hàng của bệnh nhân 86

Bảng 3.16 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 89

Bảng 4.1 Đột biến thường gặp trên gen ATP7B trong nghiên cứu và một số nước châu Á 103

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Gen ATP7B và protein ATP7B-ATPase tương ứng ở người 10

Hình 1.2 Quá trình chuyển hóa đồng trong gan 17

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 50

Hình 3.1 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160802 57

Hình 3.2 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW100604 58

Hình 3.3 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160609 59

Hình 3.4 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW170704 60

Hình 3.5 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160507 61

Hình 3.6 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160507 62

Hình 3.7 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW140801 63

Hình 3.8 Biểu đồ tỷ lệ phát hiện đột biến trên các vùng gen ATP7 65

Hình 3.9 Vị trí và tỷ lệ các đột biến gen ATP7B trong nghiên cứu 66

Hình 3.10 Sơ đồ các bước phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhi mắc bệnh Wilson 68

Hình 3.11 Kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình SIFT 71

Hình 3.12 Kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình Polyphen-2 và MutationTaster 71

Hình 3.13 Kết quả phân tích đột biến IVS20+4A>G bằng phần mềm BDGP

73 Hình 3.14 Phả hệ của gia đình bệnh nhân WBW160101 và WBW160602 78

Hình 3.15 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW160101 79

Hình 3.16 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW160602 80

Hình 3.17 Phả hệ của gia đình bệnh nhân mã số WBW160904 81

Hình 3.18 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW160904 82

Hình 3.19 Phả hệ của gia đình bệnh nhân mã số WBW100901 84

Hình 3.20 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW100901 85

Hình 3.21 Phả hệ của gia đình bệnh nhân mã số WBW120501 86

Hình 3.22 Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW120501 87

Hình 3.23 Điện di sản phẩm PCR của 3 mẫu chẩn đoán trước sinh 88

Hình 3.24 Phả hệ gia đình thai phụ mã số AFW151105 90

Hình 3.25 Trình tự gen của gia đình thai phụ mã số AFW151105 91

Hình 3.26 Phả hệ gia đình thai phụ mã số AFW150804 92

Hình 3.27 Trình tự gen của gia đình thai phụ mã số AFW150804 93

Hình 3.28 Phả hệ gia đình thai phụ mã số AFW160501 94

Hình 3.29 Trình tự gen của gia đình thai phụ mã số AFW160501 95

Hình 4.1 Biểu đồ các exon của gen ATP7B có tỷ lệ phát hiện đột biến cao trong nghiên cứu và các nghiên cứu khác 106

1 MỞ ĐẦU

Bệnh Wilson là một bệnh di truyền lặn hiếm gặp trên thế giới với tỷ lệ mắc từ

1/5000 đến 1/30000 trẻ đẻ sống do đột biến gen ATP7B Gen ATP7B mã hóa protein

ATPase, có chức năng vận chuyển đồng từ gan để bài tiết ra ngoài thông qua mật Rối loạn chức năng protein ATPase là nguyên nhân dẫn đến đồng tích lũy phần lớn tại gan và một số cơ quan khác chẳng hạn như não, thận và do đó gây ra các bệnh liên quan đến gan, tâm thần và thần kinh

Wilson là bệnh có biểu hiện lâm sàng vô cùng phong phú và phát bệnh ở nhiều

độ tuổi khác nhau Trên thực tế, bệnh nhân Wilson ở Việt Nam thường được chẩn đoán ở giai đoạn muộn do bệnh nhân không có điều kiện khám, chữa bệnh hoặc do không được thăm khám đúng chuyên khoa vì kiểu hình của bệnh rất đa dạng Nếu bệnh nhân Wilson không được chẩn đoán và điều trị sớm, đồng dư thừa sẽ tích lũy trong các mô của cơ thể, làm tổn thương nghiêm trọng các cơ quan này và có thể tử vong do suy gan cấp và suy gan tối cấp Bởi vậy chẩn đoán xác định bệnh Wilson

có ý nghĩa quan trọng trong thực hành lâm sàng và tiên lượng bệnh

Bệnh Wilson có thể được chẩn đoán theo thang điểm Leipzig nhưng khi đó bệnh nhân đã có nhiều triệu chứng khiến cho việc điều trị bệnh tốn kém và gặp nhiều khó khăn Trong khi xét nghiệm di truyền dựa trên phát hiện đột biến gen

ATP7B không những là phương pháp duy nhất được sử dụng trong chẩn đoán xác

định bệnh ở bất kì giai đoạn nào của bệnh mà còn là xét nghiệm được dùng để chẩn đoán phân biệt bệnh Wilson với nhiều bệnh lý khác liên quan đến gan và thần kinh chưa rõ nguyên nhân Đặc biệt, người mắc bệnh Wilson chưa có biểu hiện lâm sàng chỉ có thể được phát hiện sớm bằng xét nghiệm di truyền Khi được chẩn đoán sớm, bệnh nhân sẽ được điều trị sớm, tiết kiệm chi phí chữa bệnh, tránh các biểu hiện và biến chứng nguy hiểm

Một trong những nghĩa quan trọng khác của phân tích đột biến gen ATP7B là

vai trò của nó trong phát hiện người mang gen bệnh Wilson Nếu bệnh nhân Wilson

có thể được chẩn đoán theo thang điểm Leipzig thì người mang gen bệnh không thể

phát hiện được bởi họ hầu như không có biểu hiện lâm sàng và bất thường trên xét nghiệm sinh hóa Vì vậy, xét nghiệm di truyền là phương pháp duy nhất để xác định

người mang gen bệnh, đặc biệt trong các trường hợp sàng lọc đột biến gen ATP7B

cho người hiến tạng trước khi ghép gan cho bệnh nhân Wilson thể suy gan tối cấp bởi người hiến tạng phù hợp phải là người không bị bệnh hoặc không mang gen bệnh Wilson Hơn thế nữa, phát hiện người mang gen bệnh còn là cơ sở của tư vấn

di truyền tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh

và nâng cao chất lượng cuộc sống của người bệnh và gia đình

Cho đến nay, một số nghiên cứu về đột biến gen ATP7B ở Việt Nam đã được thực hiện trên qui mô nhỏ nên chưa đại diện cho đặc điểm đột biến gen ATP7B ở

người Việt Nam, cũng như chưa xác định được tần suất các loại đột biến gen Việc

phát hiện đột biến cho bệnh nhân Wilson cần thực hiện trên toàn bộ gen ATP7B

khiến cho chi phí xét nghiệm rất tốn kém và cần nhiều thời gian, có thể ảnh hưởng

đến điều trị bệnh Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Phát hiện người mang đột

biến gen ATP7B trong các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson” được thực

hiện nhằm phát hiện đột biến thường gặp và vùng thường xảy ra đột biến của gen

ATP7B ở Việt Nam để từ đó xây dựng quy trình phát hiện đột biến cho bệnh nhân

Wilson, đồng thời phát hiện sớm người bệnh chưa có biểu hiện lâm sàng và người mang gen bệnh để làm cơ sở tư vấn di truyền, điều trị, tiên lượng bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson Xét nghiệm di truyền đã mở ra một bước tiếp cận mới trong chẩn đoán và điều trị bệnh Wilson nói riêng và các bệnh di truyền nói chung ở Việt Nam Chẩn đoán và điều trị sớm không chỉ giúp các bệnh nhân Wilson cải thiện chất lượng sống, hòa nhập tốt với cộng đồng, giảm chi phí điều trị mà còn giúp tư vấn di truyền cho người bệnh và gia đình họ Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu sau:

1 Phát hiện người mang đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia

đình có tiền sử mắc bệnh Wilson

2 Bước đầu chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có tiền sử sinh con mắc bệnh Wilson

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bệnh Wilson là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường (NST) thường do đồng lắng đọng ở các mô trong cơ thể, nhiều nhất ở gan và não Biểu hiện lâm sàng của bệnh chủ yếu liên quan đến bệnh gan, thần kinh, tâm thần (Ferenci và cs, 2012) Năm 1850, Wilson lần đầu tiên được báo cáo là một hội chứng mang đặc điểm lâm sàng có tính chất di truyền hay bệnh thoái gan (Aoki, 2004).Năm 1912, bệnh Wilson được nhà thần kinh học người Anh, Samuel Alexander Kinnier Wilson (1878-1937) mô tả là bệnh “thoái hóa tiến triển hình hạt đậu”, mang tính chất gia đình, có thể tử vong do bệnh thần kinh kèm theo các bệnh về gan mạn tính dẫn tới

xơ gan Nghiên cứu mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng được thực hiện trên bệnh nhân Wilson đã cho thấy mối liên quan giữa các bất thường trên xét nghiệm sinh hóa và di truyền (Das và cs, 2006)

Năm 1993, gen ATP7B gây bệnh Wilson đã được tách dòng thành công Gen ATP7B là một thành viên của nhóm ATPase vận chuyển cation (Yamaguchi và cs, 1993; Tanzi và cs, 1993) Năm 1994, gen ATP7B đã được mô tả cấu trúc và chức năng một cách đầy đủ (Wu và cs, 1994) Từ đó, gen ATP7B được nghiên cứu ở

nhiều nước trên thế giới bằng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm: PCR (Polymerase Chain Reaction), PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restricted Fragment Length Polymorphism) và giải trình tự gen Người châu Âu và Địa Trung Hải có lượng đột biến rất phong phú, đột biến thường gặp nhất là H1069Q (Ferenci, 2006; Loudianos và cs, 1999), đột biến thay thế Histidin thứ 1069 trên chuỗi polypeptid thành Glutamin (Phụ lục 5-Bảng mã di truyền và kí hiệu viết tắt của các acid amin) Nghiên cứu phát hiện đột biến từ exon 5 đến exon 21, tác giả Shah đã phát hiện 27 đột biến khác nhau, bao gồm 5 đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn (dẫn

