Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng và tích lũy β carotene ở vi tảo dunaliella salina

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ THIỀM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY β-CAROTENE Ở VI TẢO DUNALIELLA SALINA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Đà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ THIỀM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY β-CAROTENE

Ở VI TẢO DUNALIELLA SALINA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Đà Nẵng – 2022

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ THIỀM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY β-CAROTENE

Ở VI TẢO DUNALIELLA SALINA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Đăng Mậu

Đà Nẵng – 2022

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

MỞ ĐẦU 1

1.Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa của đề tài 3

4 Bố cục đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ VI TẢO DUNALIELLA SALINA 4

1.1.1.Hệ thống phân loại 4

1.1.2.Đặc điểm hình thái 4

1.1.3.Đặc điểm sinh thái 5

1.2 Β-CAROTENE TRONG VI TẢO DUNALIELLA SALINA 6

1.2.1 Đặc điểm của β-carotene 6

1.2.2 Cấu trúc của β-carotene 7

1.2.3 Cơ chế tích lũy carotenoid ở Dunaliella 8

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina 9

1.2.5 Vai trò của β-carotene 13

1.3 ỨNG DỤNG CỦA VI TẢO DUNALIELLA SALINA TRONG ĐỜI SỐNG 14

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DUNALIELLA SALINA 15

1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới 15

1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 23

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2.Phạm vi nghiên cứu 23

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.3.1.Bố trí thí nghiệm 23

2.3.2.Phương pháp xác định mật độ tế bào 27

2.3.3.Phương pháp xác định hàm lượng β-carotene 27

2.3.4.Phương pháp xác định cường độ ánh sáng 28

2.3.5.Phương pháp xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA PHỔ CHIẾU SÁNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY Β-CAROTENE Ở VI TẢO DUNALIELLA SALINA 29

3.1.1 Ảnh hưởng của phổ chiếu sáng đến sinh trưởng ở vi tảo Dunaliella salina 29

3.1.2 Ảnh hưởng của phổ chiếu sáng đến tích luỹ β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina 33

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA CƯỜNG ĐỘ ÁNH SÁNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY Β-CAROTENE Ở VI TẢO DUNALIELLA SALINA 36

3.2.1 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sinh trưởng ở vi tảo Dunaliella salina 36

3.2.2 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến tích luỹ β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina 39

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CHU KỲ CHIẾU SÁNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY Β-CAROTENE Ở VI TẢO DUNALIELLA SALINA 42

3.3.1 Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến sự sinh trưởng ở vi tảo Dunaliella salina 42

3.3.2 Ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng đến khả năng tích lũy β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

1.Kết luận 48

2.Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1.1

Hình thái tế bào Dunaliella salina trong các điều kiện nuôi cấy

khác nhau A) Tế bào màu xanh trong môi trường không

stress; B) Tế bào bị stress chuyển sang màu cam; C) Tế bào da

cam tích lũy β-carotene (Ramos và c.s., 2009)

5

3.1 Tốc độ sinh trưởng trung bình của vi tảo D salina

3.2 Mật độ tế bào vi tảo D salina ở các phổ ánh sáng khác nhau 30

3.3 Hàm lượng caroten tích luỹ được ở các phổ ánh sáng khác

3.9 Tốc độ sinh trưởng trung bình của vi tảo D salina

3.10 Mật độ của tảo D salina ở các chu kỳ sáng tối khác nhau 43

3.11 Hàm lượng β-carotene ở các chu kỳ chiếu sáng khác nhau 45

3.12 Năng suất β-carotene của vi tảo D salina ở các chu kỳ chiếu

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của phổ ánh sáng 24

Bảng 2.2 Thông số và tần suất theo dõi ảnh hưởng của phổ ánh

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng 25

Bảng 2.4 Thông số và tần suất theo dõi ảnh hưởng của cường độ

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng 26

Bảng 2.6 Thông số và tần suất theo dõi ảnh hưởng của chu kỳ

Bảng 3.1 Mật độ tế bào D salina ở các phổ ánh sáng khác nhau 31

Bảng 3.2 Hàm lượng β-carotene và năng suất sản xuất β-carotene

Bảng 3.3 Mật độ tế bào D salina ở các cường độ ánh sáng khác

Bảng 3.4 Hàm lượng β-carotene và năng suất sản xuất β-carotene

Bảng 3.5 Mật độ tế bào D salina ở các chu kỳ ánh sáng khác

Bảng 3.6 Hàm lượng β-carotene và năng suất sản xuất β-carotene

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

β-carotene là đồng phân quan trọng của carotenoid, thuộc nhóm các sắc tố hữu cơ tự nhiên β-carotene có thể chuyển hóa thành vitamin A trong cơ thể và được xem là tiền chất tốt nhất của vitamin A trong các loại carotenoid Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng β-carotene là một sắc tố tự nhiên có khả năng chống oxy hóa rất cao, kích thích tế bào miễn dịch, phối hợp với các chất chống oxy hoá khác như vitamin C và vitamin E làm giảm các nguy cơ nhiễm trùng, làm chậm quá trình lão hóa, giảm tác hại của ánh sáng mặt trời, cũng như giảm nguy cơ một số bệnh về tim mạch và ngăn ngừa một số bệnh ung thư (Huỳnh Hiệp Hùng & cs., 2013) Trong những năm gần đây, khi thu nhập của người dân

đã được cải thiện và họ rất quan tâm đến việc chăm sóc sức khoẻ cho bản thân nên sự gia tăng nhu cầu sử dụng carotenoid cho việc chăm sóc sức khỏe, mỹ phẩm hay dược phẩm (Lamers & cs., 2008; Tsai & cs., 2012) từ các nguồn tự nhiên là rất lớn nên đã thúc đẩy nhiều nỗ lực để cải thiện sản xuất β-carotene từ các nguồn sinh học, do đó mở ra cơ hội phát triển các chủng vi tảo có khả năng sản xuất hợp chất này

Dunaliella salina được xem là nguồn sản xuất β-carotene tự nhiên tốt nhất

có giá trị kinh tế cao, chiếm tới 14% trọng lượng khô (Jin & Melis, 2003)

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng quá trình sinh trưởng và sinh tổng

hợp β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng

độ muối, điều kiện dinh dưỡng, cường độ ánh sáng hay chế độ chiếu sáng, các phổ ánh sáng và các nguyên tố vi lượng Để thu được β-carotene đảm bảo về mặt chất lượng và số lượng thì các nhà khoa học tập trung nghiên cứu phát triển cả về mật độ lẫn tăng cường tích lũy β-carotene (Mojaat & cs., 2008; Zhe

Wu & cs., 2016; Hamed & cs., 2020) Trên thế giới, việc làm tăng tích lũy

β-carotene trong sinh khối của D salina đã được nghiên cứu trên quy mô phòng

thí nghiệm và sản xuất thương mại (Hejazi & Holwerda, 2004)

