Nghiên cứu sản xuất cây giống hương thảo (rosmarinus officinalist l ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô 1

ÐẠI HỌC ÐÀ NẴNG TRƯỜNG ÐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH THỊ MỸ NHUNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalist L ) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số 8420114[.]

ĐINH THỊ MỸ NHUNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG

HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalist L.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Đà Nẵng, Năm 2022

Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Châu Tuấn

Có thể tìm luận văn tại:

Thư viện Trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN

Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, nhu cầu thị trường về cây thuốc và cây cảnh đang giatăng Người tiêu dùng đang hướng đến các sản phẩm có giá trị dinhdưỡng, dược liệu cao để nâng cao sức khỏe Bên cạnh những cây cógiá trị về làm thuốc, thì cây cảnh có mùi hương thơm, tạo cảm giácthoải mái cho người sử dụng đang rất được ưa chuộng

Cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) là một loài thực vật

có hoa thuộc họ Hoa môi, có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải Đây

là một loại cây được dùng thường xuyên trong cảnh quan và cácngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm (Mehrabani và cs, 2016).Khi trồng, cây tỏa ra mùi hương thơm ngát, dễ chịu, khuếch tán rộngtrong không khí Mùi hương của cây hương thảo giúp con người cótinh thần thoải mái, giải tỏa căng thẳng Ngoài ra, cây còn được sửdụng trong sản xuất nước hoa, dược liệu và là một loại gia vị, chấtchống oxy hóa trong chế biến thực phẩm (Dellacassa và cs, 1999;Porte và cs, 2000) Tinh dầu của cây hương thảo hỗ trợ tăng cườngtuần hoàn máu, giúp máu lưu thông tốt và cải thiện trí nhớ

Tại Việt Nam, cây hương thảo là một loài cây mới được nhậpnội và trồng ở một số tỉnh của miền Trung và miền Nam Nguồn câygiống đang được trồng tại Việt Nam chủ yếu từ hạt, tỉ lệ nảy mầm rấtthấp (10 - 20%) (Kiuru và cs, 2015) và phải nhập khẩu nên giá thànhcao Bên cạnh đó, cây giống hương thảo cũng được sản xuất giâmcành (Mehrabani và cs, 2016) Tuy nhiên, giâm cành hương thảo cho

hệ số nhân giống thấp, số lượng cây giống ít và cây giống có chấtlượng không cao Vì vậy vấn đề cần thiết đang đặt ra là phải tìm raphương thức sản xuất cây giống hương thảo hữu hiệu hơn để có thể

sản xuất cây hương thảo trên quy mô lớn nhằm đáp ứng nhu cầungày càng cao về nguồn dược phẩm, hương liệu và cây cảnh từ loàicây này.

Việc ứng dụng các tiến bộ khoa học kĩ thuật nhằm duy trì sự đadạng và phát triển bền vững các loài cây đã được thực hiện từ nhiềunăm nay ở các nước Công nghệ sinh học thực vật là một công cụ rấtquan trọng trong nhân giống và phát triển nhiều loài cây trồng có giátrị kinh tế cao Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật được xem

là phương thức có tiềm năng nhất để chọn lựa, nhân nhanh, bảo tồn

và phát triển các loại cây trồng có giá trị tại Việt Nam.Trong nhữngnăm qua, nhu cầu về cây hương thảo sử dụng trong dược liệu và câycảnh ngày càng cao, tuy nhiên việc nghiên cứu để sản xuất cây giốnghầu như chưa được quan tâm đúng mức

Xuất phát từ các cơ sở trên đây, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài: Nghiên cứu sản xuất cây giống hương thảo (Rosmarinus

officinalisL.) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Xây dựng được quy trình sản xuất cây giống hương thảo nuôicấy mô với hệ số nhân cao, chất lượng cây giống tốt

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được loại và nồng độ chất ĐHST thích hợp cho

nhân nhanh chồi, tạo rễ in vitro cây hương thảo.

- Xác định được điều kiện thích hợp để ươm trồng, tạo câygiống hương thảo nuôi cấy mô trong vườn ươm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp những dẫn liệu khoahọc về sản xuất cây giống hương thảo nuôi cấy mô, góp phần làmphong phú hơn cơ sở dữ liệu về kĩ thuật nhân giống để phát triển câydược liệu và cây cảnh.

- Là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho công tác giảng dạy,học tập và nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực công nghệ sinh học,sinh học, nông nghiệp

4 Bố cục đề tài

Luận văn gồm 3 chương:

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứuChương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây hương thảo

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây hương thảo

1.1.2 Giá trị sử dụng cây hương thảo

1.1.3 Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây hương thảo

1.2 Nghiên cứu nhân giống in vitro ở thực vật

1.2.1 Cở sở khoa học nhân giống in vitro

1.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro

1.2.3 Ưu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro

1.3 Tình hình nghiên cứu về cây hương thảo

1.3.1 Nghiên cứu ở Việt Nam

1.3.2 Nghiên cứu trên Thế Giới

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là cây hương thảo (Rosmarinus

officinalis L.) thuộc họ Hoa môi.