đến làm dịch khung đọc mở), 16 đột biến thay thế nucleotid (do bị thay đổi bộ ba), 2 đột biến vô nghĩa (đột biến tạo mã kết thúc sớm) và 2 đột biến vùng cắt, nối (Shah

và cs, 1997; Nussbaum và cs, 2007), trong đó đột biến H1069Q là phổ biến nhất Đây cũng là đột biến có tỷ lệ phát hiện cao nhất (37%) trong số 50 đột biến tìm thấy trong nghiên cứu gồm 136 bệnh nhân mắc Wilson đến từ Italia, Thổ Nhĩ Kì, Tây Ban Nha và đột biến tìm thấy thường ở thể đột biến dị hợp tử kép (Loudianos và cs, 1999) và Hungary (Firneisz và cs, 2002)

Nghiên cứu đột biến gen ATP7B được thực hiện ở một số nước khu vực Đông

Á chẳng hạn như Trung Quốc (Liu và cs, 2004; Wu và cs, 2000; Wu và cs, 2001; Li

và cs, 2011), Hàn Quốc (Yoo và cs, 2002; Gu và cs, 2003; Park và cs, 2007; Lee và

cs, 2011), Đài Loan (Wan và cs, 2006; Lin và cs, 2010) và Nhật Bản (Okada và cs,

2000; Kusuda và cs, 2000) Ngoài ra, nghiên cứu đột biến gen ATP7B đã được hự

chiện trên người Iran (Maleki và cs, 2013) Một số quốc gia khác chẳng hạn như: Pakistan, Bangladesh, Indonesia, Philippine hiện vẫn chưa có công bố về đột biến

gen ATP7B (Ferenci và cs, 2007) Ở khu vực Đông Nam Á, nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B rất hiếm gặp hoặc được thực hiện với cỡ mẫu nhỏ Một nghiên

cứu trên người Thái Lan đã phát hiện 2 đột biến, c.1870_1871delGA trên exon 6 và M1359V trên exon 20 (Treepongkaruna và cs, 2010), tuy nhiên đây không phải là đột biến phổ biến ở Châu Á (Ferenci, 2006)

Đột biến mới trên gen ATP7B được công bố trong nhiều y văn quốc tế

(Kusuda và cs, 2000; Leggio và cs, 2006; Kuppala và cs, 2009; Geng và cs, 2013)

và cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đến chức năng của gen ATP7B

Các đột biến này được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn

như: nghiên cứu in silico (sử dụng các chương trình tin sinh để đánh giá ảnh hưởng của đột biến đến cấu trúc và chức năng của gen), in vivo, in vitro (Squitti và cs,

2014; Dong và cs, 2016) và nghiên cứu mô hình cấu trúc không gian của gen (Huster và cs, 2012) để đánh giá ảnh hưởng của đột biến mới đến cấu trúc, chức

năng của protein Nghiên cứu thực nghiệm in vivo hoặc in vitro trên tế bào nấm men

hoặc tế bào động vật có ý vai trò tiên quyết để khẳng định chắc chắn đột biến mới

trên gen ATP7B là đột biến gây bệnh hay không gây bệnh (Forbes và Cox, 1998;

Squitti và cs, 2014) Một số đột biến là đột biến gây bệnh khi phân tích bằng các chương trình tin sinh, trong khi nghiên cứu thực nghiệm lại có kết quả ngược lại, chẳng hạn kết quả phân tích hàm cPdel cho thấy đột biến M645R, V995A, R1041W, R1041P, A1183T là những đột biến gây bệnh nhưng nghiên cứu thực nghiệm cho thấy những đột biến trên không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển đồng Ngoài

ra, đột biến M769V, L776V chưa được phân loại một cách chắn chắn là đột biến gây bệnh hay là một biến dị (variant) Nghiên cứu ở mức độ chức năng của protein nhờ biểu hiện gen trong nấm men đã cho thấy M769V là đột biến gây bệnh và L776V chỉ là một biến dị hiếm gặp hoặc là một đột biến ảnh hưởng đến quá trình định vị nội bào của protein ATP7B, qua đó làm giảm lượng đồng nội bào (Forbes

và Cox, 1998) Việc phân tích, đánh giá đột biến mới luôn cần có sự kết hợp của nhiều chương trình tin sinh và quan trọng nhất vẫn là thực hiện các nghiên cứu đột biến mới ở mức độ protein (Forbes và Cox, 1998; Park và cs, 2007) Từ năm 1995,

nghiên cứu về chức năng của gen ATP7B đã được thực hiện trên các chủng nấm

men (Forbes và Cox, 1998), tế bào CHO-K1 (Cater và cs, 2007; Wan và cs, 2010)

để nghiên cứu ảnh hưởng của các đột biến gen ATP7B đến quá trình vận chuyển đồng Nghiên cứu in vivo và in vitro có thể phân biệt được ảnh hưởng của đột biến

gen đến quá trình cuộn gập của protein (protein folding) hoặc chức năng của protein Theo tác giả Huster, đột biến D1027A ảnh hưởng đến năng suất vận chuyển đồng do phá vỡ quá trình thủy phân mặc dù nó không ảnh hưởng đến việc liên kết đồng (Huster và cs, 2012) Đột biến vùng mã hóa và không dịch mã được nghiên cứu bằng phương pháp cách tách dòng gen và tạo đột biến điểm trực tiếp Dòng tế bào có đột biến điểm được chuyển vào các tế bào CHO-K1 để đánh giá ảnh hưởng của các đột biến này đến chức năng của gen Kết quả cho thấy, đột biến sai nghĩa vùng điều khiển gen đã làm giảm hoạt tính của vùng điều khiển gen, từ 13 đến 51% Nghiên cứu biểu hiện tế bào bị đột biến vùng cắt nối của exon 12 trên tế bào CHO-K1 cho thấy thể bị đột biến bị giảm khả năng vận chuyển đồng đến 80% so với thể không bị đột biến (Wan và cs, 2010)

Wilson là bệnh lý đặc biệt bởi sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình Kiểu hình của bệnh Wilson không chỉ phụ thuộc vào thể đột biến, mà còn phụ thuộc vào

từng loại đột biến cụ thể xảy ra trên các vị trí khác nhau của gen ATP7B (Fan và cs,

2000; Lei và cs, 2004; Bie và cs, 2007; Chang và cs, 2017) Tuy nhiên, phần lớn y văn báo cáo kết quả nghiên cứu một số đột biến thường gặp đến biểu hiện lâm sàng của bệnh Theo đó, bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử R778L có biểu hiện bệnh từ sớm và lâm sàng nặng của thể bệnh gan (Forbes và Cox, 1998; Kusuda và cs, 2000) Trong khi, đột biến R778Q được tìm thấy trên người Đài Loan gây ra hậu quả ít nghiêm trọng hơn so với đột biến R778L, mặc dù Glutamin có tính chất gần với Arginin hơn là Leucin (Forbes và Cox, 1998) Đột biến dị hợp tử R778L trên gen

ATP7B (ví dụ kiểu gen c.2871delC/R778L) không ảnh hưởng nhiều đến kiểu hình

của bệnh nhân Wilson (Okada và cs, 2000) nhưng một số nghiên cứu khác đã không thể khẳng định mối liên quan giữa đột biến đồng tử R778L và các triệu chứng lâm sàng của bệnh gan ở bệnh nhân Wilson (Bie và cs, 2007) Bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử R779L thường có vấn đề về ngôn ngữ, cử động lưỡi và bệnh biểu hiện muộn, thường từ 18 tuổi, trong khi bệnh nhân dị hợp tử với đột biến này có thể được chia thành hai nhóm: nhóm có vấn đề về cử động lưỡi và nhóm có vấn đề về nội tạng (Fan và cs, 2000); đồng hợp tử đột biến H1069Q không liên quan đến mức

độ biểu hiện của bệnh (Anjali và cs, 1997) nhưng có thể ảnh hưởng đến độ tuổi phát bệnh và thể bệnh thần kinh (Firneisz và cs, 2002; Bie và cs, 2007); bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử G943S, V1106I biểu hiện bệnh muộn và ảnh hưởng đến thần kinh (Forbes và Cox, 1998; Lei và cs, 2004) Bệnh nhân Wilson có kiểu gen đồng hợp tử đột biến A874V thường biểu hiện bệnh liên quan đến thần kinh và phát bệnh muộn (Kusuda và cs, 2000)

1.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 1965, bệnh Wilson trên người Việt Nam được Scheinberg mô tả lần đầu tiên trong y văn báo cáo khái quát về bệnh Wilson, bao gồm các đặc điểm di truyền, đặc điểm lâm sàng và sự phân bố địa lý của bệnh Wilson trên thế giới (Scheinberg

và cs, 1965) Năm 2005, tác giả Thái Duy Thành đã phân tích các triệu chứng lâm sàng của bệnh Wilson, một số thay đổi trên hình ảnh học và chỉ số sinh hóa (Thái Duy Thành, 2005) Năm 2006, tác giả Lê Đức Hinh đã mô tả đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân Wilson Tuy nhiên, nghiên cứu đã không tiến hành phát hiện đột biến

gen ATP7B (Lê Đức Hinh và cs, 2006)

Năm 2008, tác giả Hoàng Lê Phúc là người đầu tiên tiến hành nghiên cứu đột

biến gen ATP7B trên 16 bệnh nhân nhi mắc bệnh Wilson tại Bệnh viện Nhi Đồng 1,

Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Nghiên cứu đã báo cáo 8 đột biến, bao gồm: P767Pfs, T850I, G943D, I1148T, E1173K, E1372X, IVS15-2 A>G, và 1 đột biến

mới L1015R Tuy nhiên, đột biến gen ATP7B được sàng lọc từ exon 4 đến exon 21

vì quá trình phân tích gen được thực hiện ở Áo (Hoàng Lê Phúc và cs, 2008) Năm

2010, tác giả Nguyễn Thị Mai Hương đã báo cáo kết quả phát hiện đột biến gen

ATP7B trên 10 bệnh nhân nhi mắc Wilson ở Bệnh viện Nhi Trung Ương Theo đó,

S105X có thể là một đột biến thường gặp trong nghiên cứu (Nguyễn Thị Mai Hương và cs, 2010) Ngược lại, nghiên cứu của Đỗ Thanh Hương chỉ phát hiện hai

trường hợp bị đột biến dị hợp tử R778L trên gen ATP7B khi tiến hành phát hiện đột

biến cho 23 bệnh nhân Wilson (Đỗ Thanh Hương và cs, 2010)

