Nghiên cứu sản xuất cây giống hương thảo (rosmarinus officinalist l ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro từ Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân chồi in vitro từ đoạn thân có mắt lá Bảng 3.6 Ảnh hư

ĐINH THỊ MỸ NHUNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG

HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalist L.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Đà Nẵng – 2022

ĐINH THỊ MỸ NHUNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG

HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalist L.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy

TS Võ Châu Tuấn, đã hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm luận văn Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trường Đại học Sư phạm – Đại học

Đà Nẵng đã giảng dạy cho tôi nhiều kiến thức cũng như kinh nghiệm nghiên cứu quý báu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu

Đà Nẵng, tháng 6 năm 2022

Đinh Thị Mỹ Nhung

LOI CAM DOAN

Toi cam doan day la cong trinh nghien cuu duqc chinh toi thl_rc hi�n duoi slJ huong d�n cua TS Vo Chau Tu�n

Cac s6 li�u, kSt qua neu trong lu�n van la trung thvc va chua tung duqc ai cong b6 trong b�t ky cong trinh nao khac

Da Nfmg, thcing 6 nam 2022

H9c vien

E>inh Thi My Nhung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

4 Bố cục đề tài 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây hương thảo 4

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây hương thảo 4

1.1.2 Giá trị sử dụng cây hương thảo 5

1.1.3 Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây hương thảo 7

1.2 Nghiên cứu nhân giống in vitro ở thực vật 9

1.2.1 Cở sở khoa học nhân giống in vitro 9

1.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro 11

1.2.3 Ưu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro 13

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro 14

1.3 Tình hình nghiên cứu về cây hương thảo 18

1.3.1 Nghiên cứu ở Việt Nam 18

1.3.2 Nghiên cứu trên Thế Giới 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Phạm vi nghiên cứu 21

2.3 Nội dung nghiên cứu 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Phương pháp nhân chồi in vitro cây hương thảo từ đoạn thân 23

2.4.2 Phương pháp nhân chồi in vitro cây hương thảo từ protocorm 23

2.4.3 Phương pháp tạo rễ in vitro cây hương thảo 23

2.4.4 Phương pháp tạo cây giống hương thảo ngoài vườn ươm 24

2.4.5 Phương pháp xử lí số liệu 25

3.1 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây hương thảo in vitro 26

3.1.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro từ đoạn thân 26

3.1.2 Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vitro từ đoạn thân 29

3.1.3 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân chồi in vitro từ đoạn thân 31

3.1.4 Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân chồi in vitro từ đoạn thân 32

3.2 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân chồi in vitro từ protocorm 35

3.2.1 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi từ protocorm 35

3.2.2 Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vtro từ protocorm37 3.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo rễ in vitro cây hương thảo 38

3.3.1 Ảnh hưởng của IBA đến sự tạo rễ in vitro hương thảo 39

3.3.2 Ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ in vitro 40

3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sống sót và sinh trưởng của cây in vitro trong điều kiện vườn ươm 41

3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian thích nghi đến khả năng sống sót của cây in vitro 42

3.4.2 Ảnh hưởng của loại giá thể trồng đến khả năng sinh trưởng của cây

NAA : naphthalene axit axetic

IBA : auxin Indole - 3 - butyric acid

PBLs: : protocorm like body

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm 22 Hình 3.1 Cụm chồi in vitro sinh trưởng trên môi trường MS có bổ

sung 1,5 mg/L BAP sau 2 tháng nuôi cấy

27

Hình 3.2 Cụm chồi in vitro sinh trưởng trên môi trường MS có bổ

sung 0,75 mg/L KIN sau 2 tháng nuôi cấy

30

Hình 3.3 Cụm chồi in vitro sinh trưởng trên môi trường MS có bổ

sung 1,5 mg/L BAP và 0,5 NAA sau 2 tháng nuôi cấy

32

Hình 3.4 Chồi in vitro và thể protocorm sinh trưởng trên các môi

trường có 1 mg/L TDZ sau 2 tháng nuôi cấy

33

Hình 3.5 Chồi in vitro hình thành từ protocorm sau 6 tuần nuôi cấy

trên môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BAP

36

Hình 3.6 Chồi in vitro hình thành từ protocorm sau 8 tuần nuôi cấy

trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L KIN

38

Hình 3.7 Chồi in vitro hình thành rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung 1,0 mg/L IBA

40

Hình 3.8 Chồi in vitro hình thành rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA

41

Hình 3.9 Sinh trưởng của cây con hương thảo nuôi cây mô trồng

trên cơ chất Xơ dừa: đất cát: phân chuồng hoai mục (1:1:1) trong vườn ươm sau 2 tháng

45

Hình 3.1 Sinh trưởng sau 2 tháng của cây con hương thảo in vitro

trong vườn ươm, tưới phun sương 2 lần/ngày

47

Hình 3.1 Sinh trưởng của cây con hương thảo nuôi cây mô được

ươm trồng độ che sáng 30%; trong vườn ươm sau 2 tháng

48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro từ

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân chồi in

vitro từ đoạn thân có mắt lá

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vitro từ

protocorm sau 8 tuần nuôi cấy

37

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ in vitro 39 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro 40 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian thích nghi đến khả năng sống

sót của cây in vitro trồng trong điều kiên vườn ươm

42

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của giá thể trồng đến khả năng sinh trưởng

của cây in vitro trồng trong điều kiên vườn ươm

44

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của chế độ nước tưới đến khả năng sinh

trưởng của cây in vitro trồng trong điều kiên vườn ươm

46

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của độ che sáng đến khả năng sinh trưởng

của cây in vitro trồng trong điều kiên vườn ươm

48

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, nhu cầu thị trường về cây thuốc và cây cảnh đang gia tăng Người tiêu dùng đang hướng đến các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng, dược liệu cao để nâng cao sức khỏe Bên cạnh những cây có giá trị về làm thuốc, thì cây cảnh có mùi hương thơm, tạo cảm giác thoải mái cho người sử dụng đang rất được ưa chuộng

Cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) là một loài thực vật có hoa

thuộc họ Hoa môi, có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải Đây là một loại cây được dùng thường xuyên trong cảnh quan và các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm (Mehrabani và cs, 2016) Khi trồng, cây tỏa ra mùi hương thơm ngát, dễ chịu, khuếch tán rộng trong không khí Mùi hương của cây hương thảo giúp con người có tinh thần thoải mái, giải tỏa căng thẳng Ngoài

ra, cây còn được sử dụng trong sản xuất nước hoa, dược liệu và là một loại gia vị, chất chống oxy hóa trong chế biến thực phẩm (Dellacassa và cs, 1999; Porte và cs, 2000) Tinh dầu của cây hương thảo hỗ trợ tăng cường tuần hoàn máu, giúp máu lưu thông tốt và cải thiện trí nhớ

Tại Việt Nam, cây hương thảo là một loài cây mới được nhập nội và trồng

ở một số tỉnh của miền Trung và miền Nam Nguồn cây giống đang được trồng tại Việt Nam chủ yếu từ hạt, tỉ lệ nảy mầm rất thấp (10 - 20%) (Kiuru

và cs, 2015) và phải nhập khẩu nên giá thành cao Bên cạnh đó, cây giống hương thảo cũng được sản xuất giâm cành (Mehrabani và cs, 2016) Tuy nhiên, giâm cành hương thảo cho hệ số nhân giống thấp, số lượng cây giống ít

và cây giống có chất lượng không cao Vì vậy vấn đề cần thiết đang đặt ra là phải tìm ra phương thức sản xuất cây giống hương thảo hữu hiệu hơn để có thể sản xuất cây hương thảo trên quy mô lớn nhằm đáp ứng nhu cầu ngày

càng cao về nguồn dược phẩm, hương liệu và cây cảnh từ loài cây này

Việc ứng dụng các tiến bộ khoa học kĩ thuật nhằm duy trì sự đa dạng và phát triển bền vững các loài cây đã được thực hiện từ nhiều năm nay ở các nước Công nghệ sinh học thực vật là một công cụ rất quan trọng trong nhân giống và phát triển nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế cao Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật được xem là phương thức có tiềm năng nhất để chọn lựa, nhân nhanh, bảo tồn và phát triển các loại cây trồng có giá trị tại Việt Nam.Trong những năm qua, nhu cầu về cây hương thảo sử dụng trong dược liệu và cây cảnh ngày càng cao, tuy nhiên việc nghiên cứu để sản xuất cây giống hầu như chưa được quan tâm đúng mức

Xuất phát từ các cơ sở trên đây, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

Nghiên cứu sản xuất cây giống hương thảo (Rosmarinus officinalis L.)

bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Xây dựng được quy trình sản xuất cây giống hương thảo nuôi cấy mô với hệ số nhân cao, chất lượng cây giống tốt

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được loại và nồng độ chất ĐHST thích hợp cho nhân nhanh

chồi, tạo rễ in vitro cây hương thảo

- Xác định được điều kiện thích hợp để ươm trồng, tạo cây giống hương thảo nuôi cấy mô trong vườn ươm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về sản xuất cây giống hương thảo nuôi cấy mô, góp phần làm phong phú hơn cơ

sở dữ liệu về kĩ thuật nhân giống để phát triển cây dược liệu và cây cảnh

- Là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho công tác giảng dạy, học tập

và nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực công nghệ sinh học, sinh học, nông nghiệp

4 Bố cục đề tài

Luận văn gồm 3 chương:

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây hương thảo

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây hương thảo

Hương thảo, cái tên Rosmarinus được đặt theo tiếng Latin, trong đó

Ros nghĩa là sương, marinus có nghĩa là biển, gọi đầy đủ là Sương của biển, ý

nói về nguồn gốc của loại cây này là trên bờ biển vùng Địa Trung Hải Sau

này cây được trồng nhiều ở Bắc Phi, Tây Á và Nam châu Âu Ở nước ta được

trồng nhiều ởmiền Nam và miền Trung Khi trồng hương thảo tỏa ra mùi

hương thơm ngát, mùi tinh dầu cực thơm và dễ chịu Mùi thơm của hương

thảo có thể khuyếch tán trong phòng rộng 15 m2 vẫn ngửi thấy Mùi thơm cây

hương thảo có thể giúp tinh thần thoải mái, giải tỏa stress nhanh nhất, giúp

chống buồn ngủ đối với nhân viên văn phòng hoặc đối với phụ nữ sau sinh

con thì tinh dầu của hương thảo sẽ làm cho các mẹ thấy thoải mái thư giãn

hơn khi chăm sóc con nhỏ và gia đình

Theo Kohler (1887) trong cuốn cây cỏ làm thuốc: Cây hương thảo xuất

xứ từ vùng Địa Trung Hải, là dạng cây thân gỗ, thẳng đứng có phân cành,

chiều cao cây có thể đạt từ 1,5 – 2 m Lá thường màu xanh ở trên, phần dưới

lá trắng giống như có lớp phấn lốm đốm bao phủ, chiều dài lá 2 – 4 cm và

rộng 2 – 5 mm Hoa có màu trắng, hồng, tím hoặc màu xanh Hương thảo

mọc thành bụi, lá kim và xung quanh năm thưởng nở hoa vào 2 mùa xuân và

hạ Hương thảo nở hoa nhỏ li ti màu tim tím, xinh xắn nhẹ nhàng như tên gọi

“hương thảo” Cây thuộc họ bạc hà, mùi thơm thoang thoảng hương cay

Cây hương thảo dễ dàng trồng và chăm sóc Đất trồng hương thảo đòi

hỏi phải tơi xốp, thoáng nước, tốt nhất là trồng trên đất cát pha Cây thích hợp

trồng ở nơi có nhiều ánh sáng (ít nhất phải 6 – 8 giờ có ánh sáng mặt trời),

phát triển mạnh trong môi trưởng ẩm, không thể chịu được nhiệt độ quá lạnh (hương thảo không thể chịu được mùa đông dưới -10C) Cây có khả năng chịu hạn nhưng không chịu được úng nước