Võ Hồng Trung và cộng sự đã nghiên cứu kết hợp cường độ ánh sáng với nồng độ H2O2 và nồng độ muối cho tích lũy hàm lượng carotenoid cao (Võ Hồng Trung, Bùi Văn Lệ, 2018) Một nghiên cứu của Xu & cs (2019) cho rằng ánh sáng đỏ có thể có giá trị công nghiệp như một nguồn sáng tiết kiệm năng

lượng để sản xuất carotenoid bởi D salina

Theo nghiên cứu của Xi Y & cs (2000) cho rằng sự tích lũy β-caroten có sự khác nhau dưới các chế độ ánh sáng khác nhau, ánh sáng mạnh theo định kỳ sẽ thuận lợi hơn cho sự tích tụ β-carotene, hơn là ánh sáng mạnh liên tục Như vậy cường độ ánh sáng cao và phổ ánh sáng khác nhau có vai trò quan trọng trong việc tích lũy β-carotene ở tế bào tảo Trong nước, các hướng nghiên cứu

về loài này vẫn còn hạn chế bởi các chủng giống của loài này chưa phong phú

và đa số đều tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ muối đối với tích lũy β-caroten ở

vi tảo D salina

Ngoài ra, việc khảo sát và tối ưu các yếu tố ánh sáng là một việc làm cần thiết để lập nên một quy trình nuôi cấy tối ưu cho năng suất sinh khối và hàm lượng β-carotene cao Phổ ánh sáng, cường độ ánh sáng và chu kỳ chiếu sáng được coi là những yếu tố quan trọng trong việc kích thích khả năng tổng hợp β - carotene của vi tảo Dựa trên những cơ sở này, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và tích lũy β-carotene ở vi tảo

Dunaliella salina”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Đánh giá được vai trò của ánh sáng trong quá trình sinh trưởng và tích lũy

β-carotene của vi tảo D salina

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được phổ chiếu sáng tối ưu cho sự sinh trưởng và tích lũy

β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina

- Xác định được cường độ ánh sáng tối ưu cho sự sinh trưởng và tích

lũy β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina

- Xác định được chế độ chiếu sáng tối ưu cho sự sinh trưởng và tích

lũy β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp những dẫn liệu khoa học trong việc nghiên cứu ảnh hưởng của

ánh sáng đến sinh trưởng và tích lũy β-carotene ở chủng vi tảo D salina

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Ứng dụng vào sản xuất β-carotene ở quy mô công nghiệp có giá trị thương

mại cao từ chủng vi tảo D salina

4 Bố cục đề tài

Đề tài có bố cục 3 chương: Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Đối tượng, nội dung, phạm vi và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận

Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ VI TẢO DUNALIELLA SALINA

2009) D salina di chuyển bằng 2 roi, không có thành polysaccharide cứng mà

chỉ được bao bọc bởi lớp glycoprotein nhầy gọi là glycocalyx (Borowitzka & Borowitzka, 1988) Tế bào có lục lạp lớn được bao bọc quanh bằng tinh bột, nó

có thể chứa một lượng lớn carotenoid là cho tế bào có màu cam mà không phải

màu xanh như bình thường D salina không có vách giúp tế bào có thể nhanh

chóng thay đổi thể tích tế bào để đáp ứng với những thay đổi áp suất thẩm thấu ngoại bào (Ben-Amotz & Avron, 1990)

Dunaliella có hai tiên mao dài ngang nhau và một lục lạp hình chén Lục

lạp này có thể đựng β-carotene, mà sinh vật này màu đỏ-cam β-carotene che

chắn chúng khỏi tia tử ngoại mà D salina phải phơi mình ra trong môi trường sống D salina có nhiều hình dạng, tùy vào điều kiện môi trường hiện tại của chúng (Borowitzka, 2016)

D salina có thể sinh sản vô tính hay sinh sản hữu tính (bằng cách hợp nhất

hai giao tử thành hợp tử) dù D salina sống sót trong nước mặn Martinez xác định rằng hoạt động sinh sản của D salina giảm đáng kể trong điều kiện độ mặn

>10% Hoạt động sinh sản hữu tính bắt đầu khi hai tiên mao của D salina chạm nhau dẫn đến sự hợp giao tử Bào tử D salina chống chịu tốt, sống sót cả trong

nước ngọt lẫn khi thiếu nước Sau khi nở, 32 tế bào con đơn bội chui ra từ hợp

tử (Lerche W Arch f Protistenkd 1937)

Hình 1.1 Hình thái tế bào Dunaliella salina trong các điều kiện nuôi cấy khác

nhau A) Tế bào màu xanh trong môi trường không stress; B) Tế bào bị stress chuyển sang màu cam; C) Tế bào da cam tích lũy β-carotene (Ramos & cs,

2009) (thước đo trên hình:10 μm)

Ở môi trường với điều kiện nuôi cấy bình thường, tế bào tảo có màu xanh nhưng vẫn có các giọt dầu chứa β-carotene làm tế bào dù có màu xanh nhưng vẫn nhìn thấy những đốm nhỏ màu cam Khi bị tác động bởi các yếu tố vật lý như cường độ ánh sáng, nhiệt độ , hay các stress môi trường như thiếu hụt dinh dưỡng, độ mặn, thì tế bào bắt đầu tích lũy nhiều β-carotene hơn bình thường Lúc này tảo vẫn còn chuyển động được nhờ 2 roi và tế bào bắt đầu chuyển sang màu cam nhiều hơn màu xanh Tế bào có màu cam đậm khi tế bào tích lũy lượng lớn β-carotene và lúc này tế bào bị mất roi, không chuyển động

và có hình tròn so với hình quả trứng ban đầu

1.1.3 Đặc điểm sinh thái

Dunaliella salina là vi tảo lục, đơn bào, ưa mặn Chúng có mặt ở các môi

trường nước biển hay các cánh đồng muối trên thế khắp thế giới Chúng hiện diện ở đại dương lớn như Đại Tây Dương, Địa Trung Hải hay những nơi có độ mặn cao (trên 15% muối), nhiệt độ cao và ánh sáng mạnh (Jin & Melis, 2003)

Một số nơi tập trung nhiều loài Dunaliella như Biển Chết ở Israel, hồ Pink ở Úc

hay hồ muối lớn ở Utah, Mỹ (Ben-Amotz và cs, 1991)

Các nghiên cứu trước đây cho thấy chúng có thể thay đổi hình dạng và thể tích của tế bào để thích nghi với sự thay đổi áp suất thẩm thấu ngoại bào Nhờ các hợp chất như glycerol giúp giữ độ ẩm cho tế bào, β-carotene giúp chống lại

cường độ ánh sáng cao nên D salina được coi là sinh vật hiếm hoi có thể tồn tại

trong môi trường khắc nghiệt với nồng độ muối cao (Nguyễn Thị Hải Thanh,

2014) Ngoài ra, chúng còn chứa nhiều vitamin C và E Các loài D salina đã

được chứng minh là chịu được một phạm vi pH rộng (0 – 11), nhưng phạm vi

pH tốt nhất cho D salina là 9 – 11 Ở độ pH cao, có nguy cơ cao về kết tủa và

hiện tượng keo tụ muối canxi trong sinh khối tảo, làm giảm lượng β-carotene tích lũy (Abu-Rezq & cs., 2010) Phạm vi nhiệt độ thích hợp đối với sự phát