Năm 2015, tác giả Phan Tôn Hoàng đã công bố kết quả phân tích đột biến gen

ATP7B trên 61 bệnh nhân Wilson, trong đó 51 bệnh nhân bị đột biến gen ATP7B,

bao gồm 28 đột biến xảy ra trên 13 exon, 1 vùng intron và 5’UTR Tác giả đã đưa ra

tỷ lệ các vùng đột biến gen và bản đồ đột biến gen ATP7B ở Việt Nam (Phan Tôn

Hoàng, 2015)

Năm 2015-2016, tác giả Đỗ Thanh Hương và Hoàng Lê Phúc đã công bố kết quả nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân Wilson

ở Việt Nam Theo đó, kiểu hình của bệnh nhân Wilson không chỉ phụ thuộc loại đột

biến mà còn phụ thuộc vị tri của đột biến gen ATP7B (Hoàng Lê Phúc, 2015; Đỗ

Thanh Hương, 2016) Năm 2017, nghiên cứu của tác giả Phạm Lê Anh Tuấn đã phát hiện 26 đột biến khác nhau trên 54 bệnh nhân Wilson ở miền Bắc, Việt Nam

Nghiên cứu đã đưa xác định được một số exon có tỷ lệ phát hiện đột biến cao trên

gen ATP7B, bao gồm exon 2, 8, 18 và đột biến thường gặp nhất là S105X (Phạm Lê

Anh Tuấn và cs, 2017)

Như vậy, nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B đã được thực hiện tại

nhiều đơn vị khác nhau, trên nhiều cỡ mẫu đại diện cho một số khu vực dân cư nhất

định nên vẫn chưa đưa ra được kết luận chung về đặc điểm đột biến gen ATP7B ở

người Việt Nam Vì vậy, việc xác định toàn bộ đột biến trên bệnh nhân Wilson cần

tiếp tục được tiến hành trên toàn bộ 21 exon của gen ATP7B để tìm ra đột biến đặc

trưng và các vùng thường xảy ra đột biến ở độ tuổi khác nhau trên người Việt Nam

bị bệnh Wilson, giúp cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả

1.2 DỊCH TỄ HỌC VÀ PHÂN LOẠI BỆNH WILSON

1.2.1 Dịch tễ học

Wilson là một trong những bệnh di truyền chuyển hóa hiếm gặp trên thế giới với tỷ lệ mắc bệnh Wilson ước tính từ 1/5000 đến 1/30000 trẻ đẻ sống Tỷ lệ người mang gen bệnh (carrier) là khoảng 1/90 (Forbes và cs, 1998; Das và cs, 2006) Wilson là bệnh di truyền lặn, bố và mẹ đều là người truyền gen bị đột biến cho con của họ (Lutsenko và cs, 2007) Khu vực châu Á bao gồm các quốc gia như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản có tần suất mắc bệnh Wilson cao hơn các khu vực khác Theo đó, bệnh Wilson là một trong số bệnh di truyền lặn phổ biến ở Hàn Quốc với

tỷ lệ mắc là 1/3000, cao hơn rất nhiều tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới; tỷ lệ người mang đột biến gen là 1/30778 (Zhang và cs, 2011) Iran và Ấn Độ là hai quốc gia có tỷ lệ người mắc bệnh Wilson rất cao bởi tình trạng hôn nhân cận huyết (Ferenci và cs, 2012; Maleki và cs, 2013) bởi kết hôn cận huyết là một nguyên nhân làm tăng nguy

cơ mắc căn bệnh di truyền lặn này trong cộng đồng (Zhang và cs, 2011; Chaudhry

và cs, 2017) Ấn Độ có 15 đến 20 bệnh nhân Wilson mắc mới một năm Kết hôn cận huyết là một nguyên nhân làm tăng nguy cơ mắc căn bệnh di truyền lặn này trong cộng đồng (Zhang và cs, 2011; Chaudhry và cs, 2017) Bệnh Wilson cũng là một trong những bệnh di truyền lặn thường gặp nhất ở Hàn Quốc (Jang và cs,

2017) Tỷ lệ mắc bệnh Wilson ở Hàn Quốc là 1/3000, cao hơn rất nhiều so với tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới Tỷ lệ người mang gen bệnh ở Hàn Quốc và Đài Loan khi

sàng lọc một số đột biến thường gặp trên gen ATP7B lần lượt là 1/30.778 và 3/100

Tỷ lệ người mang đột biến R778L ở người Hồng Kông gốc Trung Quốc (người Hán) ước tính khoảng 1/200 và tần suất người bị bệnh Wilson là 1/5400, một lần nữa đã cho thấy tỷ lệ mắc bệnh cao ở một số quốc gia châu Á (Zhang và cs, 2011)

1.2.2 Phân loại bệnh

Wilson thường có 2 thể lâm sàng chính, thể bệnh gan và thể bệnh thần kinh Ngoài ra, một số bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng kết hợp của cả 2 thể bệnh Wilson thể bệnh gan thường gặp nhiều ở trẻ em và người trưởng thành nhiều hơn so với ở người cao tuổi (Roberts và cs, 2003) Tỷ lệ mắc bệnh Wilson ở nam và nữ như nhau (Chaudhry và cs, 2017) Những trường hợp Wilson được chẩn đoán muộn thường gặp tổn thương phối hợp đa cơ quan (Ferenci và cs, 2012)

1.3 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ BỆNH WILSON

1.3.1 Vị trí, cấu trúc phân tử gen ATP7B

Gen ATP7B nằm trên NST số 13 (13q14.3), mã hóa protein ATPase (P type

ATPase copper transporting beta peptide) nhóm phosphate, có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển, hấp thu và đào thải đồng Kích thước toàn bộ gen vào khoảng 80 kb Gen gồm có 21 exon và 20 intron, khung đọc mở có kích thước 4,3

kb (Kenney và cs, 2007) Protein ATP7B biểu hiện chức năng chủ yếu trong gan nhưng cũng tìm thấy trong thận, nhau thai, tuyến vú và phổi (Galehdari và cs, 2012; Chang và cs, 2017)

1.3.2 Cấu trúc và chức năng protein ATP7B

ATPase nhóm phosphate- ATP7B là một thành viên trong họ protein vận chuyển kim loại nặng theo cơ chế vận chuyển xuyên màng, đồng thời còn là chất vận chuyển trung gian của nhiều cation bao gồm Mg2+, Ca2+, Na+, K+, Zn2+, Ag+ và thường vận chuyển ngược với gradient nồng độ (Lutsenko và cs, 2002) Protein

màng này chủ yếu nằm trong mạng lưới Golgi của tế bào gan, một lượng nhỏ trong não và có thể có trong ty thể (Fatemi và cs, 2002; Roberts và cs, 2003) Trong gan người bình thường, protein ATP7B đảm nhận 2 chức năng chính: vận chuyển đồng vào mạng lưới Golgi để liên kết với ceruloplasmin và đào thải đồng dư thừa bằng cách cô lập kim loại trong túi nội bào để thải ra ngoài qua đường mật ở giai đoạn tiếp theo; chức năng thứ hai là vận chuyển từ mạng lưới Golgi đến túi nội bào để đáp ứng với sự tăng cao lượng đồng nội bào (Huster và cs, 2012)

Hình 1.1 Gen ATP7B và protein ATP7B-ATPase tương ứng ở người

màng tế bào Một trong các bước này có thể bị ảnh hưởng bởi đột biến gen và gây

ra hậu quả có thể rất nghiêm trọng, dẫn đến mất hoàn toàn chức năng ATP7B, nếu

vị trí đột biến là quan trọng cho việc liên kết của ATP hoặc đồng và/ hoặc chuyển đổi về hình dạng trong suốt quá trình xúc tác (Huster và cs, 2006) Sự bất hoạt chức

năng của gen cũng có thể bị ảnh hưởng một phần nếu đột biến gen ATP7Blàm giảm

ái lực cho các chất nền, làm chậm quá trình chuyển đổi về hình dạng, hoặc túi protein Tuy nhiên, để biết được sự đa dạng trong kiểu hình của bệnh Wilson cần sự phân tích kết hợp tất cả các tác nhân gây đột biến làm thay đổi sự ổn định protein, hoạt động và sự định vị protein trong tế bào (Huster và cs, 2012; Chang và cs,2017)

1.3.3 Đặc điểm đột biến gen ATP7B

1.3.3.1 Đột biến gen ATP7B rất đa dạng

Đột biến là những thay đổi hiếm gặp xảy ra trên trình tự nucleotid của một gen Đột biến gen thường là nguyên nhân gây bệnh nhưng có thể ảnh hưởng hoặc không ảnh hưởng đến biểu hiện kiểu hình Đột biến gen được di truyền từ bố mẹ (đột biến dòng tế bào mầm) hoặc xảy ra trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mỗi cá thể (đột biến tế bào soma) Trong khi đó, các đa hình cũng là những thay đổi trên trình tự nucleotid của gen nhưng đa hình thường xảy ra trong quần thể với tỷ lệ 1% hoặc cao hơn Đa hình có thể không gây hại hoặc có lợi và là nguyên nhân của

sự đa dạng sinh học (Karki và cs, 2015) Với bệnh Wilson, đột biến gen ATP7B rất

phong phú, có thể xảy ra trên toàn bộ gen (Ferenci, 2006) Cho đến nay, hơn 800

đột biến đã được phát hiện trên gen ATP7B (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php)

(Jang và cs, 2017) Nhiều nghiên cứu trên thế giới liên tục phát hiện thêm các đột biến mới (Kusuda và cs, 2000; Park và cs, 2007; Manocheri và cs, 2014; Zhang và

cs, 2011) đã khẳng định sự đa dạng của đột biến gen ATP7B Bệnh nhân Wilson

thường có hai đột biến dị hợp tử (dị hợp tử kép-compound heterozygote), gồm một đột biến dị hợp tử có nguồn gốc từ bố và một đột biến dị hợp tử có nguồn gốc từ mẹ (Roberts và cs, 2003; Ferenci và cs, 2004)