Ngoài ra hương thảo mới trồng cần được tưới nước thường xuyên trong tuần đầu tiên hoặc tuần thứ 2 để giúp nó phát triển, nhưng sau khi đã thích nghi cây cần được tưới ít nước hơn trong giai đoạn phát triển cây có thể chịu được điều kiện khô hạn trong thời gian dài Cây thường bị thối rễ và sẽ chết trong môi trường quá ẩm ướt Do đó, những nơi trồng hương thảo người ta thường chọn cách trồng cây trong các thùng, khay hoặc chậu Cây trồng trên các vật dụng này có thể đặt cách mặt đất một khoảng không gian để cây có thể thoát nước nhanh khi tưới, không duy trì độ ẩm cao dưới rễ cây và khi mùa đông đến có thể duy chuyển vào nơi tránh lạnh

1.1.2 Giá trị sử dụng cây hương thảo

- Giá trị văn hóa

Hương thảo nói đến lòng trung thành, tình yêu và trí nhớ, tượng trưng cho tình yêu phụ nữ vững bền, mạnh mẽ dù rằng tình yêu đến chậm Ngày xưa, các chàng trai Hy Lạp thường tặng lá hương thảo cho người mình yêu Hiện nay, tại Anh cũng như tại vài xứ ở châu Âu, cô dâu trong ngày cưới vẫn còn dắt lên tóc lá hương thảo Các bác sĩ thời La Mã khuyên bệnh nhân buộc một bó hương thảo đặt dưới gối khi cần phải quyết định, suy nghĩ những việc khó khăn Từ thời xưa, người cổ đại của nhiều nền văn hóa khác nhau coi hương thảo là một loại cây thiêng liêng, có thể kết nối sự sống và cái chết Người Hy Lạp và người La Mã đốt lá hương thảo tại các đền thờ và xem hương thảo như là biểu tượng của sự tri ân và ghi nhận lòng trung thành Trong suốt thời trung cổ, người ta đeo vòng hoa hương thảo để mang lại may mắn và bảo vệ họ khỏi những linh hồn ma quỷ, ma thuật và phù thủy Hương thảo cũng giúp bảo vệ chống lại bệnh dịch và các bệnh truyền nhiễm Người

Anh đeo hương thảo xung quanh cổ họ để ngăn ngừa cảm lạnh hoặc bao bọc xung quanh cánh tay phải họ để nâng cao tinh thần Ở Hoa Kỳ, người người còn trồng hương thảo trong sân vườn gia đình vừa để làm cảnh, vừa để sử dụng như một loại gia vị trong các món ăn

- Giá trị thực phẩm, tạo hương liệu

Ngày nay, hương thảo là một loại thảo dược ẩm thực phổ biến được sử dụng trong nhiều món ăn ngon Lá tươi và khô thường được sử dụng trong các món ăn truyền thống ở Địa Trung Hải Trong cây hương thảo có hương vị cay, se và rất thơm, được bổ sung vào nhiều loại thực phẩm Khi bị đốt cháy,

lá cây tạo ra một mùi mù tạt riêng biệt, mùi tương tự như gỗ đốt, có thể sử dụng làm gia vị để ướp thực phẩm khi làm món nướng Cây hương thảo tươi không thể cung cấp một cách dễ dàng cho tất cả các địa điểm trên toàn thế giới Tuy nhiên, cây khô mất chất lượng chậm, làm cho việc lưu trữ và vận chuyển dễ dàng hơn so với cây tươi

- Giá trị trong y học

Hương thảo là một loại thảo dược có nhiều công hiệu với sức khỏe Cây được sử dụng như một loại thuốc đông y với các tác dụng chống viêm, chống béo phì, điều trị bệnh đau dạ dày, rối loạn tiêu hóa, chống lại tình trạng

co giật cơ dẫn đến co rút các bắp thịt sau mỗi lần gắng sức tập thể thao, làm

ấm cơ thể, giúp cân bằng trí óc, giảm căng thẳng, làm tươi mát không khí và còn có tác dụng chống muỗi

Trong y học dân gian, các bộ phận của cây Hương thảo chủ yếu được dùng để uống có tác dụng chống viêm, đau đầu, đau bụng, chống co thắt, viêm khớp, bệnh gút, dạ dày, chữa lành vết thương, lợi tiểu, giảm đau, chống thấp khớp và là thuốc trầm cảm (Holmes, 1999; Martínez và cs, 2012; Karakurum và cs, 2014; Sasikumar, 2012)

Chiết xuất Hương thảo có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn so với chất oxy tổng hợp butylated hydroxyanisole, trolox và axit ascorbic Hơn nữa, axit carnosic và axit rosmarinic có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với hydroxytoluene butylated và α-tocophenol (Romano và cs, 2009) Họ Lamiaceae có các hợp chất quan trọng để sản xuất phụ gia thực phẩm và có thể được sử dụng không chỉ cho hương vị thực phẩm mà còn để cải thiện chất lượng tổng thể của sản phẩm và kéo dài thời hạn sử dụng của thực phẩm

Hợp chất dễ bay hơi chẳng hạn như 1,8-cineol, long não và α-Pinene của cây thơm này cũng cho thấy sự nổi bật về hoạt động chống đông máu, chống ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt (Hussain và cs, 2010)