C

1.2 Β-CAROTENE TRONG VI TẢO DUNALIELLA SALINA

1.2.1 Đặc điểm của β-carotene

Carotenoid có cấu trúc polyisoprenoid gồm 40 cacbon liên kết với nhau bằng các liên kết đơn và liên kết đôi xen kẽ Có đến 90% carotenoid trong thức

ăn của con người là β-carotene, α-carotene, lutein, lycopene và cryptoxanthin (Gerster, 1997) Đồng phân quan trọng của carotenoid là β-carotene β-carotene

C carotene được sinh tổng hợp từ Geranylgeranyl pyrophosphate (Lamers., 2008) Việc tách β-carotene ra khỏi hỗn hợp các carotenoid khác dựa trên tính phân cực của các hợp chất β-carotene là một hợp chất không phân cực, vì vậy nó được tách ra với một dung môi không phân cực như hexan, chloroform, benzene; tan

ít trong dầu thực vật và hầu như không tan trong nước cũng như rượu

β-carotene tự nhiên có màu vàng, da cam hoặc đỏ trong nhiều loại thực vật và trái cây Bên cạnh đó, hợp chất hữu cơ này còn có thể được chiết xuất từ loại tảo

như D salina Ngoài ra, β-carotene rất dễ bị ảnh hưởng bởi ánh sáng và nhiệt

độ cao Nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ vai trò và ích lợi của β-carotene trên hệ miễn dịch, ngăn ngừa nhiều loại ung thư, giảm tác hại của ánh nắng mặt trời và giúp tiêu diệt các gốc tự do trong cơ thể nhờ khả năng chống oxy hóa mạnh Trong tự nhiên, β-carotene là tiền chất của vitamin A và khi vào cơ thể nó sẽ chuyển hóa thành vitamin A Quá trình β-carotene chuyển hóa thành vitamin A được kiểm soát nên không tạo thành lượng dư vitamin A gây độc cho cơ thể

1.2.2 Cấu trúc của β-carotene

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của β-carotene (Rodriguez-Amaya, 2001)

β-carotene là một phân tử cân đối được cấu tạo do 1 chuỗi prolene và 2 vòng β-ionone ở 2 đầu, khi thuỷ phân cho 2 phân tử vitamin A Chuỗi liên kết dài sẽ tạo ra màu cam cho β-carotene.Trong tự nhiên, β-carotene tồn tại 2 dạng

đồng phân là cis và trans, trong khi tổng hợp bằng hóa học chỉ tạo ra được dạng trans D salina chứa β-carotene tự nhiên tốt nhất với các đồng phân 9-cis (chiếm 41%), all-trans (42%), 15-cis (10%) và các đồng phân khác (7%) Loài vi tảo

này được xem là nguồn sản xuất β-carotene tự nhiên tốt nhất do chứa tỉ lệ cao

đồng phân 9-cis-β-carotene, được chứng minh là có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn nhiều so với đồng phân all-trans-β-carotene (Rodriguez-Amaya, 2001)

Hình 1.3 Cấu trúc các đồng phân của β-carotene

(Rodriguez- Amaya và cs., 2001)

1.2.3 Cơ chế tích lũy carotenoid ở Dunaliella

Carotenoid là isoprenoid được tổng hợp bởi tất cả sinh vật quang hợp, một

số nấm và vi khuẩn không quang hợp (Cordero & cs., 2011) Hơn 750 carotenoids đã được xác định cấu trúc

Ở các sinh vật quang hợp, carotenoid gắn với các protein màng thylakoid nơi mà chúng tham gia vào hấp thụ ánh sáng và bảo vệ cho bộ máy quang hợp chống lại những tổn thương quang oxy hóa (Cordero & cs., 2011)

Carotenoid là các sắc tố da cam, vàng hoặc đỏ được tổng hợp bởi tất cả các quá trình quang hợp sinh vật thu ánh sáng và bảo vệ quang, và ổn định sắc tố-protein phức hấp thụ ánh sáng và trung tâm phản ứng quang hợp trong màng thylakoid (Auldridge, 2006)

Quá trình sinh tổng hợp carotenoid trong các sinh vật quang hợp được thực hiện qua hai giai đoạn:

+ Sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid (IPP)

+ Sinh tổng hợp carotenoids từ tiền chất IPP

Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyl diphosphate (IPP), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphate (C20) Hai phân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene sau đó tiếp tục khử

hydro tạo thành phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene Tiếp theo đó là sự tạo vòng, sự khử hydro và sự oxy hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt thường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên có một số ít các hợp chất được biết có sự chuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các carotenoid khác nhau

Một lượng lớn các chất biến dưỡng thứ cấp như isoprenoid hay terpenoid gồmmột vài hợp chất có giá trị sinh học và kinh tế như carotenoid Ở các sinh vật quang hợp, isoprenoid được tổng hợp từ isopentyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP) từ con đường mevalonate trong tế bào chất (MVA) hoặc con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) trong lục lạp (con đường không MVA hoặc 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate [DXP]) Ở tảo lục chỉ có con đường MEP trong lục lạp cung cấp các tiền chất cho sinh tổng hợp tất cả isoprenoid (Võ Hồng Trung, 2017)

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy β-carotene ở vi tảo

Dunaliella salina

Ở vi sinh vật quang hợp, cường độ ánh sáng có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình trao đổi chất của tế bào và mức độ phát triển của vi tảo Carotenoids và chlorophylls là hai hợp chất sắc tố chính trong hầu hết các loài vi tảo Sự phổ biến của chất diệp lục sẽ tạo ra quang phổ màu xanh lá cây, và vượt qua carotenoid sẽ tạo ra màu đỏ Một nghiên cứu chỉ ra rằng sự tích tụ của β-carotene bảo vệ tế bào chống lại các tác động có hại của việc hấp thụ cường độ cao của quang phổ ánh sáng vùng xanh lam (Prieto & cs., 2011) Nhiều nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng không chỉ ảnh hưởng đến hàm lượng mà còn

ảnh hưởng đến chất lượng của β-carotene Tỉ lệ đồng phân 9-cis/all-trans và

mức β-carotene phụ thuộc vào cường độ ánh sáng mà tế bào vi tảo gặp phải trong quá trình tăng sinh (Gómez & González., 2005) Giảm cường độ ánh sáng

có thể làm tăng tỉ lệ đồng phân 9- cis/all-trans ở các loài D salina khác nhau và

cường độ ánh sáng 10 klux mang lại kết quả tốt nhất trong việc tạo ra tỉ lệ carotene cao nhất (Abu-Rezq & cs., 2010)

β-Sự ức chế ánh sáng được tạo ra khi cường độ ánh sáng tới lớn hơn cường

độ ánh sáng cần để quang hợp bão hòa Dunaliella tích lũy lượng lớn β-carotene

giúp tế bào vượt qua điều kiện ức chế ánh sáng và ức chế hoạt tính quang hô hấp cao dưới điều kiện ánh sáng xanh, trung bình dưới điều kiện ánh sáng trắng và không tồn tại dưới điều kiện ánh sáng đỏ Khi tiếp xúc với ánh sáng xanh cường

độ cao trình tự các sự kiện xảy ra như sau: quang hô hấp, quang phân hủy

carotenoid theo thứ tự 9-cis-β-carotene, all-trans-β-carotene, diệp lục tố và cuối

cùng là sự phá hủy tế bào (Ben‐Amotz & cs., 1989) Sự tích lũy các β-carotene (tỷ lệ đồng phân 9-cis/all-trans) phụ thuộc vào cường độ ánh sáng mà tế bào