Trong sô các loại đột biến trên gen ATP7B, đột biến sai nghĩa và đột biến vô

nghĩa thường phổ biến hơn, tiếp đến là đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn nhỏ, đột biến vùng cắt, nối (Ferenci, 2006; Zhang và cs, 2011; Squitti và cs, 2014) Đột biến sai nghĩa (hay còn gọi là đột biến điểm) là những đột biến do thay thế một nucleotid trên trình tự DNA có thể làm thay đổi bộ ba mã hóa khiến cho acid amin này được thay thế bằng một acid amin khác dẫn đến thay đổi duy nhất 1 acid amin trên chuỗi polypeptid Đột biến vô nghĩa (nonsense) là những đột biến điểm xảy ra trên trình tự DNA, khiến cho mã bộ ba mã hóa một acid amin bình thường bị thay thế bằng 1 trong 3 bộ ba kết thúc, và do vậy quá trình dịch mã sẽ dừng lại ngay tại vị trí bị đột biến Quá trình dịch mã bị kết thúc sớm làm cho mRNA dễ bị phân hủy và có thể không có sản phẩm protein Thậm chí, mRNA không đủ ổn định để dịch mã, khiến cho protein bị cụt (truncated), không bền và chúng nhanh chóng bị suy thoái trong

tế bào Các đột biến do thêm hoặc mất 1 nucleotid hoặc một đoạn nucleotid làm thay đổi khung đọc mở bắt đầu từ vị trí xảy ra đột biến dẫn đến làm thay đổi trình tự nucleotid và thêm và hoặc bị mất một hoặc một số bộ ba mã hóa acid amin và do vậy có thể tạo thành bộ ba kết thúc (Nusbaum, 2007; Chang và cs, 2017) Đột biến vùng cắt, nối ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp mRNA Quá trình phiên mã để tạo thành phân tử mRNA trưởng thành đòi hỏi có sự tham gia của một loạt các sự kiện khác nhau bao gồm gắn mũ đầu 5’, polyadenylation và cắt, nối gen Tất các bước trên đều phụ thuộc vào một trình tự đặt biệt nằm gần các exon-intron (xuôi chiều đầu 5’) hoặc intron-exon (ngược chiều đầu 3’) hoặc một số trình nucleotid đặc biệt trên trình gen Đột biến xảy ra trên trình tự này ảnh hưởng đến quá trình cắt, nối bình thường, vùng intron gần vị trí đột biến không được cắt bỏ Do đó, mRNA chưa qua chế biến vẫn còn các trình tự vùng intron Ngoài ra, đột biến vùng intron có thể không ảnh hưởng đến trình tự của vị trí cắt nối xuôi chiều và ngược chiều mà chúng tạo ra các vị trí cắt nối mới, cạnh tranh với vị trí cắt nối ban đầu của gen trong quá trình chế biến RNA Vì thế, sản phẩm mRNA trưởng thành sẽ có một tỷ lệ nhất định những trình tự intron không được cắt, nối chính xác (Nusbaum, 2007) và đã tạo ra sản phẩm quá trình dịch mã bất thường

1.3.3.2 Đột biến gen ATP7B có đặc trưng chủng tộc

Đột biến gen ATP7B có đặc trưng cho từng khu vực, thậm chí cho từng quốc

gia (Anjali và cs, 1997; Das và cs, 2006; Ferenci, 2006; Zhang và cs, 2011; Li và cs,

2011; Zali và cs, 2011; Chang và cs, 2017) Một lượng lớn đột biến gen ATP7B đã

được miêu tả nhưng chỉ số ít đột biến là đột biến phổ biến của nhiều quốc gia trên thế giới (Ferenci, 2006) Theo đó, một số đột biến có tỷ lệ phát hiện rất cao ở một nhóm dân tộc hoặc một số khu vực nhất định, trong khi nó lại rất hiếm hoặc không

có trong các quần thể và các khu vực khác Đột biến H1069Q phổ biến nhất ở người châu Âu, Bắc Mỹ (10-40%) và người Địa Trung Hải (10-30%) (Chang và cs,2017) Trong khi, R778L là đột biến phổ biến nhất ở một số nước châu Á (bao gồm: Trung Quốc; Hàn Quốc; Đài Loan; Nhật Bản), đột biến thường gặp nhất là R778L (Wu và

cs, 2000; Wan và cs, 2006; Ferenci và cs, 2006; Park và cs, 2007; Zhang và cs, 2011) Ngoài ra, một số đột biến thường gặp ở từng khu vực khác, bao gồm: G1267R (38%), 44/-427del trên 5’UTR (Untranslated region-UTR), 246delC ở Sardinia (Das và cs, 2006; Ferenci và cs, 2006); đột biến trên exon 8 (6,8%), 3400delC (3%) và P969E (1,6%) ở một số nước châu Âu; A1003T và P969E ở Thổ nhĩ Kỳ Tuy nhiên, một số quốc gia chẳng hạn như: Pakistan, Bangladesh,

Indonesia, Philippine vẫn chưa có công bố về đột biến gen ATP7B (Pfeiffer, 2007)

1.3.3.3 Đột biến gen ATP7B có liên quan đến biểu hiện lâm sàng

Các đột biến dị hợp kép có tỷ lệ phát hiện cao đã phản ánh sự tương quan rõ ràng giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Wilson (Huster và cs, 2012) Kiểu hình của bệnh nhân Wilson không chỉ phụ thuộc vào thể đột biến, mà còn phụ thuộc vào

vị trí xảy ra đột biến của gen ATP7B (Lei và cs, 2004; Bie và cs, 2007; Chang và cs,

2017) Các thể đột biến bao gồm đột biến dịch khung (frame shift) do thêm nucleotid (small insertion) hay mất nucleotid (small deletion) và đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo ra sản phẩm protein bất thường (truncation) hoặc có thể không có sản phẩm protein dẫn đến thể bệnh nặng (Das và cs, 2006) Vị trí xảy ra đột biến cũng có ảnh hưởng khác nhau đến đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson (Zali và cs, 2011) T787I là đột biến thay thế một acid amin phân cực bằng một acid amin

không phân cực và kỵ nước trên vùng xuyên màng, nó đã ảnh hưởng đến cấu trúc thứ cấp của ATP7B (Shah và cs, 1997; Forbes và cs,1998; Kusuda và cs, 2000) Đột biến H1069N xảy ra trên motif SEHPL trong vùng N làm thay đổi acid amin Histidin thành Glutamic, dẫn đến sản phẩm protein có cấu trúc bất thường (quá trình đóng gói bất thường-misfolding), ảnh hưởng đến quá trình photphoryl hóa ở vùng M và do đó làm giảm liên kết của protein ATP7B với ATP (Chang và cs, 2017); đột biến R778L ảnh hưởng đến vùng vận chuyển đồng xuyên màng; một số đột biến thường gặp như G943S, M769V thuộc motif SEHPL bảo tồn, đã ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển đồng nhưng không ảnh hưởng đến lượng ceruloplasmin; hai đột biến H1069Q và R778L đều ảnh hưởng đến độ bền vững của ATPase Như vậy, sự thay đổi xảy ra trên bất kì vùng nào có tính ổn định cao của protein đều sẽ có tác động nhất định đến chức năng của gen (Chang và cs, 2017) Mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Wilson vẫn chưa xác định được rõ ràng (Anjali và cs, 1997; Bie và cs, 2007) Các nghiên cứu hầu hết chỉ tập trung phân tích ảnh hưởng đến biểu hiện lâm sàng của một số đột biến thường gặp (Huster và cs, 2012) và chưa thể giải thích được nguyên nhân của sự khác biệt giữa những người có cùng kiểu gen nhưng kiểu hình lại khác nhau Một số trường hợp bị Wilson có cùng kiểu gen nhưng trong số đó có một số người bị bệnh gan trong 10 năm đầu tiên của cuộc sống, những người khác lại bị thoái hóa thần kinh ở tuổi vị thành niên hoặc khi trưởng thành Giả thiết cho rằng các yếu tố di truyền, môi trường sống do có sự khác biệt về lượng đồng dinh dưỡng trong nguồn nước, thức ăn có thể là nguyên nhân ảnh hưởng đến kiểu hình của bệnh Wilson (Vrabelova và cs, 2005; Leggio và cs, 2007)

1.4 CƠ CHẾ BỆNH SINH BỆNH WILSON

Động vật có vú gồm 2 enzyme chính tham gia vận chuyển đồng là ATP7B và ATP7A tạo thành một phân họ thuộc nhóm CPx-type ATPase (Cater và cs, 2007) ATP7B biểu hiện chủ yếu ở tế bào gan mà còn ở các vùng khác của não, vú, và nhau thai ATP7A biểu hiện hầu hết trong các mô ngoài gan (Chen và cs, 2015;

chuyển hóa nghiêm trọnglà bệnh Wilson và bệnh Menkes Cả hai bệnh trên đều do đột biến gen mã hóa Protein vận chuyển đồng Cu-ATPase Tuy nhiên, lâm sàng của bệnh Wilson khác nhiều so với bệnh Menkes Wilson là bệnh di truyền lặn trên

nhiễm sắc thể thường, do thiếu hụt P-type ATPase được mã hóa bởi gen ATP7B

thường có lâm sàng liên quan đến các bệnh gan, thần kinh (Roberts và cs, 2003; Michael và cs, 2009; Vassiliki và cs, 2010), trong khi Menkes cũng là bệnh di truyền nhưng do đột biến gen mã hóa Cu-ATPase ATP7A và bệnh nhân có thể tử vong ở thời thơ ấu Đặc điểm lâm sàng của bệnh Menkes đặc trưng bởi sự suy yếu thần kinh và phát triển một cách đột ngột do vận chuyển đồng đến não bị gián đoạn Ngoài ra, bệnh nhân có rất nhiều triệu chứng khác do sự suy giảm chức năng của các enzyme vận chuyển đồng và còn bao gồm cả những bất thường về mô liên kết, thiếu sắc tố da, và mạch máu bị uốn khúc (Forbes và cs, 1998)