- Nguyên liệu nghiên cứu: Đoạn thân của chồi cây hương thảo

in vitro nảy mầm từ hạt, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Nuôi

cấy mô và tế bào thực vật, khoa Sinh - Môi trường, Đại học Sưphạm - Đại học Đà Nẵng

2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu nhân giống in vitro cây hương thảo tại Phòng

thí nghiệm Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, khoa Sinh - Môitrường, Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Nghiên cứu ươm

trồng cây hương thảo in vitro để tạo cây giống tại vườn ươm ở

Bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng

- Thời gian thực hiện: từ 7/2021 đến 6/2022

2.3 Nội dung nghiên cứu

+ Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây

hương thảo trong điều kiện phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo

rễ in vitro, hình thành cây con hoàn chỉnh.

+ Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất cây giống hương

thảo trong điều kiện vườn ươm tại Đà Nẵng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ươm trồng đến khả

năng sống sót của cây in vitro trong vườn ươm.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ươm trồng đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro trong vườn ươm.

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nhân chồi in vitro cây hương thảo từ đoạn thân

Hạt sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS để

hạt nảy mầm, tạo cây in vitro Sau 5 tuần nuôi cấy, cây in vitro nảy

mầm từ hạt được sử dụng làm nguyên liệu để tiến hành các nghiên

cứu nuôi cấy in vitro.

Đoạn thân có mắt lá (dài 0,5 cm) của cây in vitro (nảy mầm từ

hạt) được nuôi cấy trên môi trường MS nhân chồi có 3% sucrose;0,8% agar; có bổ sung các chất ĐHST khác nhau: BAP (0,25 – 2,0mg/L); KIN (0,25 – 2,0 mg/L); TDZ (0,25 – 2,0 mg/L); phối hợpgiữa BAP (0,5 – 2,0 mg/L ) và 0,5 mg/L NAA Đánh giá ảnh hưởng

của chất ĐHST đến khả năng tạo chồi in vitro thông qua các chỉ tiêu

sau: số chồi/mẫu, chiều dài chồi (cm), chất lượng chồi sau 2 thángnuôi cấy

2.4.2 Phương pháp nhân chồi in vitro cây hương thảo từ protocorm

Protocorm (1,5 tháng tuổi) hình thành từ đoạn thân của câyhương thảo được sử để làm nguyên liệu nhân nhanh chồi Cácprotocorm được tách ra thành các khối nhỏ khoảng 2 – 3 mm nuôicấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,8% agar; có bổ sung cácchất ĐHST khác nhau: BAP (0,5 – 2,0 mg/L); KIN (0,5 - 2 mg/L);

Đánh giá ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng phát sinh chồi in

vitro từ từ protocorm thông qua: tỉ lệ protocorm tạo chồi, số

chồi/protocorm sau 2 tháng nuôi cấy.

2.4.3 Phương pháp tạo rễ in vitro cây hương thảo

Sau thời gian nuôi cấy, các cụm chồi in vitro đạt yêu cầu về

chiều cao được chuyển sang môi trường ra rễ

Các chồi in vitro (cao khoảng 2-3 cm) được nuôi cấy trên môi

trường MS có 3% sucrose; 0,8% agar; bổ sung các chất ĐHST khácnhau: IBA (0,25 – 1 mg/L); NAA ( 0,25 – 0,75 mg/L); Đánh giá ảnh

hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo rễ in vitro thông qua thời

gian chồi ra rễ, số rễ/chồi, chiều dài rễ sau 4 tuấn nuôi cấy

Tất cả môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH=5,8, khử trùng

ở 1210C, áp suất 1atm, trong 20 phút Các mẫu nuôi cấy in vitro đặt

trong phòng nuôi có nhiệt độ 25 ± 20C; cường độ chiếu sáng 3000lux, thời gian chiếu sáng 16 h/ngày;

2.4.4 Phương pháp tạo cây giống hương thảo ngoài vườn ươm

Cây in vitro hoàn chỉnh, sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường ra

rễ thích hợp nhất (cây cao 5 cm, rễ dài 1 - 1,5 cm) được chuyển ratrồng trong vườn ươm tại Bán đảo sơn Trà - Đà Nẵng dưới các điềukiện ươm trồng khác nhau