Dunaliella tiếp xúc trong một chu kỳ phân chia (Lers & cs., 1990) Tỷ lệ này cao

tỷ lệ đồng phân của nó phụ thuộc nhiều vào cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng được sử dụng (Shaish & cs., 1992)

Ngoài các bước sóng nhìn thấy, bức xạ tia cực tím (UV) cũng ảnh hưởng đến sự tích lũy β-carotene Ánh sáng nhìn thấy gồm 9% tia UV gần (UV-A và UV-B: 290 - 400 nm) tại bề mặt trái đất, trong đó UV-B được hấp thụ bởi ozon ở tầng bình lưu còn lại các tia UV-A chiếu đến trái đất Quang hợp ở nhiều loài thực vật phù du bị ức chế bởi các bức xạ UV tự nhiên, đặc biệt UV-A đã được nghiên cứu Khi bức xạ UV-A kết hợp với PPFD cao tỷ lệ carotenoid và diệp lục tố trên protein tăng lên 80 – 310 % ( Jahnke, 1999) Trong điều kiện tiếp xúc với UV-A trong 84 giờ kích thích sự gia tăng hàm lượng carotenoid tổng, trong đó lutein và zeaxanthin tăng gấp 3 – 5 lần Bức xạ UV-A có lợi thế là ứng dụng dễ dàng nhưng trong các nuôi cấy hệ thống mở việc kiểm soát nó sẽ trở nên khó khăn (Senger & cs, 1993)

Trong một nghiên cứu đã xác định sự tăng trưởng và tích lũy carotene của

loài khác như Haematococcus pluvialis có bị ảnh hưởng bởi các phổ ánh sáng

khác nhau Kết quả đã thể hiện rằng ở cùng một cường độ ánh sáng 2 klux, cùng nhiệt độ sinh trưởng 25˚C chỉ khác nhau về phổ ánh sáng Theo như kết

quả nghiên cứu phổ ánh sáng xanh kết hợp đỏ là phổ ánh sáng mà tảo đạt ngưỡng tối ưu về mật độ tế bào và tốc độ sinh trưởng cụ thể là đạt ngưỡng 3,7 x

đạt được sinh khối lớn nhất khi được nuôi dưới ánh sáng màu đỏ, thời gian duy

trì quần thể là một tuần Võ Hồng Trung & cs, (2017) cũng cho rằng sự tăng trưởng của Spirulina sp ở điều kiện ánh sáng đỏ cao hơn so với ánh sáng xanh

dương và trắng

Trong nuôi trồng tảo công nghiệp, các điều kiện chiếu sáng như ánh sáng liên tục hoặc chu kỳ sáng tối, độ dài của chu kỳ quang kỳ và cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến cả sự phát triển của vi tảo và thành phần sinh khối (Wahidin & cs., 2013) Chiếu sáng liên tục trong hệ thống phản ứng quang sinh thường được

sử dụng để tối đa hóa sản lượng sinh khối tuy nhiên, năng lượng ánh sáng dư thừa không thể chuyển đổi thành năng lượng hóa học sẽ gây ra tổn thương ức chế quang hợp đối với bộ máy quang hợp của tảo và ức chế sự phát triển của tế bào tảo (Baroli & Melis, 1998; Mulders & cs, 2014) Do đó, việc cung cấp các khoảng thời gian sáng và tối thích hợp có thể là điều cần thiết cho cả sự sinh

trưởng của D salina và sản lượng β-carotene đạt mục tiêu thương mại

Sự tích lũy β-carotene ở vi tảo D salina còn phụ thuộc vào các điều kiện

môi trường nuôi khác nhau như:

Độ mặn là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh khối và sản sinh carotene Mối tương quan nghịch giữa sinh khối và hàm lượng β-carotene bằng việc tăng giảm độ mặn trong môi trường nuôi cấy đã được đề cập (Pourkarimi & cs., 2020) Để tích lũy β-carotene cần độ mặn cao, nhiệt độ cao và cường độ

β-chiếu sáng mạnh, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở độ mặn trên 27% NaCl D salina có thể tích lũy được lượng carotenoid lên tới trên 14% trọng lượng khô

(Nguyễn Thi Hải Thanh và Ngô Đăng Nghĩa, 2014)

Ngoài ra thành phần và lượng chất dinh dưỡng có ảnh hưởng đến cả sinh trưởng và tích lũy β-carotene Hàm lượng các đa lượng yêu cầu bắt buộc đối vớisinh trưởng của tảo như nguồn nitơ, cacbon, photpho hay sulfur ảnh hưởng

rất nhiều đến tích lũy β-carotene Nhiều nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng của nitơ đến tích lũy là mạnh nhất Cạn kiệt nitơ cho hàm lượng β-carotene được

tích lũy cao nhưng lại làm hạn chế sinh trưởng của D salina thậm chí còn gây

chết tế bào (Bonnefond & cs., 2017)

pH của môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố môi trường có ý

nghĩa ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi tảo Các loài D salina đã được chứng

minh là chịu được một phạm vi pH rộng (0 – 11), nhưng phạm vi pH tốt nhất

cho D salina là 9 – 11 Ở độ pH cao, có nguy cơ cao về kết tủa và hiện tượng

keo tụ muối canxi trong sinh khối tảo, làm giảm lượng β-carotene tích lũy Rezq & cs., 2010)

(Abu-Sự phát triển và thành phần của các hợp chất quý giá do nhiều loài vi tảo tạo ra đều bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ Yếu tố này kích thích các thành phần nội bào khác nhau bằng cách ảnh hưởng đến chức năng của các enzyme nội bào.Phạm vi nhiệt độ thích hợp đối với sự phát triển của hầu hết các vi tảo là 20

Đồng là các đồng yếu tố (cofactor) quan trọng của enzyme và có vai trò quan trọng như chất truyền điện tử (Posudin & cs., 2010) Đồng được biết là có

vai trò trong chuỗi vận chuyển electron quang hợp của vi tảo sử dụng plastocyanin metallo-protein (Hill & cs., 1996; Katoh & cs., 1961), trong hoạt động PSI (Bishop, 1964) và chuỗi vận chuyển điện tử hô hấp (Maldonado & cs., 2006)

Mangan là một trong những vi chất cần thiết cho các loài sinh vật Thiếu hụt mangan sẽ ảnh hưởng đến lục lạp vì nó ảnh hưởng đến hệ thống cung cấp điện tử cần thiết cho quá trình quang hợp Mangan còn vận chuyển electron trong PSII, duy trì cấu trúc màng lục lạp, phản ứng phân hủy và những phản ứng liên quan đến halogen (Cheniae & Martin, 1969; Teichler-Zallen, 1969)

Kẽm tham gia cấu tạo nên các enzyme, cấu trúc ribosome, sao chép và

estephotphat Bên cạnh đó, các nguyên tố như cobalt hay kẽm tham gia vào các quá trình trao đổi chất bên trong tế bào, cobalt là thành phần cấu tạo nên vitamin B12 (Scott & cs., 1993), phản ứng chuyển C và H với glycol và ribose