Đồng là một kim loại quan trọng, cần thiết cho nhiều hoạt động tế bào khác nhau, bao gồm: hô hấp; chống oxy hóa; tổng hợp dẫn truyền thần kinh; sự hình thành mô liên kết; hình thành sắc tố; cơ chế chuyển hóa sắt Trong đó, chức năng nổi bật của đồng là nguyên tố đồng vận của nhiều enzyme chuyển hóa quan trọng như ceruloplasmin, cytocrom c oxidase, dopamine β-hydroxylasecủa tuyến thượng thận, peptidylglycine α-amidating monooxygenase của tuyến yên, superoxide dismutase và tyrosinase, tham gia vào quá trình hô hấp, chuyển hóa kim loại, neurotransmitter biosynthesis, radical detoxification và nhiều quá trình sinh lý khác (Chaudhry và cs, 2017; Fatemi và cs, 2002; Ferenci, 2004) Các enzyme này điều hòa sự phân bố đồng trong tế bào (Deguti và cs, 2004; Ala và cs, 2007) Con đường vận chuyển nội bào đảm bảo việc tổng hợp vài bài tiết đồng được cân bằng, tránh làm nhiễm độc tế bào Lượng đồng trung bình cần cho cơ thể là 1-3 mg/ngày (Das

và cs, 2006), tuy nhiên lượng khuyến cáo là 0,9 mg/ngày Trong cơ thể con người, gan là cơ quan trung tâm duy trì sự cân bằng nội mô lượng đồng thông qua việc hấp thu và chuyển hóa đồng, đồng thời là nơi bị ảnh hưởng đầu tiên khi đồng dư thừa (Ferenci, 2004) Các tổn thương do bệnh Wilson là hậu quả của quá trình tích tụ đồng trong các tổ chức theo thời gian và các phản ứng của các mô đối với sự tích

lũy này Đồng được hấp thụ ở dạ dày và chủ yếu ở tá tràng, sau đó được vận chuyển đến gan, và một lượng nhỏ đến thận và các cơ quan khác Ngoài một lượng cần thiết được gan sử dụng cho quá trình trao đổi chất, lượng đồng thừa sẽ được đào thải thông qua mật và được điều hòa bởi Cu-ATPase ATP7B (Roberts, 2003; Ferenci, 2006) Trong tế bào, Cu-ATPase duy trì nồng độ đồng trong tế bào bằng cách vận chuyển đồng trong màng lumen của màng tế bào Enzyme này đóng vai trò vừa tổng hợp vừa bài tiết và có chức năng vận chuyển đồng vào bộ máy Golgi để kết hợp với Ceruloplasmin huyết tương (Ala, 2007) Tại gan lượng đồng dư không cần cho các hoạt động chuyển hóa sẽ được bài tiết ra mật xuống ruột Phần đồng không hấp thu tại ruột non cũng sẽ được thải qua phân Phần đồng chuyển ngược từ gan vào hệ tuần hoàn sẽ được gắn kết với albumin hoặc ceruloplasmin (Ferenci, 2006) Trong bệnh Wilson, bài tiết đồng qua mật bị giảm là cơ chế chính gây tích lũy đồng

dư trong cơ thể Sự giảm thải đồng qua mật và giảm khả năng gắn kết đồng vào ceruloplasmin là hậu quả trực tiếp của sự biến đổi hoặc mất chức năng của enzym ATP7B, một protein nội bào, có chủ yếu ở trans-Golgi của tế bào gan

Sự hấp thu đồng trong gan có sự tham gia của một số protein vận chuyển như CTR1 (Copper membrane transporter 1-protein vận chuyển đồng xuyên màng), ATOX1 (Antioxidant protein 1-Protein chống oxy hóa 1), Metallothioneins (MT)…(Chang và cs, 2017) (Hình 1.2) Khi lượng đồng trong tế bào tăng cao, ATP7A sẽ giải phóng đồng vào tĩnh mạch cửa, di chuyển đến gan để liên kết với Metallothionein, ATOX1 (Fatemi và cs, 2002; Chaudhry và cs, 2017) Trước tiên, một lượng đồng nhỏ sẽ kết hợp với Metallothionein trong tế bào chất, phần còn lại được ATOX1 vận chuyển vào túi lưới nội bào Golgi và lượng còn thừa sẽ được bài tiết ra ngoài qua mật (Fatemi và cs, 2002) ATOX1 là một thụ thể (chaperone) đặc hiệu với đồng, sẽ vận chuyển đồng đến protein ATP7B thông qua tương tác protein-protein (Chang và cs, 2017) ATP7B thực hiện hai chức năng quan trọng trong mạng lưới Golgi và trong tế bào chất Trong mạng lưới Golgi, ATP7B kích hoạt ceruloplasmin bằng cách kết hợp với 6 phân tử đồng dưới dạng ion Cu2+thành apoceruloplasmin và tiết ra huyết tương Trong tế bào chất, ATP7B hấp thu đồng dư

thừa vào các túi nhỏ và bài tiết ra ngoài thông qua đường mật Do thực hiện 2 vai trò trong quá trình chuyển hóa đồng (tổng hợp và bài tiết đồng), các bất thường trong chức năng của nó dẫn đến sự tích tụ đồng và các đặc điểm lâm sàng tiến triển của bệnh Wilson (Ferenci, 2006; Chang và cs, 2017)

Hình 1.2 Quá trình chuyển hóa đồng trong gan

( Nguồn: Ferenci, 2006 )

Bình thường, cơ thể loại bỏ lượng đồng dư thừa ra ngoài nhưng người bị đột

biến gen ATP7B sẽ không thể đào thải đồng (Ala, 2007; Chaudhry và cs, 2017), khi

đó đồng tích tụ lại trong cơ thể trong khi ceruloplasmin vẫn được bài tiết nhưng ở dạng không bền vững do thiếu liên kết với đồng, và sẽ nhanh chóng giảm xuống trong máu (Lutsenko và cs, 2007) Khi vượt quá nhu cầu của tế bào, đồng lại trở thành một chất độc và phá hủy chức năng gan do nó có khả năng sản sinh gốc tự do oxy hóa theo cơ chế hóa học Fanton (Roberts và cs, 2003; Vassiliki và cs, 2010) Gan là cơ quan chuyển hóa đồng chính của cơ thể, vì vậy thường cũng là nơi đồng dư thừa tích tụ và gây các ảnh hưởng đầu tiên Sinh lý học bệnh Wilson thể bệnh gan là do hậu quả trực tiếp của việc tích lũy đồng trong tế bào gan Sự hiện diện của đồng ở dạng oxy hóa (Cu1+) đã phá hủy các tế bào gan (Ferenci, 2004) Tế bào gan bị phá hủy tiến triển sẽ dẫn đến viêm gan mạn tính hoạt động, xơ hóa và xơ gan (Lutsenko và cs, 2004) Đồng dư thừa được giải phóng vào dòng máu ở dạng không gắn ceruloplasmin (apoceruloplasmin), dẫn đến đồng tự do lắng đọng khắp

cơ thể nhưng nhiều nhất là ở thận, mắt và não bộ Tổn thương liên quan đến mắt do

sự lắng đọng đồng ở mống mắt tạo triệu chứng vòng Kayser-Fleisher (KF) (Ferenci, 2006; Lutsenko và cs, 2007) Đồng dư thừa lắng đọng ở các nhân não, hay gặp nhất

là nhân bèo và nhân đậu (con ngươi mắt) trở thành các tác nhân độc hại phá hủy neuron thần kinh (Ferenci, 2004) Vì nhân não tham gia điều hòa hoạt động của cơ thể, chúng có vai trò quan trọng trong sự tiến triển của các triệu chứng thần kinh và tâm thần thường thấy ở bệnh nhân Wilson (Roberts, 2003; Ferenci, 2006; Zhang và

cs, 2011) Lượng đồng dư thừa có xu hướng lắng đọng ở gan trước khi tích tụ ở hệ thần kinh (Ferenci, 2006; Lutsenko và cs, 2007) Điều đó giải thích tại sao hệ thần kinh thường bị ảnh hưởng muộn hơn so với gan Thông thường, một số biến chứng liên quan đến gan xảy ra trong khoảng 10 năm đầu, số khác có các biểu hiện về thần kinh và tâm thần vào những năm 30 tuổi (Ala, 2007)

1.5 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ CẬN LÂM SÀNG, TIÊU CHUẨN CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ BỆNH WILSON

1.5.1 Đặc điểm lâm sàng

1.5.1.1 Độ tuổi phát bệnh

Bệnh Wilson khởi phát ở nhiều độ tuổi khác nhau, thường gặp nhất là từ 5 đến

35 tuổi Bệnh nhân nhỏ tuổi nhất được chẩn đoán lúc 3 tuổi (Roberts và cs, 2003) và lớn tuổi nhất là 80 tuổi (Ferenci và cs, 2012) Bệnh nhân nhỏ tuổi chẳng hạn như trẻ nhỏ và thanh thiếu niên thường có xu hướng đến khám bệnh sớm hơn thường có vấn đề về gan, trong khi những bệnh nhân có biểu hiện về thần kinh và tâm thần chủ yếu ở độ tuổi 20 hoặc nhiều hơn (Jang và cs, 2017) Khoảng 3% bệnh nhân Wilson phát bệnh ngoài 4 tuổi có biểu hiện bệnh tại gan hoặc thần kinh, 25% bệnh nhân có tổn thương trên 2 cơ quan (Ferenci và cs, 2012), số ít còn lại được chẩn đoán sớm

do gia đình họ có người mắc bệnh Ngoài ra, nhiều bệnh nhân Wilson mặc dù đã có triệu chứng nhưng không được phát hiện do biểu hiện lâm sàng của bệnh phong phú

khiến cho việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn (Roberts và cs, 2003)

1.5.1.2 Bệnh lý về gan

Thể bệnh gan chiếm 40-50% các trường hợp mắc bệnh Wilson (Ferenci, 2006; Pfeiffer, 2007), có thể gặp ở nhiều độ tuổi khác nhau, từ trẻ nhỏ tới người già Triệu chứng của bệnh Wilson diễn ra một cách thầm lặng và từ từ Bệnh nhân thường tới viện với triệu chứng suy gan mạn, một số ít trong tình trạng suy gan cấp kèm theo tan máu và đa phần các trường hợp này đều tử vong trong một vài ngày tới một tuần nếu không được ghép gan cấp cứu (Ferenci và cs, 2012)