Các chai lọ chứa các cây con in vitro được đặt trong vườn ươm

trong các khoảng thời gian khác nhau: 5, 7, 10, 15 ngày để làm thích

nghi cho cây in vitro với điều kiện tự nhiên Sau khi làm thích nghi, cây in vitro được lấy ra khỏi chai lọ nuôi cấy, rửa sạch agar và môi trường Để cây in vitro ráo nước, tiến hành ươm trồng cây hương thảo in vitro dưới các điểu kiện ươm trồng khác nhau trong vườn

ươm: cơ chất trồng, nước tưới, độ che sáng, dinh dưỡng

- Phương pháp tạo cơ chất trồng: Sử dụng các loại cơ chất khác

nhau như: Đất cát, xơ dừa, tro trấu, phân chuồng hoai mục Các cơ

chất được xử lý với chế phẩm Tricoderma để ức chế các vi sinh vật

gây bệnh trước khi phối trộn theo các công thức cơ chất trồng khác

nhau Cây in vitro được trồng trên các công thức cơ chất khác nhau.

Sau 2 tháng trồng, đánh giá khả năng sinh trưởng của cây con thôngqua tỉ lệ (%) cây sống; chiều cao cây

- Phương pháp tưới nước: Cây in vitro được trồng trên cơ chất

phù hợp Nước tưới được sử dụng là nguồn nước tự nhiên của Bánđảo Sơn trà Tưới nước theo cách tưới phun, thời gian tưới 3 phút,theo các công thức tưới: 1 lần/ngày; 2 lần/ngày; 1 lần/2 ngày Sau 2tháng trồng, đánh giá khả năng sinh trưởng của cây con thông quachiều cao cây, chất lượng cây con

- Phương pháp che sáng: Sử dụng lưới che sáng để tạo ra các

độ che sáng tư nhiên khác nhau: 30, 40, 50, 70% Cây in vitro được

ươm trồng dưới các độ che sáng khác nhau trong nhà lưới Sau 2tháng trồng, đánh giá khả năng sinh trưởng của cây con thông qua:chiều cao cây, chất lương cây con

2.4.5 Phương pháp xử lí số liệu

Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần Số liệu thực nghiệmđược tính toán và phân tích thống kê Ducan’s test (p <0,05) bằngchương trình SAS

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân chồi từ đoạn

thân cây hương thảo in vitro

3.1.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro

từ đoạn thân

Đoạn thân có mắt lá (dài 0,5 cm) của cây in vitro nảy mầm từ

hạt (5 tuần tuổi) được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA(0,25 – 2,0 mg/L)

Sau 2 tháng nuôi cấy, kết quả nghiên cứu cho thấy, trên môitrường MS có bổ sung BAP (0,25 – 2,0 mg/L) ảnh hưởng đến khả

năng tạo chồi in vitro hương thảo BAP ảnh hưởng mạnh đến sự

nhân lên về số lượng và chiều cao chồi Tăng nồng độ BAP (0,25-1,5

mg/L) thì số chồi in vitro phát sinh có xu hướng tăng (11,5 – 35,5

chồi/mẫu), số chồi cao nhất 35,5 chồi/mẫu khi nuôi cấy trên môitrường có BAP (1,5 mg/L); chồi khỏe, có màu xanh đậm Trên môitrường có 1,5 mg/l BA; chiều cao chồi đạt cực đại; đạt 2,70 cm, sau 2tháng nuôi cấy (Hình 3.1.) Tuy nhiên, khi tăng nồng độ BAP lên quá

cao (2,0 mg/L BAP) sẽ gây ức chế sự phát sinh chồi in vitro Số

lượng và chiều cao chồi giảm rõ rệt trên môi trường có bổ sung BAP(2,0 mg/L), chỉ đạt 30,5 chồi/mẫu và 2,5 cm chiều cao sau 2 thángnuôi cấy

Như vậy, khi nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự nhân

nhanh chồi in vitro cây hương thảo, môi trường nuôi cấy có 1,5 mg/L

BAP cho hệ số nhân chồi cao nhất 35,5 chồi/mẫu, sinh trưởng củacụm chồi tốt, chiều cao chồi đạt 2,70 cm sau 2 tháng nuôi cấy

3.1.2 Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vitro

từ đoạn thân

Đoạn thân có mắt lá (dài 0,5 cm) của cây in vitro nảy mầm từ

hạt (5 tuần tuổi) được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung KIN(0,25 – 2,0 mg/L) Sau 2 tháng nuôi cấy, kết quả nghiên cứu đượctrình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vitro

từ đoạn thân có mắt lá KIN

(mg/L)

Khả năng phát sinh chồi in vitro

Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, trên môi trường MS có bổ sung