1.2.5 Vai trò của β-carotene

Các β-carotene được biết đến với khả năng chống oxy hóa cao Do đó, vai trò của carotenoid nổi bật nhất chính là khả năng chống lão hóa Trong cơ thể chúng ta luôn tồn tại các peroxide và superoxide Chúng cùng với oxy đơn bội

và các gốc hydroxyl được biết đến là các gốc tự do gây ra quá trình lão hóa của

cơ thể thông qua việc tác động đến lipid, protein và gây tổn thương ADN Chính quá trình lão hóa này sẽ gây ra những ảnh hưởng xấu đến sức khỏe như các bệnh

về tim mạch hoặc ung thư, β-carotene có khả năng chống oxy hóa cao, giúp làn

da luôn khỏe mạnh, tươi trẻ (Đặng Diễm Hồng & cs, 1998)

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng carotenoids chiết xuất từ vi tảo biển carotene, lutein, alpha-carotene, zeaxanthin, fucoxanthin, lycopene và neoxanthin) có thể có tác dụng tức thì đối với sự không tăng sinh của tế bào ung thư (Orset & Young, 1999)

(β-Raja cũng đã chỉ ra rằng β-carotene được chiết xuất từ D salina làm giảm

mức cholesterol và lactate dehydrogenase Vì thế, sử dụng rộng rãi nguồn có giá

trị này trong các sản phẩm thuốc chữa bệnh cho con người được mong đợi trong tương lai gần (Raja & cs., 2007)

β-carotene giúp bảo vệ con người và động vật đã chống lại sự lão hóa thông qua hoạt động chống oxy hóa của nó (Dar vin & cs, 2011) Ngoài ra, β-carotene

là một nguồn chính vitamin A, không thể thiếu cho các chức năng của võng mạc và ảnh hưởng đến nhiều loại mô bằng cách điều chỉnh biểu hiện gen (Von Lining & cs, 2005)

β-Carotene là một carotenoid chính trong da và được làm giàu trong mô này khi được bổ sung (Alaluf & cs., 2002) Các nghiên cứu can thiệp trên người cho thấy tác dụng bảo vệ chống tia cực tím trung bình của β-carotene trên da (Köpcke & cs, 2008; Sies & cs, 2004) Trong hầu hết các nghiên cứu này, việc hấp thụ nhiều β-carotene đã cải thiện một phần tình trạng cháy nắng hoặc ban đỏ

do tia cực tím (erythema solare), phản ứng chính của da sau khi tiếp xúc với tia cực tím

1.3 ỨNG DỤNG CỦA VI TẢO DUNALIELLA SALINA TRONG ĐỜI

SỐNG

Vi tảo Dunaliella salina là một cấu thành quan trọng của sinh vật phù du (plankton), đóng vai trò trong việc duy trì và phát triển hệ sinh thái dưới nước (Nguyễn Thị Thanh Hải, 2014) Tảo Dunaliella salina là thức ăn tươi sống đặc

biệt quan trọng cho sự phát triển ấu trùng của hầu hết các loài tôm, cá, ốc và cho các động vật phù du; tính ưu việt của vi tảo là không gây ô nhiễm môi trường, cung cấp đầy đủ các vitamin, chất khoáng, vi lượng, đặc biệt là chúng chứa rất nhiều loại axit béo không no Chúng có giá trị dinh dưỡng rất cao và phạm vi ứng dụng rộng rãi (Sena & cs.,1995)

Trên thế giới, mô hình làm giàu β-carotene trong sinh khối của D salina đã

được nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm và sản xuất thương mại (Xi Y &

cs, 2000)

Viên nén được làm từ tảo D salina có hàm lượng đạm, lipid, carbohydrate

tương đối cao, lại giàu β-carotene, do đó có tác dụng tăng cường sức khỏe, giúp

đẹp da, sáng mắt, tăng cường hệ miễn dịch và chống lão hóa Ngoài ra, tảo D salina giàu carotenoid có thể được sử dụng trong nuôi trồng thủy hải sản, đặc

biệt là các giai đoạn ương ấu trùng các loài thủy sản có giá trị kinh tế cao Do

đó, đã có một số công trình trong nước nghiên cứu về chủng vi tảo này nhằm ứng dụng trong y dược và nuôi trồng thủy sản (Đặng Diễm Hồng & cs, 1998)

D salina làm giảm đáng kể nồng độ clo, natri và bicarbonate, chúng có khả

năng loại bỏ muối tốt và có thể được sử dụng như một gợi ý thích hợp để loại bỏ muối từ nước mặn ( Abu-Rezq & cs, 2010)

Các nghiên cứu khác đã cho thấy rằng D salina ngăn chặn các tế bào gan

bị nhiễm độc bởi carbon tetrachloride ở chuột (GOMEZ & cs, 1999) Quá trình khám phá các loại thuốc mới hữu ích hơn và ít độc hại với ít tác dụng phụ nhất

là rất quan trọng

Vi tảo có tuyệt tiềm năng trong nhiều khía cạnh của sản xuất dựa trên sinh học, chẳng hạn như việc sản xuất nhiên liệu sinh học và các nhà máy sinh học để sản xuất dược phẩm, phụ gia thực phẩm và mỹ phẩm có giá trị (Mata

& cs, 2010; Takaichi, 2011; Vílchez & cs, 2011)

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DUNALIELLA SALINA

1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới

Từ đầu những năm 1960, các nhà khoa học đã bắt đầu sản xuất D salina để thu β-carotene tự nhiên và đến cuối những năm 1980, việc nuôi trồng D salina

trên quy mô công nghiệp cũng đã bắt đầu được triển khai tại Australia, Israel, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Kuwait, Iran Các nghiên cứu đi sâu từ đặc điểm sinh học của loài đến điều kiện sinh trưởng tối ưu nhất và các điều kiện ảnh hưởng

đến quá trình tích lũy β-carotene của vi tảo D salina Các nghiên cứu đưa ra điều

kiện tối ưu cho sinh trưởng với nồng độ muối từ 9 – 20% NaCl, pH từ 6 – 9 và nhiệt độ từ 25o

C– 35oC Nguồn dinh dưỡng Nitơ tốt nhất là nitrat, tuy nhiên

NH4NO3 gây hại đối với sinh trưởng của D salina (Borowitzka và cs, 1988)

Hàm lượng phosphat và sulfat cũng cần cho sự sinh trưởng nhưng thường không được đưa vào môi trường nuôi ở ao hồ hay nuôi bằng nước biển vì hàm lượng có

sẵn trong nước máy và nước biển cao (Ben-Amotz & Avron, 1989)

Năm 2020 Xi Y và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ ánh sáng

khác nhau đến sự phát triển của D salina và sự tích tụ β-carotene Nghiên cứu

chỉ ra rằng việc tiếp xúc với ánh sáng mạnh định kỳ sẽ thuận lợi hơn cho sự tích

tụ β-carotene hơn là ánh sáng liên tục (Xi Y & cs., 2000)

Năm 2019 Xu và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng xanh, đỏ và

/s,

việc sản xuất β-caroten Tác giả cho rằng D salina sinh trưởng trong ánh sáng

đỏ cường độ cao thì khả năng tích tụ β-carotene cao và tỷ lệ hấp thụ oxy cao Khi chuyển sang màu xanh lam ánh sáng, sự sụt giảm lớn hàm lượng β-carotene