Bất kì loại tổn thương gan nào đều có thể gặp trong bệnh Wilson, dấu hiệu tổn thương gan có thể biểu hiện sớm hơn 10 năm so với các dấu hiệu thần kinh Hầu hết bệnh nhân thể thần kinh đều có một vài dấu hiệu lâm sàng liên quan đến bệnh gan Đặc điểm lâm sàng của bệnh gan vô cùng đa dạng, dao động từ không có triệu chứng mà chỉ có các bất thường về sinh hóa đến xơ gan ồ ạt với tất cả các biến chứng (Cho và cs, 2011; Ferenci và cs, 2012; Gunjan và cs, 2017) Một số biểu hiện thường gặp chẳng hạn như mệt mỏi, chán ăn, vàng da ứ mật, xơ gan, suy gan cấp,

vô kinh, chậm phát dục, dễ bị xuất huyết hay lú lẫn (bệnh não-gan) và tăng áp lực tĩnh mạch cửa (Medicin và cs, 2006) Áp lực tĩnh mạch cửa tăng cao đáng kể dẫn tới giãn tĩnh mạch thực quản có thể gây xuất huyết, đe dọa tính mạng, lách to và cổ chướng (Ferenci và cs, 2012) Các bệnh lý về gan thường gặp bao gồm:

- Suy gan cấp tính do Wilson: Bệnh nhân suy gan cấp tính chiếm 6-12% trong tổng số bệnh nhân Wilson thể gan và đa số cần ghép gan cấp cứu Suy gan cấp tính

do bệnh Wilson xảy ra chủ yếu ở phụ nữ trẻ và thường gặp ở nữ nhiều hơn ở nam (tỷ lệ nam/nữ là 4/1) Khoảng 5% bệnh nhân Wilson có biểu hiện lâm sàng cấp tính, tiến triển nhanh chóng đến suy gan và suy thận Nếu không được điều trị, tỷ lệ tử vong của bệnh nhân Wilson bị suy gan cấp lên đến 95% Cần chẩn đoán phân biệt bệnh Wilson với các trường hợp suy gan cấp tính, đe dọa tính mạng bệnh nhân do các nguyên nhân khác (Ala và cs, 2007; Ferenci và cs, 2012) Bệnh nhân Wilson đã từng điều trị ở giai đoạn trước nhưng ngừng thuốc cũng có thể rơi vào tình trạng suy gan cấp tính Ngoài ra, bệnh Wilson thể cấp tính đặc biệt được nghi ngờ ở những bệnh nhân bị bệnh vàng da đậm tăng nhanh, hemoglobin thấp, cholinesterase thấp,

transaminase tăng nhẹ và phosphatase kiềm thấp (Ferenci và cs, 2012)

- Viêm gan mạn tính và xơ gan: Nhiều bệnh nhân Wilson có dấu hiệu của bệnh gan mạn tính và có bằng chứng của xơ gan, còn bù hoặc mất bù Bệnh nhân có thể

có biểu hiện lách to đơn thuần do lâm sàng của xơ gan kèm theo với tăng áp lực tĩnh

mạch cửa (Ferenci và cs, 2012)

- Tan máu: Tan máu khi test Coombs âm tính có thể là triệu chứng ban đầu của bệnh Wilson Tuy nhiên, tan máu được coi như một yếu tố thường gặp trong bệnh lý gan nặng Sự hủy hoại hàng loạt tế bào gan làm giải phóng một lượng đồng lớn vốn

đã được dự trữ trong gan, làm cho tình trạng tan máu càng thêm nghiêm trọng Tan máu cấp thấp có thể nghi ngờ liên quan đến bệnh Wilson ngay cả khi không có dấu hiệu lâm sàng liên quan đến bệnh gan (Ferenci và cs, 2012) Bệnh Wilson cũng có thể biểu hiện dưới dạng suy gan cấp tính đôi khi kết hợp với thiếu máu huyết tán có test Commbs âm tính và suy thận cấp hoặc kèm theo ung thư gan (Cho và cs, 2011; Gunjan và cs, 2017; Ferenci và cs, 2012) Khoảng 5% bệnh nhân đã được chẩn đoán bệnh khi đã có biểu hiện suy chức năng gan tối cấp, thường nằm trong bệnh cảnh thiếu máu huyết tán, dẫn tới bất thường về sản xuất và sự chuyển hóa protein tại gan Rối loạn chuyển hóa protein làm tích tụ các sản phẩm chuyển hóa như NH3

trong máu Những chất này kích thích não bộ gây bệnh não gan (lú lẫn, hôn mê, co

giật) và đe dọa tử vong do phù não (Ala và cs, 2007; Ferenci và cs, 2012)

1.5.1.3 Bệnh lý thần kinh

Dấu hiệu thần kinh rất đa dạng, thường gặp là rối loạn trương lực cơ và các động tác bất thường Các dấu hiệu có thể đơn lẻ khi bị bệnh, hoặc xuất hiện đồng thời với các dấu hiệu lâm sàng về gan, hoặc vài năm sau đó và thường là sau tuổi 40 (Weitzman và cs, 2014) Tăng trương lực cơ lan tỏa kèm theo các triệu chứng ngoại tháp và rõ nhất ở nhóm cơ mặt, cơ phát âm, cơ cùng cổ và cơ thắt lưng, với các biểu hiện chính là run, thất điều, co cứng cơ Biểu hiện thần kinh cực kì tinh vi và có thể ngừng lại trong vài năm, nhưng cũng có thể phát triển rất nhanh chóng, dẫn đến khuyết tật chỉ trong vài tháng Các bất thường về thần kinh có thể được phân loại

(3) Mất điều hòa; và (4) Hội chứng trương lực cơ Trong nhiều trường hợp, dấu hiệu thần kinh rất khó để phân loại vì bệnh nhân có nhiều bất thường, và ở nhiều mức độ nghiêm trọng khác nhau (Ferenci và cs, 2012) trong đó 50-60% bệnh nhân Wilson

có các biểu hiện lâm sàng liên quan đến thần kinh (Zhang và cs, 2011) Tuổi trung bình ở thể bệnh này là 18,9 tuổi, mặc dù các triệu chứng thần kinh có thể biểu hiện trước 6 tuổi hoặc sau 72 tuổi (Roberts và cs, 2003) Các triệu chứng thần kinh sớm

và dễ phát hiện ở trẻ em và người lớn bao gồm: nói khó, nói ngọng, mặt nhăn nhó, hàm mở, chảy nước dãi, dáng đi bất thường Ngoài ra, bệnh nhân khó thực hiện các vận động tinh tế như chữ viết xấu do run tay, nét viết khó đọc, không thể đánh đàn (Ala và cs, 2007; Ferenci và cs,2012) Những triệu chứng thần kinh đặc biệt xuất hiện tiếp theo thường giống bệnh Parkinson (các vận động hàng ngày cứng nhắc và chậm chạp) có hoặc không có run tay điển hình, thất điều (mất sự phối hợp động tác), rối loạn trương lực cơ (xoắn vặn hoặc sự lặp đi lặp lại một động tác ở một phần

cơ thể) Động kinh và đau nửa đầu rất thường gặp trong bệnh Wilson (Pfeiffer, 2007) Do khó khăn trong việc kiểm soát sự chuyển động hay trương lực cơ tiến triển, bệnh nhân không thể nói và chăm sóc bản thân, cuối cùng bị tàn tật Các triệu chứng thần kinh ở bệnh nhân Wilson có kèm theo bệnh gan tiến triển có thể bị nhầm lẫn với các biểu hiện của bệnh não gan (Ferenci và cs, 2012)

1.5.1.4 Triệu chứng tâm thần

Rối loạn hành vi và triệu chứng tâm thần rất phổ biến và có thể xuất hiện trước các triệu chứng thần kinh và gan Khoảng 1/3 số bệnh nhân Wilson lúc đầu có biểu hiện tâm thần bất thường Trẻ mắc bệnh Wilson thường bị giảm khả năng học tập, thay đổi nhân cách, bốc đồng, tâm trạng không ổn định, phô trương tình dục và hành vi bất thường (Ala và cs, 2007; Medicin và cs, 2006; Ferenci và cs, 2012) Các triệu chứng này thường bị chẩn đoán nhầm với các vấn đề về hành vi nhận thức liên quan đến lứa tuổi dậy thì Ở người lớn tuổi, biểu hiện tâm thần giống như hoang tưởng, tâm thần phân liệt hoặc trầm cảm, sự thay đổi về hành vi cũng rất phổ biến Ngoài ra, suy giảm nhận thức đã được quan sát thấy ở những bệnh nhân thể thần kinh tiến triển, nhưng nói chung, vấn đề nhận thức không bị ảnh hưởng rõ rệt Với

những biểu hiện phức tạp liên quan đến tâm thần, việc chẩn đoán bệnh trong những trường hợp này thường chậm trễ và khó khăn Những bệnh nhân có các biểu hiện tâm thần kinh có thể đồng thời bị bệnh gan, nhưng hầu hết bệnh nhân bị bệnh gan

có thể có hoặc không có biểu hiện của tâm thần, thần kinh và chỉ được phát hiện

nhờ các xét nghiệm cận lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh (Ferenci và cs, 2012)

1.5.1.5 Một số ảnh hưởng đến các cơ quan khác

Ngoài ảnh hướng đến gan và hệ thần kinh, sự lắng đọng đồng có thể ảnh hưởng tới nhiều cơ quan khác, bao gồm rối loạn nội tiết như: cường giáp, rối loạn kinh nguyệt, vô sinh, bệnh lý tim mạch, bệnh thận, bệnh xương, viêm khớp Bệnh nhân bị ảnh hưởng đến các cơ quan này chiếm 10%, trong đó 25% bệnh nhân Wilson có biểu hiện ảnh hưởng của bệnh trên ít nhất 2 cơ quan (Ala và cs, 2007; Pfeiffer, 2007; Lutsenko và cs, 2007)