KIN (0,25 – 2,0 mg/L) có ảnh hưởng đến sự tạo chồi in vitro hương

thảo; tuy nhiên, thấp hơn nhiều so với môi trường bổ sung BAP Khi

tăng nồng độ KIN (0,25 - 0,75 mg/L) thì số chồi in vitro tăng (5,5 –

12,6 chồi/mẫu), Số chồi đạt cao nhất là 12,6 chồi/mẫu; chiều caochồi đạt 1,72 cm trên môi trường có 0,75 mg/L KIN sau 2 thángnuôi cấy (Hình 2.2) Khi tăng nồng độ KIN lên 2,0 mg/L; sẽ gây ức

chế phát sinh chồi in vitro; số lượng và chiều cao chồi giảm rõ rệt

trên môi trường có bổ sung 2,0 mg/L KIN, chỉ đạt 4.4 chồi/mẫu và1,25 cm chiều cao sau 2 tháng nuôi cấy

3.1.3 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân chồi

in vitro từ đoạn thân

Chúng tôi bổ sung phối hợp giữa BAP (0,5 – 2,0 mg/L) vàNAA (0,5 mg/L) vào môi trường nuôi cấy nhân chồi Kết quả nghiêncứu được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân chồi

in vitrotừ đoạn thân có mắt lá Chất ĐHST

(mg/L)

Khả năng phát sinh chồi in vitro

mẫu

Chiều cao chồi (cm)

Chất lượng chồi

0,5 0,5 13,7b 1,72c Yếu1,0 0,5 17.3c 2,12b Tốt1,5 0,5 20,3a 2,44a Tốt2,0 0,5 14,5b 2,10b Khá

Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa với p<0,05

Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, trên môi trường MS có bổ sungBAP (0,5 – 2,0 mg/L) và 0,5 NAA đều có ảnh hưởng đến sự tạo chồi

in vitro hương thảo; Số chồi đạt cao nhất là 20,3 chồi/mẫu; chiều cao

chồi đạt 2,44 cm trên môi trường có 1,5 mg/L BAP và 0,5 mg/L sau

2 tháng nuôi cấy (Hình 2.3) Ở các nồng độ tổ hợp BAP và NAA

khác; phát sinh chồi in vitro thấp hơn; số lượng và chiều cao chồi

giảm rõ rệt trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/L BAP và 0,5 NAAchỉ đạt 413,7 chồi/mẫu và 1,72 cm chiều cao sau 2 tháng nuôi cấy,chồi sinh trưởng yếu.

3.1.4 Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân chồi in vitro

từ đoạn thân

Đoạn thân có mắt lá của cây in vitro được nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung TDZ nồng độ 0,25 - 1,5 mg/l Sau 2 thángnuôi cấy, kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân chồi in vitro

từ đoạn thân có mắt lá TDZ

(mg/ L)

Khả năng nhân chồi in vitro

Hình thái cụm chồi Tình trạng thể chồi

0,75 đến 1,5 mg/l thì khả năng xuất hiện chồi in vitro ít dần và có sự

hình thành mạnh mẽ của các thể protocorm; đặc biệt là trên môi

trường có 1,0 và 1,5 mg/L TDZ, mẫu đoạn thân nuôi cấy hình thànhchủ yếu dạng protocorm rất mạnh Như vậy, mẫu đoạn thân hươngthảo nuôi cấy để nhân nhanh chồi trên môi trường MS có bổ sungTDZ (0,25 – 1,5 mg/L); có khả năng tạo thể protocorm giống cácloài trong họ lan.

Như vậy, khi chúng tôi nuôi cây đoạn thân trên môi trường có

bổ sung TDZ, mẫu có xu hướng hình thành protocorm khi tăng nồng

độ TDZ; trên môi trường có 1,0-1,5 mg/L TDZ, khả năng hình thànhprotocorm rất tốt Kết quả này có thể gọi mở ra một con đường hữu

hiệu trong nhân nhanh in vitro cây hương thảo theo hướng phát sinh

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro

từ protocorm BAP

(mg/L)

Khả năng nhân chồi in vitro từ protocorm

Thời gian bắt đầu tạo

chồi (tuần)

Số chồi/mẫu protocorm

Chất lượng chồi

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, môi trường MS có bổ sung

1,0 -1,5 mg/L BAP; khả năng hình thành chồi in vitro từ thể

protocorm khá tốt; đạt 15,25 - 16,71 chồi/mẫu protocorm nuôi cấyban đầu

3.2.2 Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vtro

từ protocorm

Protocorm được tạo thành trên môi trường 1,0 mg/L TDZ sau

8 tuần nuôi cấy, được tách ra thành các khối nhỏ và cấy lên môi

trường tạo chồi in vitro có bổ sung KIN (0,5 – 2,0 mg/L) Kết quả

nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.6