1.1.3 Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây hương thảo

Thành phần hóa học của Hương thảo cho thấy sự hiện diện của nhiều chất có chất chống oxy hóa và các hoạt động chống lipoperoxidant đã được chứng minh, cụ thể là axit rosmarinic (RA), acid caffeic (CA), acid chlorogenic, axit carnosolic, rosmanol, carnosol và diterpenes khác nhau, rosmari-diphenol, rosmariquinonevà nhiều chất chống oxy hóa tự nhiên khác Dầu hương thảo có chứa este (2-6%) chủ yếu là borneol, cineoles và một số tecpen (al- Sereiti và cs, 1999)

Trong số các hợp chất này, CA và RA trở thành tâm điểm của sự chú ý của các nhà nghiên cứu là tác nhân điều trị tiềm năng RA là este của CA và axit 3,4- dihydroxyphenyllactic và được xác định rộng rãi trong các loài thực vật khác nhau RA là một hợp chất có bản chất là polyphenol có khả năng kháng khuẩn, chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa, chống dị ứng, viêm khớp, hen suyễn…và một số nghiên cứu bước đầu cho thấy nó có tác dụng trong điều trị bệnh Alzheimer Trong công nghiệp thực phẩm, RA là thành phần có vai trò ngăn ngừa và hỗ trợ chữa dị ứng, viêm loét dạ dày, là chất bảo

quản tự nhiên, chất chống oxi hóa có thể kéo dài thời gian bảo quản hải sản tươi sống, một số sản phẩm lên men, là gia vị cần thiết trong nhiều món ăn ( Trần Hoàng Quyên, 2010) Hoạt động chống oxy hóa của RA mạnh hơn so với vitamin E

Axit carnosic là một chất chống oxy hóa tự nhiên, được sử dụng rộng rãi thực phẩm, y sinh học ngành công nghiệp, ngành công nghiệp mỹ phẩm Là một phụ gia thực phẩm, chất tạo màu tự nhiên tạo ra màu xanh lá cây Lipton S A và Cs thuộc Viện Nghiên cứu Y học Sanford-Burnham cho rằng axit carnosic - một thành phần có trong cây Hương thảo - axit carnosic có thể có những ứng dụng lâm sàng cho bệnh ảnh hưởng đến võng mạc, bao gồm thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi, các bệnh về mắt Axit carnosic bảo vệ võng mạc khỏi thoái hóa và tổn thương ánh sáng gây ra trong nuôi cấy tế bào và trong các mô hình động vật gặm nhấm Trong vài năm, nhóm của Lipton đã phát hiện axit carnosic chống tổn thương các gốc

tự do trong não Lipton và các đồng nghiệp đã thử nghiệm axit carnosic trong một mô hình động vật bị tổn thương thụ thể cảm nhận ánh sáng - là phần mắt chuyển ánh sáng thành tín hiệu điện tử, cho phép nhìn mọi vật Nghiên cứu cho thấy rằng loài gặm nhấm được điều trị trước bằng axit carnosic đã lưu giữ lớp võng mạc của mắt dày hơn, chứng tỏ các thụ thể cảm nhận ánh sáng đã được bảo vệ ( Lipton và cs, 2012)

Axit ursolic là triterpenoid pentacyclic, có trong các loại trái cây và rau quả khác nhau Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng axit ursolic có tác động chống ung thư, tác dụng chống viêm, và cảm ứng apoptosis trong một số tế bào ung thư ở người Đặc biệt, axit ursolic ức chế sự phát triển ung thư vú bằng cách gây di động G1/G2 bắt giữ và điều chỉnh sự biểu hiện của protein quan trọng trong con đường truyền tín hiệu (Yin và cs, 2016)

1.2 Nghiên cứu nhân giống in vitro ở thực vật

1.2.1 Cở sở khoa học nhân giống in vitro

Nuôi cấy in vitro hiện đang được sử dụng như một công cụ để nghiên

cứu các vấn đề cơ bản trong khoa học thực vật Hiện nay, có thể thực hiện với tất cả các cây có giá trị kinh tế với số lượng lớn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các

bộ phận tách rời khác nhau của thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học (Lê Văn Hoàng, 2007)

Thuật ngữ nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống được sử

dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện khử trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác (Lê Văn Hoàng, 2007) Mặc dù chi phí đầu tư ban đầu cao, nhưng mang lại hiệu quả rất lớn cho sản xuất Tạo ra chính xác số lượng chồi tái sinh, từ đó tạo tiền đề để nhân nhanh số lượng cây trưởng thành một cách nhanh chóng, giúp tạo ra các loại hoa, quả sạch bệnh, chất lượng cao và

có những tính trạng mong muốn khác

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro

và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực

vật trong điều kiện khử trùng Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (Trần Văn Minh, 1994) Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh

cắt nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân giống khác là cutting (cành giâm), layer (cành

chiết), scion (cành ghép) hoặc seed (hạt) (Trần Văn Minh, 1994)

Haberlant (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy

mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào Theo ông mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm năng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh (Nguyễn Như Khanh, 2002) Như vậy, mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh (Nguyễn

Như Khanh, 2002) Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro được thực hiện dựa

trên tính toàn năng của tế bào, được thể hiện khi nuôi cấy mô và các tế bào riêng biệt, trong môi trường thích hợp thì có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh, đặc trưng cho loài và có thể phát triển bình thường Do trong nhân tế bào có chứa bộ ADN hoàn chỉnh chứa toàn bộ thông tin di truyền cho một chu kì sống hoàn chỉnh

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào in vitro là kết quả

của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào (Nguyễn Như Khanh, 2002) Trong đó, tính phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau Trong cơ thể thực vật khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhận các chức năng khác nhau (mô giậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn phân hóa để hình thành các mô riêng biệt (Nguyễn Như Khanh, 2002)