- Tại mắt: Vòng KF có thể nhìn thấy được ở xung quanh mống mắt (Sullivan và

cs, 2002) và chỉ có thể nhìn thấy khi kiểm tra mắt bằng đèn khe (Ferenci và cs, 2012) Vòng KF có kích thước 1-2 mm, màu xanh nâu quanh giác mạc và ở vị trí mặt sau màng Descement Vòng KF hay gặp ở thể thần kinh (95% ) hơn thể gan (44-62%) và có thể có ở bệnh nhân không có triệu chứng (10%) (Ferenci, 2004; Ferenci và cs, 2012) Tuy nhiên, vòng KF không hoàn toàn đặc hiệu cho bệnh Wilson vì nó thường không xuất hiện ở tất cả các bệnh nhân và có thể được phát hiện trên bệnh nhân bị ứ mật mạn tính bao gồm cả trẻ em bị ứ mật sơ sinh (Curtis và

cs, 1999) Một số biểu hiện khác của bệnh Wilson liên quan đến mắt như đục thủy tinh thể, sự nhiễm sắc tố nâu hoặc xanh ở phía trước và phía sau thủy tinh thể

- Tại thận: Nhiễm toan ống thận là rối loạn hấp thu bicarbonate tại ống lượn xa dẫn tới sự lắng đọng canxi tại thận, làm yếu xương do mất canxi và phosphate, đôi khi bị protein niệu

- Tại tim: Bệnh cơ tim, gây suy tim, rối loạn nhịp tim

- Nội tiết: suy chức năng tuyến cận giáp (rối loạn chức năng tuyến cận giáp gây giảm canxi máu), vô sinh và thường sảy thai

1.5.2 Đặc điểm cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán và điều trị bệnh Wilson

1.5.2.1 Đặc điểm cận lâm sàng

- Ceruloplasmin huyết thanh: Ceruloplasmin là chất mang chính của đồng trong

máu nhưng cũng có thể tồn tại tự do như các protein khác (apoceruloplasmin) Ceruloplasmin huyết thanh của bệnh nhân Wilson thường thấp hơn 0,2 g/l Tuy nhiên, ceruloplasmin thường giảm mạnh ở bệnh nhân Wilson thể thần kinh, nhưng

có thể thấp hơn một nửa so với bình thường ở phần lớn bệnh nhân Wilson thể gan đang phát bệnh Ngược lại, ceruloplasmin có thể giảm trong các một số trường hợp liên quan đến bệnh thận hoặc thiếu protein ruột, hội chứng kém hấp thu hoặc bất kì các bệnh về gan trong giai đoạn cuối, hoặc bệnh nhân bị đột biến trên gen mã hóa ceruloplasmin nằm trên nhiễm sắc thể số 3 (Loudianos và cs, 1999; Ferenci và cs, 2012) Chỉ số ceruloplasmin huyết thanh giảm không đủ tiêu chuẩn chẩn đoán hoặc loại trừ bệnh Wilson (Ferenci và cs, 2012) Trong trường hợp này, chẩn đoán bệnh cần sự kết hợp của những triệu chứng thần kinh, vòng KF và cần phải làm thêm một

số xét nghiệm khác (Kusuda và cs, 2000)

- Đồng niệu/24 giờ: Lượng đồng bài tiết trong nước tiểu trong suốt 24 giờ (đồng niệu 24h) rất hữu ích cho chẩn đoán và trong suốt quá trình điều trị bệnh Wilson nhưng xét nghiệm này không được áp dụng cho các trường hợp suy thận Ở những bệnh nhân có triệu chứng không được điều trị, nếu lượng đồng trên 0,1 mg/24h sẽ

đủ tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh Wilson Tuy nhiên, khoảng 16-23% bệnh nhân có biểu hiện bệnh, đặc biệt ở trẻ em và anh chị em ruột của bệnh nhân không có triệu chứng, lượng đồng niệu cũng có thể nhỏ hơn 0,16 mg/24h Lượng đồng trong nước tiểu ở người bình thường không đáng kể Nếu trẻ em chưa có bất kì triệu chứng nào của bệnh có lượng đồng trong nước tiểu lớn hơn 0,64 mg/24h, những trường hợp này nên được sàng lọc bệnh Wilson Một số yếu tố ảnh hướng đến độ chính xác của đồng niệu/24h đó là không thu thập đủ lượng nước tiểu trong 24h hay nước tiểu bị ô nhiễm Đồng trong nước tiểu có thể tăng ở bệnh viêm gan tự miễn và bệnh ứ mật

hoặc ở người mang gen ATP7B bị đột biến dị hợp tử (Ferenci và cs, 2012) Ở trẻ

nhỏ, xét nghiệm penicillamin (500 mg) có thể được sử dụng khi kiểm tra đồng niệu trong 24 giờ Nếu lượng đồng trong nước tiểu trên 1,6 mg là chỉ số đáng tin cậy cho trong chẩn đoán bệnh Wilson Xét nghiệm này không có giá trị ở người lớn và không đáng tin cậy để loại trừ chẩn đoán cho anh, chị, em của bệnh nhân bị bệnh Wilson không có triệu chứng (Wan và cs, 2010)

- Đồng huyết thanh: Đồng trong máu của bệnh nhân Wilson giảm trong khi

đồng trong nước tiểu tăng và không phụ thuộc ceruloplasmin huyết thanh cao hay thấp Thậm chí, ở bệnh cảnh suy gan cấp tính do Wilson, lượng đồng trong máu có thể tăng rõ rệt do sự giải phóng đột ngột của kim loại này được dự trữ trong các mô gan Đồng không kết hợp với ceruloplasmin hay còn gọi là “đồng tự do” có thể tính được bằng cách lấy tổng số lượng ceruloplasmin huyết thanh trừ đi lượng đồng kết hợp với ceruloplasmin (Ferenci và cs, 2012)

- Đồng trong nhu mô gan: Sinh thiết gan được thực hiện để xác định lượng đồng

tích tụ trong nhu mô gan Để đảm bảo độ chính xác của xét nghiệm, dụng cụ sinh thiết, bảo quản và vận chuyển mẫu không được làm từ đồng Ngoài ra, độ chính xác của xét nghiệm đồng trong mẫu sinh thiết gan còn phụ thuộc vào kích thước mẫu,

và vị trí lấy mẫu vì sự phân bố không đồng nhất của đồng trong nhu mô gan Chiều dài của mẫu sinh thiết ít nhất là 1 cm Mẫu bọc parafin cũng có thể được dùng để định lượng đồng Lượng mẫu nhỏ thường cho kết quả không đáng tin cậy Lượng đồng trong mẫu sinh thiết gan khô trên 4 lmol/g được coi là bằng chứng sinh hóa tốt nhất trong chẩn đoán bệnh Wilson (Ferenci và cs, 2012)

- Sinh thiết gan: Sinh thiết gan chỉ thực sự cần thiết khi các dấu hiệu lâm sàng

và các xét nghiệm không xâm lấn không đủ để chẩn đoán bệnh Wilson, hoặc có nghi ngờ các bệnh lý gan khác Các bất thường mô học sớm nhất trong gan chẳng hạn như gan nhiễm mỡ, hoại tử tế bào gan thường nhầm sang bệnh gan nhiễm mỡ ở người không sử dụng cồn (nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) hoặc nonalcoholic steatohepatitis (NASH)) (Ludwig và cs, 1994; Ferenci và cs, 2012) Định lượng đồng trong mẫu sinh thiết gan nhạy và cho kết quả chính xác để chẩn đoán bệnh Wilson Ở người bình thường, lượng đồng từ 15 – 55 µg/g, bệnh nhân

mắc Wilson có lượng đồng trong cơ thể cao hơn 250 µg/g chiếm 83,3%; số còn lại thấp hơn 50 µg/g chiếm 3,5% (Ferenci và cs, 2012), ngay cả khi lượng đồng trong gan dưới 250 µg/g cũng không loại trừ bệnh Wilson (Ferenci và cs, 2005) Tuy nhiên, đồng trong gan tăng có thể do các bệnh về gan chẳng hạn như viêm gan mạn tính, xơ gan…(Ferenci và cs, 2012; Loudianos và cs, 1999)

- Chẩn đoán hình ảnh: Kết quả MRI và chụp cắt lớp vi tính có thể phát hiện

những bất thường về cấu trúc trong hạch nền Những phát hiện thường gặp nhất là tăng mật độ trên chụp cắt lớp vi tính hoặc tăng tín hiệu trên T2 trong vùng hạch nền khi chụp MRI (Ferenci và cs, 2012) Bệnh nhân Wilson thể thần kinh hầu như đều

có bất thường trên hình ảnh MRI chẳng hạn như giãn não thất, teo vỏ não (Kusuda

và cs, 2000)

- Xét nghiệm di truyền: Xét nghiệm di truyền cho bệnh nhân Wilson là phương

pháp đơn lẻ duy nhất được thực hiện trong chẩn đoán xác định bệnh Wilson theo

thang điểm Leipzig Nếu phát hiện được 1 đột biến dị hợp tử trên gen ATP7B có thể

hỗ trợ việc chẩn đoán bệnh, và phát hiện được 2 đột biến dị hợp tử hoặc 1 đột biến

đồng hợp tử trên gen ATP7B sẽ giúp chẩn đoán xác định bệnh Wilson (Ferenci và

cs, 2012) Phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhân Wilson không những có ý

nghĩa quan trọng trong chẩn đoán xác định bệnh Wilson mà còn có vai trò quan trọng trong sàng lọc đột biến đích cho các thành viên trong gia đình để phát hiện sớm người bị bệnh chưa có biểu hiện lâm sàng và tránh nguy cơ sinh con bi bệnh nhờ tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh (Ferenci và cs, 2012) Tuy nhiên, phương pháp này cần nhiều thời gian nếu chưa xác định được đột biến thường gặp hoặc đột biến chỉ điểm (Ferenci, 2005)