đã được ghi nhận cùng với tốc độ quang oxy hóa Trong ánh sáng xanh dương cường độ cao, tốc độ tăng trưởng được duy trì ở cùng tốc độ như trong ánh sáng

đỏ hoặc trắng, dưới ánh sáng đỏ được kích thích làm tăng dần hàm lượng carotene (Xu & cs, 2019)

β-Theo W Fu (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và tích luỹ β-carotene Trong nghiên cứu này lượng photon của ánh sáng

quả của D salina Nhưng cuối cùng tác giả khẳng định rằng sử dụng kết hợp

mảng LED đỏ (75%) với mảng LED xanh lam (25%) tích lũy hàm lượng

β-carotene cao hơn 53.5% so với mẫu đối chứng của ánh sáng đơn đỏ(Fu et al,

2013)

Theo Wu và cs (2016) đánh giá các điều kiện tối ưu cho việc sản xuất tảo

của ba chủng Dunaliella salina ứng cử viên (KU XI, KU 10 và KU 31) được

phân lập từ đất mặn và được nuôi cấy trong cột quang phản ứng Kết quả: Ánh

/s và

β-carotene cao nhất (117,99 mg/l) Nồng độ tối ưu của KNO3, CO (NH2)2 và

trong khi 0,12 mg/l và 1,5 mg/l thích hợp nhất để tích lũy carotene Tỷ lệ carotene trên ở cường độ ánh sáng cao nhất (12,21 pg) và nhiệt độ thấp nhất (12,47 pg), và tổng hàm lượng β-carotene thấp nhất xuất hiện ở nhiệt độ thấp nhất (15°C) Không có sự khác biệt đáng kể về tích lũy sinh khối giữa ba chủng

β-Dunaliella; tuy nhiên, sự tích lũy β-carotene của KU XI cao hơn so với hai

chủng còn lại Nhóm nghiên cứu kết luận ánh sáng và nhiệt độ đều là những yếu

tố có liên quan góp phần vào sự tăng trưởng và tích lũy β-carotene của ba

tích luỹ β-carotene là nhiệt độ ( Wu & cs, 2016)

Milko (1963) đã đề cập đến khả năng tạo ra lượng lớn β-carotene ở

Dunaliella sp Sau đó, nhiều nhà khoa học như Ben-Amotz & Avron (1983), Borowitzka (1988) đã chứng minh Dunaliella sinh ra nhiều β-carotene để làm

chất bảo vệ cho bộ máy quang hợp dưới các điều kiện môi trường bất lợi Các yếu tố môi trường như cường độ ánh sáng cao, điều kiện dinh dưỡng giới hạn, nồng độ muối cao và nhiệt độ cao đều tác động đến các quang thụ quan cảm nhận ánh sáng hay kênh vận chuyển, làm giảm tính ổn định của chúng, qua đó làm tăng các stress oxy hóa và nồng độ oxy đơn bội Các stress này có thể làm

cho sự tăng trưởng của Dunaliella bị giảm nhưng lại tăng cường sự tích lũy

carotenoid

Khi nghiên cứu về D salina thì nghiên cứu quá trình chuyển hóa

carotenoid là việc làm cần thiết vì quá trình này diễn ra hiệu quả thì chúng ta có thể tích lũy một lượng lớn carotenoid (Ye et al, 2008) Cho đến nay, một số nhà nghiên cứu đã giải quyết các tác động của các điều kiện môi trường phi sinh học khác nhau (Gómez & González, 2005; Coesel & cs, 2008; Lamers & cs, 2010;

Ramakrishna & cs, 2011) đối với sự tích tụ của carotenoid ở D salina, và nó

được nhiều người nhận định rằng cường độ ánh sáng là yếu tố kích thích chủ

yếu để sản xuất quá mức β-carotene ở D salina (Lamers & cs, 2010) Sự phát triển của D salina phụ thuộc vào ánh sáng với thông lượng photon là 128

/s hoặc thấp hơn (85 và 42 μmolphoton/m2/s ), hoặc bị ức chế

ánh sáng khi thông lượng photon tới là 170 hoặc 255 μmolphoton/m2/s Hơn nữa, tốc độ tăng trưởng trung bình tối đa là 0,32g/L/ngày ở thông lượng photon

sáng

Vorst đã so sánh hiệu suất của D salina và D bardawil về tốc độ tăng

trưởng và sản xuất β-caroten của tế bào Trong nghiên cứu của mình, môi trường

C và

sát được đối với D salina và D bardawil lần lượt là 1,71/ngày và 1,21/ngày

Ngoài ra, tỷ lệ sản xuất β-carotene tế bào cao nhất thu được lần lượt là 0,6 pg/tế

bào và 2,0 pg/tế bào đối với D salina và D bardawil (Vorst, 1995) García -

González và cộng sự công bố rằng trong nhiều thí nghiệm tốc độ tăng trưởng

trung bình của D salina là 0,16 – 0,2 (1/ngày) và tỷ lệ sản xuất caroten trung

bình là 8,1 – 15,1 mg/L (García-González & cs., 2003) Filho và Jesus đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn lên hai mức 0,2M và 0,5M đối với tăng trưởng sinh

khối và sản xuất β-carotene của D salina Họ sử dụng nước biển làm môi

trường nuôi cấy trong thời gian 15 ngày Điều kiện hoạt động ở 25◦C, chiếu sáng liên tục bằng đèn huỳnh quang với cường độ 4500 lux, và giá trị pH = 7,6 được điều chỉnh bằng cách thổi CO2 vào môi trường nuôi cấy và trộn ở tốc độ 150 vòng/phút Kết quả cho thấy tốc độ tăng trưởng đã giảm đáng kể ở độ mặn cao,

do đó sau 15 ngày, mật độ tế bào tối đa đạt 3,7×106

tế bào/ml và 8,4×105 tế bào/ml ở độ mặn tương ứng là 0,2 M và 0,5 M (Jesus & Maciel Filho, 2010) AL-Muhteseb và Emeish đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và một số

chất dinh dưỡng đến việc sản xuất sinh khối và β-carotene của vi tảo D salina

tế bào/mL

magie 0,25 g/L và độ mặn 2,5% (Al- Muhteseb & Emeish, 2015) Để tăng sinh khối và tích lũy β-carotene, Chen đã đề xuất một chiến lược nuôi cấy hai giai

đoạn cho sự phát triển của D salina Trong giai đoạn đầu tiên, các tế bào phát

triển trong môi trường giàu dinh dưỡng và 18% muối, và trong giai đoạn thứ hai, chúng được chuyển vào một môi trường nghèo chất dinh dưỡng và nồng độ muối cao (27%) để tăng β- carotene (Chen và c.s., 2009) Vào năm 1989, Borowitzka cho rằng nuôi cấy hai giai đoạn là phương pháp không thể thực tế vì độ mặn thấp của giai đoạn đầu làm gia tăng động vật nguyên sinh trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn hai (Borowitzka & Borowitzka, 1988) Nhiều công bố về các đặc điểm sinh học và giá trị của loài vi tảo này đã thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu tới quy mô lớn hơn Hệ thống nuôi cấy là một trong những việc ưu tiên hàng đầu Những công ty đầu tiên bắt đầu sản xuất