Tính phản phân hóa của tế bào: tế bào khi đã được phân hóa thành các

mô có chức năng riêng biệt, nhưng trong những điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay lại trạng thái phôi sinh và phân chia tế bào mạnh mẽ (Nguyễn Như Khanh, 2002) Trên thực tế đã chứng minh khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài cây trồng đã

được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây (Nguyễn Như Khanh, 2002) Trong kĩ thuật nuôi cấy cơ quan dinh dưỡng của cây như thân,

rễ, lá… thì giai đoạn tạo mô sẹo (callus) chính là những tế bào đã quay trở lại trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của

cơ quan sinh dưỡng (Vuylsteke, 1990) Tùy vào từng tế bào, từng mô, từng

thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (cơ chế

điều hòa hoạt động của gen) (Vuylsteke, 1990)

Về bản chất của sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa gen

Do thông tin về vị trí của tế bào, tương quan dinh dưỡng và tương quan hormone quy định Trong đó quan trọng nhất là thông tin về vị trí của tế bào, khi nằm trong một cơ thể các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, khi được tách rời

và trong điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hóa dễ dàng hơn Đó là cơ

sở nền tảng cho việc nuôi cấy mô, tế bào (Nguyễn Như Khanh, 2002)

1.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro

* Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn quan trọng, quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in

vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống

cao, mẫu tồn tại vô trùng và sinh trưởng tốt

Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hóa chất khử trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5 – 10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5 – 7% xử

lý trong 15 – 20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br2…

* Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy mô

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy.Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy.Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962); Chất hữu cơ: đường sarcaroza; Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit; Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Cytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3) (Trần Văn Minh, 1994)

* Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi, cụm chồi

Đây là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất Mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong thời gian nhất định nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển và tạo cây con hoàn chỉnh tiếp theo Mẫu tái sinh được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin để tái sinh từ một chồi thành nhiều chồi, cụm chồi Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong ống nghiệm.Và quan trọng là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp

để có hiệu quả cao nhất Chế độ nuôi cấy thường là 25 - 27°C và 16 giờ chiếu sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000 – 4000 Lux, ánh sáng tím là thành quan trọng để kích thích phân hóa chồi (Weiss và Jaffe, 1969) Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối… (Trần Văn Minh, 1994)

* Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Kết thúc quá trình nhân nhanh chồi thì sẽ có được một lượng chồi lớn nhưng lại chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có rễ Cần chuyển từ môi trường nhân nhanh chồi sang môi trường tạo rễ Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trường nhóm auxin Trong giai đoạn này, nồng độ cytokinin được giảm xuống và tăng nồng độ auxin nhằm kích thích sự hình thành rễ Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng hoặc môi trường chứa cytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh (Trần Văn Minh, 1994)

* Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn cây được chuyển từ cây in vitro ở trạng thái sống dị

dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng và tự thích nghi với điều kiện ngoài

tự nhiên

Trước khi đưa cây in vitro ra ngoài tự nhiên cần phải lựa chọn những cây

đã đạt những hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây…); phải có thời gian để cây thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh; và phải

có giá thể thích hợp để tiếp nhận cây in vitro Phải chủ động điều chỉnh được

độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như chế độ chiếu sáng thích hợp (Trần Văn Minh, 1994)

1.2.3 Ưu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro

* Những ưu điểm

Theo Nguyễn Đức Thành (2000), ưu điểm của nhân giống in vitro

- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành một số lượng

lớn cây giống từ một mô, cơ quan có kích thước nhỏ 0,1 – 10 mm

- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sạch bệnh

- Sử dụng vật liệu sạch virus có khả năng nhân được các giống sạch bệnh

- Có khả năng điều chỉnh các tác nhân ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây như thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, các chất điều hòa sinh trưởng… theo

- Có thể bảo quản cây giống in vitro trong một thời gian dài nếu chưa sử

dụng (Lê Văn Hoàng, 2007)

* Những hạn chế

Vì cây giống được cung cấp nguồn dinh dưỡng nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các chất hữu cơ kém Cây giống được nuôi trong bình thủy tinh có độ

ẩm bão hòa, nên khi trồng dễ mất cân bằng nước, gây ra hiện tượng héo rũ Vì

vậy, cây giống in vitro đưa ra trồng tự nhiên cần qua giai đoạn thích nghi để

quen dần với điều kiện tự nhiên (Phạm Thị Thanh Huyền và cs, 2014)

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro

* Môi trường nuôi cấy

Chất dinh dưỡng được cung cấp cho tế bào thực vật trong nuôi cấy in

vitro lấy từ môi trường nuôi cấy Thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo mỗi loài cây, bộ phận nuôi cấy, thậm chí mỗi kiểu gen

và mục đích nuôi cấy (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt phấn) Các môi trường khoáng cơ bản thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là MS (1962), B5 (1968), SH (1972) hoặc White (1963) (Trần Văn Minh và Nguyễn Văn Uyển, 2001).Vì vậy, vấn đề lựa chọn

môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của

hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng

- Nguồn cacbon

Nguồn cacbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, nguồn cacbon bổ sung vào môi trường ở dạng đường (Nguyễn Văn Uyển, 1993) Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, đường được xem là nguồn cung cấp carbon quan trọng giúp các tế bào phân chia, tăng sinh khối Hai dạng thường được sử dụng nhất là saccharose và glucose, nhưng saccharose phổ biến hơn Saccharose là cacbonhydrate phổ biến nhất trong vỏ cây và nhựa cây tham gia trong việc kiểm soát quá trình phát triển (Bhadra và Hossain, 2003; Gibson, 2000)

- Dinh dưỡng hữu cơ

Có thành phần không xác định như dịch chiết nấm men, nước dừa… được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1994.Trong nước dừa thường chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, ARN và DNA Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính auxine, các gluxid của cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