1.5.2.2 Điều trị

Bệnh Wilson là bệnh điều trị nội khoa rất hiệu quả, đặc biệt với những bệnh nhân chưa có triệu chứng lâm sàng Việc điều trị bệnh thường phụ thuộc vào biến chứng hoặc triệu chứng của bệnh (Roberts và cs, 2003) Nguyên tắc điều trị bệnh Wilson là thải đồng bằng cách sử dụng các chelate gắp đồng ra khỏi cơ thể (Ferenci, 2004) chẳng hạn như: D-penicillamine, trientine, zinc, tetrathiomolybdate, và

dimercaprol, kẽm (Liu và cs, 2017) Một số cách điều trị hỗ trợ khác bao gồm: Vitamin E, chế độ ăn kiêng, kiểm soát nguồn nước, các liệu pháp sinh lý… (Brewer, 2005; Ferenci và cs, 2012) Bệnh nhân chưa có triệu chứng được điều trị duy trì bằng kẽm (Ferenci, 2004) Kẽm cạnh tranh với đồng, ngăn cản sự hấp thụ đồng ở ruột non nhờ cảm ứng quá trình tổng hợp Metallothionein Các Metallothionein liên kết đồng có ái lực cao, tiếp theo đồng sẽ được ưu tiên thải ra ngoài theo phân (Fatemi và cs, 2002) Điều trị nội khoa hiếm khi có hiệu quả trong bệnh cảnh suy gan cấp và tối cấp, và một số khác do biến chứng của bệnh thần kinh tiến triển vì việc đào thải đồng dư thừa ra khỏi cơ thể cần một thời gian dài nhất định, ghép gan là cách duy nhất có thể cứu sống bệnh nhân trong những trường hợp này Gần đây, methanobactin, một loại vi khuẩn có mang protein liên kết đồng, có thể là một loại thuốc hiệu quả trong điều trị các bệnh gan nặng do Wilson (Erlinger, 2016) Điều trị bằng Chelate và ghép gan giúp kéo dài sự sống cho bệnh nhân và chưa đánh giá được tỷ lệ tử vong sau quá trình điều trị Tiên lượng bệnh phụ thuộc vào mức độ nghiêm trọng của bệnh cũng như sự tuân thủ y lệnh điều trị (Ferenci, 2006; Das và cs, 2006; Ferenci và cs, 2012)

1.6 PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN ATP7B BỊ ĐỘT BIẾN VÀ CHẨN ĐOÁN

TRƯỚC SINH

1.6.1 Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến

Mục tiêu của sàng lọc là phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến hay còn

gọi là người bình thường mang gen bệnh, từ đó có thể ước tính được nguy cơ sinh con mắc bệnh cho một cặp vợ chồng có mang gen bệnh, và cung cấp các thông tin cần thiết để phòng tránh được nguy cơ đó Ngoài ra, nguy cơ mắc bệnh của các anh chị em ruột của bệnh nhân là 25%, nguy cơ mang gen bệnh là 50% Các thành viên

trong gia đình có bệnh nhân Wilson nên được sàng lọc đột biến gen ATP7B đã được

phát hiện trên ca chỉ điểm mắc Wilson (Ferenci và cs, 2012) Trong số những người mang gen bệnh, mặc dù xét nghiệm sinh hóa của họ bình thường nhưng có đến 20% trong số họ có ceruloplasmin bị giảm nên nếu chỉ dựa trên các xét nghiệm truyền

thống thì không thể xác định được chính xác họ là người không có đột biến hay có đột biến (Michael và cs, 2009) Người mang gen bệnh là người truyền gen bị đột biến dị hợp tử cho các thế hệ tiếp theo (Ala và cs, 2007) Các con ở thế hệ tiếp theo của các thành viên này có nguy cơ mắc bệnh là 5%, nguy cơ này rất thấp nhưng họ vẫn có nguy cơ truyền gen bệnh cho các thế hệ tiếp theo Vì vậy, việc xác định người mang gen bệnh sẽ là cơ sở của tư vấn di truyền nhằm hạn chế tối đa khả năng sinh con mắc bệnh Wilson (Ferenci và cs, 2012)

Dựa trên quần thể sàng lọc, có thể có hai phương pháp: sàng lọc quần thể (Mass screening) và sàng lọc đích (Target screening) Sàng lọc quần thể được áp dụng cho một quần thể lớn nói chung tại thời điểm trước hoặc trong độ tuổi sinh đẻ, trong khi đó sàng lọc đích được áp dụng tập trung cho một quần thể nhất định nào

đó như các cặp vợ chồng sắp cưới, trước khi mang thai hoặc trong giai đoạn sớm của thai kỳ (Vrabelova và cs, 2005) Phương pháp sàng lọc quần thể cho bệnh

Wilson rất tốn kém vì gen ATP7B có kích thước lớn (Kumar và cs, 2012) Sàng lọc

đích chỉ có thể thực hiện cho các thành viên là anh, chị em của bệnh nhân Wilson với điều kiện bệnh nhân Wilson (ca chỉ điểm) trong gia đình đã được phát hiện đột biến (đột biến đích) Dựa trên kết quả xét nghiệm di truyền này, sàng lọc đích sẽ được tiến hành cho tất cả các thành viên có quan hệ huyết thống với bệnh nhân, nhằm phát hiện sớm những trường hợp bị bệnh nhưng chưa có triệu chứng cũng như những người bình thường ở trạng thái dị hợp tử (Ferenci và cs, 2012) Bởi chẩn đoán bệnh Wilson thông thường phải kết hợp các đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm sinh hóa Đôi khi kết quả các xét nghiệm này cũng không đặc hiệu, cho kết quả dương tính giả (Kenney và cs, 2007; Maleki và cs, 2013) và có thể bị nhầm lẫn với các bệnh khác, hoặc có thể bỏ sót các trường hợp chưa có biểu hiện đặc trưng của bệnh (Cosso và cs, 1992; Li và cs, 2011)

1.6.2 Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson

Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson thường được tiến hành cho các gia đình

đã có tiền sử sinh con bị bệnh đã xác định được đột biến gen ATP7B Nếu một cặp

vợ chồng đã sinh con bị bệnh Wilson hoặc được xác định là người mang gen bệnh,

họ có nguy cơ cao là những người sinh con mắc bệnh Wilson ở những lần sinh sau

Tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng cần được tiến hành để giải thích cho họ cơ chế di truyền và các phương pháp có thể được sử dụng để chẩn sớm kiểu gen cho thai nhi, hay gọi là chẩn đoán trước sinh

Chẩn đoán trước sinh cho thai nhi được thực hiện dựa trên phân tích đột biến đích do đó việc phát hiện đột biến nhanh và hiệu quả hơn (Zong và cs, 2015) Nguồn DNA phổ biến được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh được tách chiết từ mẫu dịch ối hoặc từ rau thai (Zong và cs, 2015).Trong chẩn đoán trước sinh, lấy được tế bào của thai và tách chiết được DNA của thai nhi đóng một vai trò quyết định Có hai phương pháp lấy mẫu để thực hiện xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán trước sinh là phương pháp có can thiệp và phương pháp không can thiệp Phương pháp có can thiệp được áp dụng rộng rãi hơn và được thực hiện dưới sự hướng dẫn của siêu âm, thường có tỷ lệ xảy thai từ 0,5-1% (Tongsong và cs, 1998) Mẫu bệnh phẩm khi sử dụng phương pháp này là dịch ối và gai rau Chọc ối được thực hiện ở tuần thai 16-18 tuần (de Jong và cs, 2011) Bất lợi chính của thủ thuật chọc ối là thời điểm chẩn đoán muộn, quá trình nuôi cấy dài Số lượng dịch ối đôi khi không đủ lượng DNA cần thiết cho chẩn đoán trước sinh nên cần phải nuôi cấy

tế bào dịch ối cho đến khi đủ lượng tế bào cần thiết, do vậy đã làm chậm thêm thời gian trả kết quả (Tabor và cs, 1986) Chẩn đoán trước sinh giúp gia đình bệnh nhân biết được tình trạng mang đột biến gen của thai nhi để tư vấn điều trị sớm ngay sau sinh hoặc có những quyết định phù hợp với từng gia đình

1.7 CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH BỆNH WILSON

1.7.1 Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger

Trình tự đoạn nucleotid quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger nhằm tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotid, kết thúc bởi các ddNTPs đã được đánh dấu huỳnh quang, các phân tử DNA được phân tách trong quá trình điện di mao quản (Kakavas và cs, 2008) Đối

với bệnh Wilson, phân tích trình tự ATP7B được thực hiện đầu tiên để phát hiện các

đột biến điểm và các các đột biến mất/lặp nucleotid hoặc đoạn nucleotid có kích thước ngắn Phân tích mục tiêu (targeted analysis) bằng kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp để phát hiện các đột biến gây bệnh cụ thể được thực hiện đầu tiên cho các

cá thể từ các quần thể khác nhau (Weiss và cs, 2016) Giải trình tự gen có thể phát hiện tất các loại đột biến và cho đến nay vẫn luôn là tiêu chuẩn vàng và tối ưu nhất

để phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson Hầu hết các nghiên cứu về bệnh Wilson đều áp dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp gen ATP7B Ưu điểm của phương pháp này là có thể phát hiện toàn bộ các đột biến trên gen ATP7B, có

độ chính xác và đặc hiệu cao (Fan và cs, 2000; Firneisz và cs, 2002; Park và cs, 2007; Zhang và cs, 2011; Malekivà cs, 2013; Dong và cs, 2016), đặc biệt là đối với những quần thể chưa xác định được đột biến thường gặp trên gen gây bệnh Những trường hợp chưa có triệu chứng của bệnh Wilson, bao gồm các anh chị em của ca chỉ điểm (đã được chẩn đoán xác định bệnh), có thể được phát hiện sớm bằng phương pháp giải trình tự gen Đây cũng là phương pháp duy nhất để xác định người mang gen bệnh, làm cơ sở cho tư vấn di truyền trước hôn nhân và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson (Kumar và cs, 2012)

Các thế hệ máy giải trình tự gen hiện đại, bao gồm: giải trình tự gen thế hệ thứ

2 (Next generation sequencing), giải trình tự toàn bộ exom (whole exome sequencing-WES), giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể (Whole mitochondrial sequencing-WMitoSeq) và giải trình tự toàn bộ trình tự hệ gen (Whole genome sequencing-WGS) có thể được xem xét nếu xét nghiệm đơn gen (và/hoặc sử dụng

một gen đa bảng điều khiển bao gồm cả gen ATP7B) nhưng vẫn chưa chẩn đoán xác

định được trường hợp nào có biểu hiện của bệnh Wilson bằng các kỹ thuật này (Weiss, 2016)

1.7.2 Một số phương pháp khác được dùng trong phát hiện đột biến gen

ATP7B

Nhiều kỹ thuật đã được ứng dụng trong phát hiện các đột biến gen và được ứng dụng trong chẩn đoán xác định cũng như chẩn đoán trước sinh các bệnh lý di