β-carotene từ D salina trong nuôi cấy quy mô lớn vào những năm 1986 là các

công ty của Úc Sử dụng hệ thống bơm mở rộng với một nguồn phụ để kiểm soát độ mặn của môi trường và cung cấp các chất dinh dưỡng cho môi trường Tuy nhiên, trong một hệ thống canh tác hạn chế, diện tích các vũng canh tác nằm

cung cấp carbon vô cơ nguồn và điều chỉnh pH trong môi trường nuôi cấy (Hejazi và c.s., 2003) Ở quy mô lớn và trong các hệ thống mở ngoài trời, do hạn chế về kỹ thuật, nhiệt độ không hoàn toàn có thể kiểm soát được và sự suy giảm nhiệt độ vào ban đêm làm giảm tốc độ tăng trưởng và hiệu quả tế bào Mặt khác, nhiệt độ trên 400

C dẫn đến sự sinh ra glycerol trong môi trường Sự có mặt glycerol có thể xem như một nguồn cacbon hữu cơ của vi khuẩn và nấm, gây nguy hiểm cho sự phát triển của vi tảo Tốt hơn là sử dụng hệ thống điều khiển

nuôi mở phụ thuộc vào nước, đất và điều kiện thời tiết (Guelcher & Kanel, 1999)

Với những khó khăn trong nuôi cấy hệ thống mở, hệ thống nuôi cấy khép

kín hay các lò phản ứng sinh học đã được đưa vào nuôi cấy D salina Ưu điểm

của việc sử dụng bể phản ứng sinh học quang bao gồm kiểm soát tốt hơn các thông số nuôi, sản xuất sinh khối cao hơn, giảm nguy cơ ô nhiễm, tránh thất thoát CO2 và thiết kế linh hoạt theo yêu cầu của việc nuôi cấy Zhu và Jiang

cũng đã nghiên cứu nuôi cấy D salina trong một lò phản ứng sinh học hình ống

10 lít (Zhu & Jiang, 2008) Ying và cộng sự (2013) đã nghiên cứu ảnh hưởng

của việc sử dụng bể phản ứng sinh học quang lên sự phát triển của vi tảo D salina so với hệ thống thông lượng không có sục khí Trong nghiên cứu của họ,

Sau đó, các thí nghiệm nuôi cấy sơ cấp được thực hiện để so sánh ảnh hưởng

= 6 Quá trình sục khí được thực hiện bằng cách sử dụng khí được làm giàu với

cho thấy việc sử dụng thiết bị phản ứng sinh học quang học trong việc đưa vi tảo

Dunaliella salina vào sản xuất công nghiệp đã thúc đẩy các nghiên cứu về các

sản phẩm thương mại từ sinh khối và các hợp chất chiết xuất từ loài vi tảo này

1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Việt Nam là một nước nhiệt đới, có khí hậu nóng ẩm rất thuận tiện cho sự phát triển của vi sinh vật đặc biệt là vi tảo Những năm gần đây Việt Nam đang chú trọng đầu tư trồng tảo và sản xuất sản phẩm từ tảo Mặc dù vậy, ở Việt Nam hiện nay, các nghiên cứu về loài này vẫn còn ít và mới mẻ Năm 1998, Đặng Diễm Hồng, Lê Thu Thuỷ và Choon - Hwan Lee., nghiên cứu tác động của cường độ ánh sáng cao lên hoạt động của chu trình xanthophyll và sự tích luỹ β-

carotene của vi tảo Dunaliella salina Nghiên cứu Nguyễn Thị Hải Thanh, Ngô Đăng Nghĩa, "Phân lập vi tảo Dunaliella salina NT6 tại Khánh Hòa và nghiên

cứu các điều kiện sinh trưởng và tổng hợp β-carotene của tảo" năm 2014

Nghiên cứu chỉ ra thích hợp nhất cho sinh trưởng của tảo D salina NT6 là: nhiệt

độ 28o

C, cường độ ánh sáng 14 Klux, độ mặn 2M Trong khi đó sau 22 ngày nuôi cấy, điều kiện cảm ứng tổng hợp mạnh β-caroten là cường độ ánh sáng >14 Klux, độ mặn 4M Trong điều kiện nuôi cấy NT6 gồm cường độ chiếu sáng 14.000 lux, độ mặn 2M, hàm lượng β-caroten được tích lũy lên tới 2,94 pg/tb Nghiên cứu này của tác giả là nghiên cứu kết hợp cường độ chiếu sáng và độ mặn của môi trường nuôi

Năm 2018 Võ Hồng Trung, Bùi Văn Lệ đã nghiên cứu tăng trưởng và khả

năng chống oxy hóa của D salina dưới điều kiện ức chế ánh sáng Nghiên cứu

ra sự ức chế tăng trưởng ở D salina A9 và kích thích tăng trưởng ở D salina

CCAP 19/18 và D bardawil DCCBC 15 Đồng thời các điều kiện ức chế ánh sáng cao còn gây ra sự tích lũy hàm lượng lớn các hợp chất có hoạt tính chống

oxy hóa như carotenoid, phenolic ở các chủng D salina Cường độ ánh sáng có

vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự tích lũy β-carotene ở tế bào tảo Sự chiếu sáng liên tục ở 2300 lux được sự sử dụng trong suốt quá trình nhằm tạo ức chế ánh sáng để tác động đến khả năng tích lũy β-carotene Kết quả này cho thấy hàm lượng diệp lục tố thấp và hàm lượng β-carotene cao khi cường độ ánh sáng cao Sự tích lũy β-carotene liên quan đến vai trò bảo vệ chống lại sự sản xuất oxy singlet trong điều kiện ánh sáng cao Sự tích lũy các hạt β-carotene trong các khoảng gian màng thylakoid của lục lạp và giúp chống lại tổn thương gây ra bởi cường độ ánh sáng cao trong điều kiện tăng trưởng bị giới hạn Ở cường độ

cao

D bardawil và D salina có thể sống sót và tăng trưởng ở cường độ ánh

lục tố giảm trong 2 ngày đầu, có thể là do sự tiếp xúc đột ngột với cường độ ánh sáng cao Tuy nhiên, hàm lượng diệp lục tố tăng lên sau 2 ngày và hàm lượng β-carotene tăng lên gấp 5 lần (Võ Hồng Trung & cs, 2018) Theo nghiên cứu của

Võ Hồng Trung & cs cho thấy cường độ ánh sáng cao gây ra sự tích luỹ carotene cao hơn các ức chế khác

β-Một nghiên cứu của Chu Ngọc Phương là Dunaliella bardawil DCCBC 15

tăng trưởng tốt trong môi trường MD4 1,5M NaCl, hàm lượng diệp lục tố tăng cao trong pha tăng trưởng, hàm lượng carotenoid tăng mạnh khi vi tảo đạt pha