- Các chất ĐHST ở thực vật

Chất ĐHST thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng

và phát triển của thực vật, có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc những chất được tổng hợp nhân tạo

Việc bổ sung một hoặc nhiều chất ĐHST như auxin, cytokinin, … là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan, cung

cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu của những chất này thay đổi theo từng loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất ĐHST nội sinh của chúng (Lê Văn Hoàng, 2007)

+ Nhóm auxin

Các chất nhóm auxin có tác động thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của

tế bào, tăng cường các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA IAA có tác dụng ĐHST kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ NAA và 2,4-D cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình tạo rễ IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus

và kìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy tại nồng độ cao Mặc

dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất này lại có tính chất đối kháng NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra Chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nito, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy (Nguyễn Văn Uyển, 1984)

+ Nhóm cytokinin

Cytokinin là chất ĐHST có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, sự

hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro, cảm ứng sự sinh trưởng của chồi

bên và loại bỏ ưu thế đỉnh Các cytokinin thường gặp là BA, KIN KIN được Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic KIN là dẫn xuất của base nito adenin BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn KIN BA và KIN có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào (Nayak NR và cs, 1997) Tùy vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau Ở nồng độ thấp (10-7 – 10-6

M), chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6 – 10-5 M kích thích sự phân hóa chồi.Trong nuôi cấy mô, để kích thích sự nhân nhanh người

ta thường sử dụng cytokinin với nồng độ 10-6 – 10-4 M (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

+ Gibberellin

Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan trọng nhất

là GA3 GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ (Street, 1973) Ngoài ra, nó còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây

* Điều kiện nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các yếu tố của môi trường vật lý

được quan tâm đó là ánh sáng và nhiệt độ

- Ánh sáng

Ánh sáng tác động lên sự phát sinh cơ quan và hình thành chồi của quá trình tái sinh, quá trình hình thành mô sẹo, phôi đều chịu ảnh hưởng của ánh

sáng (Ouyang và cs 2003) Với đa số các loài thực vật, thời gian chiếu sáng

thích hợp là 8 – 12 giờ/ ngày Cường độ ánh sáng ảnh ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986) Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy lá từ 1000 – 7000 lux (Moresin,1974) Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt

tới sự sinh trưởng của mô sẹo Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux Trong phòng thí nghiệm hay sử dụng đèn huỳnh quang với cường độ 2000 –

1.3 Tình hình nghiên cứu về cây hương thảo

1.3.1 Nghiên cứu ở Việt Nam

Cây hương thảo là một loài cây mới được nhập khẩu vào nước ta, nên hiện nay các tài liệu nghiên cứu còn rất hạn chế Việc nghiên cứu phát triển cây hương thảo và các loại cây dược liệu đáp ứng nhu cầu thực tiễn là việc rất cần thiết Tuy nhiên hạt giống nhập từ nước ngoài về có khả năng nảy mầm kém ở điều kiện Việt Nam, do vậy nhân giống cây hương thảo – một loài cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đáp ứng nguồn cung cấp cây giống cung cấp cho thực tiễn phát triển loại cây dược liệu này

Năm 2016, Phạm Thùy Dung đã nghiên cứu nhân giống cây hương thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật Khử trùng hạt hương thảo trong 5 giờ bằng khí clo là tốt nhất Môi trường thích hợp cho sự phát sinh và sinh trưởng của chồi hương thảo từ đoạn thân mang mắt chồi bên là: MS + saccarose 30 g/l + agar 6.0 g/l + BAP 1.5 mg/l + IBA 0.7 mg/l Môi trường MS cơ bản + saccarose 30 g/l + agar 6.0 g/l + NAA 0.3 mg/l là thích hợp cho sự tạo rễ của

chồi cây hương thảo Giá thể phù hợp cho giai đoạn chuyển cây hương thảo in

vitro trong vườn ươm là đất thịt trung bình + trấu hun theo tỉ lệ 2:1

Năm 2018, Phạm Thị Minh Tâm và Nguyễn Thị Bích Phượng đã nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng và nồng độ đạm đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hương thảo trồng trong chậu Kết quả chỉ ra rằng cây hương thảo sinh trưởng và phát triển tốt khi cây được trồng trên giá thể gồm 30% phân trùn quế + 35% cát + 17,5% tro trấu + 17,5% mụn dừa và tưới đạm ở nồng độ 100 ppm áp dụng chế độ tưới nhỏ giọt tại thành phố Hồ Chí Minh Bước đầu nên trồng cây hương thảo trên giá thể gồm 30% phân trùn quế + 35% cát + 17,5% tro trấu + 17,5% mụn dừa và tưới đạm nồng độ 100 ppm qua hệ thống tưới nhỏ giọt tại thành phố Hồ Chí Minh (Nguyễn Thị Minh Tâm và cộng sự, 2018)

1.3.2 Nghiên cứu trên Thế Giới

Năm 2012, Yumei và cs đã nghiên cứu cảm ứng mô sẹo và tái sinh chồi

từ lá hương thảo trong môi trường MS có bổ sụng 0,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA và 50 g/l đường cho kết quả tốt nhất, với tỉ lệ cảm ứng là 88,8% Khi

mô sẹo phát triển tái sinh thành chồi, môi trường MS có chứa 1.5 mg/l BAP, 0.5 mg/l Kinetin và 0.5 mg/l NAA cho kết quả tương đối tốt với 50% tỷ lệ tái sinh và cho số lượng chồi tốt nhất Môi trường MS có 0.1 mg/l NAA cho thấy kết quả tốt trong việc tạo rễ với tỉ lệ ra rễ đạt 65% Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy, vô trùng các mẫu cấy bằng dung dịch có mẫu chứa 75% ethanol có thể dẫn đến sự chết hàng loạt mẫu cấy Theo Yesil – Celiktas và cs 2007,

nghiên cứu nuôi cấy chồi in vitro trong môi trường MS có bổ sung 7 g/l agar,

30 g/l đường, 1 và 3 mg/l NAA để tạo mô sẹo Môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA được chứng minh là môi trường tốt nhất cho việc tạo ra các mô sẹo (65%)

Năm 2015, Mohammed và Stanica đã nghiên cứu việc sử dụng các mẫu cấy lá non của cây hương thảo, cho thấy sự ảnh hưởng của chất ĐHST trên màu sắc mô sẹo và sản xuất phôi soma trong ống nghiệm bằng cách sử dụng nồng độ của NAA và BA Nghiên cứu cho thấy rằng với BA và NAA đã dẫn

đến một tác động đáng kể trên màu mô sẹo, từ màu xanh lá cây, màu trắng hoặc màu nâu Nồng độ 1.5 mg/l BA và 1.5 mg/l NAA xác định một số mô sẹo màu trắng tinh khiết Tỷ lệ tốt nhất tạo phôi soma từ lá cây hương thảo trong môi trường MS có 2.0 mg/l BA

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.)

thuộc họ Hoa môi

Hình 2.1 Cây hương thảo

- Nguyên liệu nghiên cứu: Đoạn thân của chồi cây hương thảo in vitro

nảy mầm từ hạt, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, khoa Sinh - Môi trường, Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng

2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu nhân giống in vitro cây hương thảo tại Phòng thí

nghiệm Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, khoa Sinh - Môi trường, Đại học

Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Nghiên cứu ươm trồng cây hương thảo in

vitro để tạo cây giống tại vườn ươm ở Bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng

- Thời gian thực hiện: từ 7/2021 đến 6/2022

2.3 Nội dung nghiên cứu

+ Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây hương thảo

trong điều kiện phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo rễ in vitro, hình thành cây con hoàn chỉnh

+ Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất cây giống hương thảo trong

điều kiện vườn ươm tại Đà Nẵng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ươm trồng đến khả năng sống sót của cây in vitro trong vườn ươm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ươm trồng đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro trong vườn ươm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm

Cây hương thảo in vitro từ hạt

Nhân chồi in vitro

Tạo rễ in vitro

Tạo cây giống trong vườn ươm

2.4.1 Phương pháp nhân chồi in vitro cây hương thảo từ đoạn thân

Hạt sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS để hạt nảy

mầm, tạo cây in vitro Sau 5 tuần nuôi cấy, cây in vitro nảy mầm từ hạt được

sử dụng làm nguyên liệu để tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy in vitro

Đoạn thân có mắt lá (dài 0,5 cm) của cây in vitro (nảy mầm từ hạt)

được nuôi cấy trên môi trường MS nhân chồi có 3% sucrose; 0,8% agar; có

bổ sung các chất ĐHST khác nhau: BAP (0,25 – 2,0 mg/L); KIN (0,25 – 2,0 mg/L); TDZ (0,25 – 2,0 mg/L); phối hợp giữa BAP (0,5 – 2,0 mg/L ) và 0,5

mg/L NAA Đánh giá ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo chồi in

vitro thông qua các chỉ tiêu sau: số chồi/mẫu, chiều dài chồi (cm), chất lượng

chồi sau 2 tháng nuôi cấy

2.4.2 Phương pháp nhân chồi in vitro cây hương thảo từ protocorm

Protocorm (1,5 tháng tuổi) hình thành từ đoạn thân của cây hương thảo được sử để làm nguyên liệu nhân nhanh chồi Các protocorm được tách ra

thành các khối nhỏ khoảng 2 – 3 mm nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,8% agar; có bổ sung các chất ĐHST khác nhau: BAP (0,5 – 2,0 mg/L); KIN (0,5 - 2 mg/L); Đánh giá ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả

năng phát sinh chồi in vitro từ từ protocorm thông qua: tỉ lệ protocorm tạo

chồi, số chồi/protocorm sau 2 tháng nuôi cấy

2.4.3 Phương pháp tạo rễ in vitro cây hương thảo

Sau thời gian nuôi cấy, các cụm chồi in vitro đạt yêu cầu về chiều cao

được chuyển sang môi trường ra rễ

Các chồi in vitro (cao khoảng 2-3 cm) được nuôi cấy trên môi trường

MS có 3% sucrose; 0,8% agar; bổ sung các chất ĐHST khác nhau: IBA (0,25 – 1 mg/L); NAA ( 0,25 – 0,75 mg/L); Đánh giá ảnh hưởng của chất ĐHST

đến khả năng tạo rễ in vitro thông qua thời gian chồi ra rễ, số rễ/chồi, chiều

dài rễ sau 4 tuấn nuôi cấy

Tất cả môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH=5,8, khử trùng ở 1210C,

áp suất 1atm, trong 20 phút Các mẫu nuôi cấy in vitro đặt trong phòng nuôi

có nhiệt độ 25 ± 20C; cường độ chiếu sáng 3000 lux, thời gian chiếu sáng 16 h/ngày;

2.4.4 Phương pháp tạo cây giống hương thảo ngoài vườn ươm

Cây in vitro hoàn chỉnh, sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ thích

hợp nhất (cây cao 5 cm, rễ dài 1 - 1,5 cm) được chuyển ra trồng trong vườn ươm tại Bán đảo sơn Trà - Đà Nẵng dưới các điều kiện ươm trồng khác nhau

Các chai lọ chứa các cây con in vitro được đặt trong vườn ươm trong

các khoảng thời gian khác nhau: 5, 7, 10, 15 ngày để làm thích nghi cho cây

in vitro với điều kiện tự nhiên Sau khi làm thích nghi, cây in vitro được lấy ra

khỏi chai lọ nuôi cấy, rửa sạch agar và môi trường Để cây in vitro ráo nước, tiến hành ươm trồng cây hương thảo in vitro dưới các điểu kiện ươm trồng

khác nhau trong vườn ươm: cơ chất trồng, nước tưới, độ che sáng, dinh dưỡng

- Phương pháp tạo cơ chất trồng: Sử dụng các loại cơ chất khác nhau như: Đất cát, xơ dừa, tro trấu, phân chuồng hoai mục Các cơ chất được xử lý

với chế phẩm Tricoderma để ức chế các vi sinh vật gây bệnh trước khi phối trộn theo các công thức cơ chất trồng khác nhau Cây in vitro được trồng trên

các công thức cơ chất khác nhau Sau 2 tháng trồng, đánh giá khả năng sinh trưởng của cây con thông qua tỉ lệ (%) cây sống; chiều cao cây

- Phương pháp tưới nước: Cây in vitro được trồng trên cơ chất phù hợp

Nước tưới được sử dụng là nguồn nước tự nhiên của Bán đảo Sơn trà Tưới nước theo cách tưới phun, thời gian tưới 3 phút, theo các công thức tưới: 1 lần/ngày; 2 lần/ngày; 1 lần/2 ngày Sau 2 tháng trồng, đánh giá khả năng sinh trưởng của cây con thông qua chiều cao cây, chất lượng cây con

- Phương pháp che sáng: Sử dụng lưới che sáng để tạo ra các độ che sáng

tư nhiên khác nhau: 30, 40, 50, 70% Cây in vitro được ươm trồng dưới các

độ che sáng khác nhau trong nhà lưới Sau 2 tháng trồng, đánh giá khả năng sinh trưởng của cây con thông qua: chiều cao cây, chất lương cây con

2.4.5 Phương pháp xử lí số liệu

Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần Số liệu thực nghiệm được tính toán và phân tích thống kê Ducan’s test (p <0,05) bằng chương trình SAS

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây

hương thảo in vitro

Cytokinin là chất ĐHST có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, sự

hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro, cảm ứng sự sinh trưởng của chồi

bên và loại bỏ ưu thế đỉnh (Nguyễn Như Khanh, 2002) Các cytokinin thường gặp là BAP, là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn KIN BAP và KIN có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào (Nayak NR và cs, 1997) Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng độ cytokinin càng cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994)

3.1.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro từ đoạn thân

BAP là một chất thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng để kích thích sự

phân hóa, sinh trưởng và phát triển chồi của mẫu cấy in vitro Tác dụng chủ

yếu của BA là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào, ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa chồi (Huetteman và cs, 1993) BAP kích thích phân chia tế bào ở mô phân sinh đỉnh từ đó phát sinh chồi và kích thích tạo lá

Đoạn thân có mắt lá (dài 0,5 cm) của cây in vitro nảy mầm từ hạt (5 tuần

tuổi) được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA (0,25 – 2,0 mg/L) Sau 2 tháng nuôi cấy, kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro

từ đoạn thân có mắt lá BAP

(mg/L)

Khả năng phát sinh chồi in vitro

Số chồi/mẫu Chiều cao

chồi (cm)

Chất lượng chồi

Hình 3.1 Cụm chồi in vitro sinh trưởng trên môi trường MS

có bổ sung 1,5 mg/L BAP sau 2 tháng nuôi cấy

Qua kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, trên môi trường MS có bổ sung BAP

(0,25 – 2,0 mg/L) ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi in vitro hương thảo BAP

ảnh hưởng mạnh đến sự nhân lên về số lượng và chiều cao chồi Tăng nồng

độ BAP (0,25-1,5 mg/L) thì số chồi in vitro phát sinh có xu hướng tăng (11,5

– 35,5 chồi/mẫu), số chồi cao nhất 35,5 chồi/mẫu khi nuôi cấy trên môi trường có BAP (1,5 mg/L); chồi khỏe, có màu xanh đậm Trên môi trường có 1,5 mg/l BA; chiều cao chồi đạt cực đại; đạt 2,70 cm, sau 2 tháng nuôi cấy (Hình 3.1.) Tuy nhiên, khi tăng nồng độ BAP lên quá cao (2,0 mg/L BAP) sẽ

gây ức chế sự phát sinh chồi in vitro Số lượng và chiều cao chồi giảm rõ rệt

trên môi trường có bổ sung BAP (2,0 mg/L), chỉ đạt 30,5 chồi/mẫu và 2,5 cm chiều cao sau 2 tháng nuôi cấy

Năm 2016, Lê Thị Thúy đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và môi trường nuôi cấy lên khả năng tăng sinh chồi và rễ

in vitro lan Hoàng thảo Shavin White đưa ra kết luận rằng: môi trường ½ MS

bổ sung 1 mg/l BAP là môi trường tối ưu để nhân nhanh chồi in vitro, với số

chồi/mẫu là 34,67 (cụm chồi ban đầu có 5 chồi) và chồi cao là 1,43 cm/chồi Đặng Thị Thắm và cs (2018), đã nghiên cứu chỉ ra rằng, môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BAP phù hợp cho sự hình thành và phát triển của chồi cây lan nhất điểm hồng với 22,47 chồi/mẫu; chiều cao chồi đạt 1,96 cm/chồi Năm

1994, Buising cũng đã đưa ra nhận định, sử dụng BAP ở nồng độ cao sẽ gây

ức chế sự kéo dài các mô phân sinh và làm giảm tỉ lệ nhân chồi in vitro Kết

quả nghiên cứu của tôi phù hợp với các nhân định trên

Như vậy, khi nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi in

vitro cây hương thảo, môi trường nuôi cấy có 1,5 mg/L BAP cho hệ số nhân

chồi cao nhất 35,5 chồi/mẫu, sinh trưởng của cụm chồi tốt, chiều cao chồi đạt 2,70 cm sau 2 tháng nuôi cấy