ổn định hoặc suy vong do cạn kiệt dinh dưỡng Trong các điều kiện ức chế, sự

tăng trưởng của Dunaliella bardawil DCCBC 15 bị ức chế, hàm lượng diệp lục

tố duy trì ổn định, trong khi đó tăng tổng hợp lipid và các chất chống oxy hóa như carotenoid và phenolic Trong đó ở điều kiện ức chế cạn kiệt dinh dưỡng và kết hợp với cường đô chiếu sáng mạnh thì hàm lượng β-carotene cao hơn so với các điều kiện còn lại (Chu Ngọc Phương, 2018)

Nhìn chung, lịch sử nghiên cứu và nuôi trồng tảo ở nước ta đã có từ lâu và thu được nhiều kết quả ban đầu đáng khích lệ

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHẠM VI VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi tảo Dunaliella salina được cung cấp bởi phòng thí nghiệm công nghệ

tảo khoa Sinh - Môi Trường, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ tháng 2/2021 đến tháng 6/2022

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Công nghệ Tảo, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của phổ chiếu sáng đến sinh trưởng và khả năng

tích lũy β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của cường độ ánh sáng khác đến sinh trưởng và

khả năng tích lũy β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng đến tốc độ sinh trưởng và

khả năng tích lũy β-carotene ở vi tảo Dunaliella salina

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

D salina được nhân sinh khối với các điều kiện thích hợp trong môi

trường f/2, chiếu sáng dưới ánh sáng đèn LED với cường độ 33,8 μmolphoton/m2/s và ở 25oC sau đó được sử dụng cho thí nghiệm Điều kiện thí nghiệm tương tự điều kiện nhân giống

a Nghiên cứu ảnh hưởng của phổ chiếu sáng đến sinh trưởng và tích lũy carotene ở vi tảo Dunaliella salina

β-Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí với 3 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần) với các phổ ánh sáng: Xanh, đỏ, trắng

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của phổ ánh sáng

Giống D salina sạch nhiễm đã được nhân sinh khối trong điều kiện phòng

thí nghiệm (nuôi cấy tĩnh trong môi trường f/2, ở điều kiện chiếu sáng cường độ

8 tối ở 25oC) được sử dụng cho thí nghiệm với mật độ đầu vào 100 х 103

tế bào/mL

Giống tảo Dunaliella salina được chuyển sang môi trường nuôi với thể tích

100mL trong các điều kiện phổ ánh sáng khác nhau

Để đánh giá ảnh hưởng của các phổ ánh sáng đến khả năng tổng hợp

β-carotene của vi tảo Dunaliella salina, các mẫu vi tảo sẽ được đưa vào các môi

trường nuôi với cùng một môi trường và cùng mật độ tế bào; mật độ tế bào ban đầu là 1x105

(tế bào/mL)

Giống vi tảo được cấy chuyển vào các bình thể tích 250mL có chứa môi trường, tổng thể tích nuôi là 100 mL Sự ảnh hưởng của phổ ánh sáng lên khả năng

tổng hợp β-carotene của vi tảo Dunaliella salina được đánh giá sau 6 ngày nuôi

Bảng 2.2 Thông số và tần suất theo dõi ảnh hưởng của phổ ánh sáng

b Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ sáng đến sinh trưởng và tích lũy carotene ở vi tảo Dunaliella salina

Giống D salina sạch nhiễm đã được nhân sinh khối trong điều kiện phòng

thí nghiệm (nuôi cấy tĩnh trong môi trường f/2, ở điều kiện chiếu sáng 33,8

được sử dụng cho thí nghiệm với mật độ đầu vào 1x105

(tế bào/mL)

Giống tảo Dunaliella salina được chuyển sang môi trường nuôi với thể tích

100mL trong các điều kiện các cường độ ánh sáng khác nhau

Để đánh giá ảnh hưởng của các cường độ ánh sáng đến khả năng tổng hợp

β-carotene trong nuôi trồng vi tảo Dunaliella salina, các mẫu vi tảo sẽ được đưa

vào các môi trường nuôi với cùng một môi trường và cùng mật độ tế bào; mật

Bảng 2.4 Thông số và tần suất theo dõi ảnh hưởng của cường độ ánh sáng

c Nghiên cứu chu kỳ chiếu sáng đến sự sinh trưởng và khả năng tích lũy carotene ở vi tảo Dunaliella salina

β-Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí với 3 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần) với chế độ ánh sáng khác nhau: 12h sáng:12h tối (12S:12T), 16h sáng:8h tối (16S:8T), 24h sáng:0h tối (24S:0T)

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm chu kỳ chiếu sáng

Nghiệm thức Thời gian chiếu sáng Số lƣợng mẫu

Cách tiến hành:

Giống D salina sạch nhiễm đã được nhân sinh khối trong điều kiện phòng

thí nghiệm (nuôi cấy tĩnh trong môi trường f/2, ở điều kiện chiếu sáng 33,8

(tế bào/mL)

Giống tảo Dunaliella salina được chuyển sang môi trường nuôi với thể tích

100mL trong các điều kiện các cường độ ánh sáng khác nhau Để đánh giá ảnh hưởng của các chu kỳ chiếu sáng đến khả năng sinh tổng hợp β-carotene trong

nuôi trồng vi tảo Dunaliella salina, các mẫu vi tảo sẽ được đưa vào các môi

trường nuôi với cùng một môi trường và cùng mật độ tế bào; mật độ tế bào ban

Bảng 2.6 Thông số và tần suất theo dõi ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng

2.3.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào

Dụng cụ để xác định mật độ tế bào là kính hiển vi, buồng đếm Neubauer, lamen Dùng pipet trộn đều mẫu cần đếm, pha loãng mẫu (nếu cần thiết) và nhỏ một lượng cần thiết (40µl) chia đều vào mỗi buồng đếm, đậy lamen sao cho lamen không lệch ra khỏi buồng đếm, không có bọt khí, sau đó đặt buồng đếm lên kính hiển vi Điều chỉnh tiêu cự của kính hiển vi quang học và tiến hành quan sát ở vật kính 10X để tìm được buồng đếm trên thị trường, điều chỉnh ốc vi cấp để quan sát tế bào rõ hơn Tiến hành chụp hình và xác định mật độ, kích thước bằng phần mềm IMAGEJ

Tốc độ sinh trưởng: Sự phát triển của vi tảo Dunaliella salina được đánh

giá bằng công thức sau:

Tốc độ sinh trưởng = ln(NN2)−ln(NN1)

t2−t1 Trong đó: NN1 và NN2 lần lượt là mật độ tế bào đạt được của vi tảo trong ngày trước và ngày sau nuôi cấy ở các mốc thời gian t1, t2 tương ứng

2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng β-carotene

Hàm lượng β-carotene được theo dõi 2 ngày một lần trong 6 ngày liên tiếp

và được xác định theo phương pháp của Shaish (Shaish & cs, 1992) Lấy 1 ml

dịch tảo cần phân tích, mang li tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch

ml n-hexan vào và lắc đều hỗn hợp Li tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút Hút dịch chiết ở pha n-hexan, so màu ở bước sóng 450nm Phần dịch được đo OD bằng máy Jasco V750 ở bước sóng 450nm và được tính theo công

25,2 là hệ số theo phương pháp của Shaish (Shaish & cs, 1992)

2.3.4 Phương pháp xác định cường độ ánh sáng

Cường độ ánh sáng được xác định bằng máy đo ánh sáng Digital Lux

/s bằng công thức sau: