Luận án nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ đực (carica papaya l )

Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học của hoa và lá cây đu đủ đực Carica papaya L.; - Đánh giá ho t tính gây độc tế bào ung thư và ho t tính ức chế enzyme tyros

MỞ ĐẦU

1 Đ t vấn đ

Cùng với sự phát triển không ngừng v mọi m t của xã hội, con người đang phải đối m t với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhi u hơn Một trong những giải pháp hiện nay là xu hướng quay v với thiên nhiên, dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân t o, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta

Cây đu đủ (Carica papaya L.) là một lo i cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng

nhiệt đới châu Mỹ Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng phổ biến ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các lo i đất phù sa Cây đu đủ có lợi thế là lo i cây d trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời các bộ phận của cây đu đủ đ u được sử d ng với nhi u m c đ ch chữa bệnh khác nhau [19]

Quả đu đủ là nguồn cung cấp nhi u lo i enzyme khác nhau Papain, pepsin giúp tiêu hóa protein trong thức ăn ở môi trường acid, ki m và trung tính Lipase, một enzyme hydrolase liên kết ch t chẽ với phần không tan trong nước của quả xanh, là một chất xúc tác sinh học cố định Ngoài ra, acid folic tìm thấy trong quả

đu đủ là chất chuyển đổi homocysteine thành các acid amin như cysteine ho c methionine Quả đu đủ chín là thuốc nhuận tràng đảm bảo cho ruột ho t động bình thường [148]

H t đu đủ có nhi u ho t tính sinh học tốt như đ c tính kháng khuẩn và có hiệu

quả chống l i vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus; đi u trị ký sinh trùng

đường ruột ở người mà không có tác d ng ph ; bảo vệ thận; giúp giải độc gan; h sốt; chữa bệnh tr ; thương hàn và chống lão hóa [148] Bên c nh đó, h t đu đủ còn được sử d ng làm thuốc chống trầm cảm, kích thích kinh nguyệt [59]

Dịch chiết từ r cây đu đủ được sử d ng để đi u trị bệnh giang mai, bệnh tr , khối u của tử cung và lo i bỏ sự đông kết ure [59] Một số nước ở Châu Á đã sử

d ng nước ép từ r cây đu đủ để đi u trị chứng khó tiêu và giảm tiểu tiện [148] Trong dân gian lá cây đu đủ được sử d ng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, giảm đau, chữa sốt rét, trừ giun sán, Đã có nhi u công trình nghiên cứu v

ho t tính sinh học của lá cây đu đủ Lá cây đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất m nh [35], [134] Ho t tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra [114] Ngoài ra, lá cây đu đủ có ho t tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhi u lo i vi khuẩn gram âm, gram dương và các lo i nấm [28] Đ c biệt, người dân một số quốc gia đã dùng lá cây đu đủ chữa bệnh ung thư Người dân nước Úc đã dùng lá cây đu đủ để trị bệnh ung thư Một nhóm nghiên cứu người Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác d ng ức chế một

số dòng tế bào ung thư như ung thư d dày, ung thư phổi, ung thư máu, [112] Ở Việt Nam, cao chiết với cồn từ lá cây đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình

ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác d ng ức chế sự phát triển của khối

u gây ra bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [11]

Gần đây, người dân địa phương ở Quảng Nam-Đà Nẵng đã sử d ng hoa cây

đu đủ đực để đi u trị các bệnh v đường hô hấp như viêm họng, ho, mất tiếng, khản tiếng; các bệnh v hệ bài tiết như đái rắt, đái buốt, đau niệu đ o; chữa sỏi thận; tác

d ng k ch th ch tiêu hóa Ngoài ra, hoa cây đu đủ đực còn được dùng để hỗ trợ đi u trị bệnh ung thư như ung thư phổi, ưng thư vú, ung thư gan, [14], [106]

Chính bởi công d ng chữa bệnh của cây đu đủ như trên, có nhi u đ tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và ho t tính sinh học của loài cây này, chủ yếu là các bộ phận của cây đu đủ cái Thế nhưng vẫn còn rất ít nghiên cứu v các bộ phận của cây đu đủ đực

Việc sử d ng các bộ phận của cây đu đủ đực hiện nay để chữa bệnh vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian, nhi u người còn e ng i vì chưa có các cơ sở khoa học để chứng minh Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và chỉ ra được thành phần

ho t chất c thể của cây đu đủ đực có ho t tính sinh học là một việc làm hết sức cần thiết, t o cơ sở khoa học cho việc ứng d ng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc đi u trị một số lo i bệnh, trong đó có bệnh ung thư Do đó, đ tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học và ho t tính sinh học của cây đu đủ đực (Carica papaya L.)” đã được lựa chọn

2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học của hoa và lá cây đu đủ đực

(Carica papaya L.);

- Đánh giá ho t tính gây độc tế bào ung thư và ho t tính ức chế enzyme

tyrosinase in vitro của các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các ho t chất làm

cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo, t o ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng

3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Hoa và lá cây đu đủ đực;

- Các cao chiết n-hexane, chloroform, dichloromethane và ethyl acetate;

- Đánh giá ho t tính gây độc tế bào ung thư và ho t tính ức chế enzyme

tyrosinase in vitro của các hợp chất phân lập được

4 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ hoa và

- Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên;

- Tham khảo các công trình nghiên cứu v thành phần hóa học và ho t tính sinh học của cây đu đủ trên thế giới và trong nước;

- Tổng quan các tài liệu v đ c điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học,

ho t tính sinh học và ứng d ng của loài cây này

5.2 ư t i

- Các phương pháp lựa chọn và xử lý mẫu thực nghiệm;

- Các phương pháp chiết mẫu thực vật;

- Các phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất;

- Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất;

- Các phương pháp đánh giá ho t t nh gây độc tế bào ung thư;

- Các phương pháp đánh giá ho t t nh ức chế enzyme tyrosinase;

- Các phương pháp xử lý số liệu bằng toán học

6 ngh a hoa học và thực tiễn của nghiên cứu

6.1 Ý ĩa k oa ọc

- Cung cấp thêm các thông tin v thành phần hoá học và ho t tính sinh học của cây đu đủ đực, làm giàu thêm kho tàng hợp chất thiên nhiên của thế giới nói chung

và của Việt Nam nói riêng

- Kết quả của nghiên cứu này là cơ sở cho việc nghiên cứu phân lập các hợp chất có ho t tính sinh học từ các loài thực vật khác của địa phương

6.2 Ý ĩa t c tiễn

- Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo tốt, có t nh thời sự cao đối với việc giảng d y cho sinh viên ngành Hóa, Sinh học phân tử, Y dược; góp phần bồi dưỡng năng lực nghiên cứu khoa học, kỹ năng nghiên cứu của các giảng viên và nhà nghiên cứu ngành Hóa

- Góp phần khai thác hợp l và bảo tồn các loài thuốc dân gian qu của địa phương, sử d ng có hiệu quả các loài thuốc dân gian này, giúp ph c v chăm sóc sức khỏe cộng đồng, có khả năng t o ra các sản phẩm hỗ trợ đi u trị một số căn bệnh hiểm nghèo từ cây đu đủ đực, mang l i hiệu quả kinh tế-xã hội cao

7 Những đóng góp mới của luận án

Từ hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.) đã phân lập được:

- Hai hợp chất mới là caricapapayol (CP12A) và

ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (CP17A);

- Một hợp chất lần đầu phân lập từ nguồn tự nhiên là

1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde (CP1);

- Mười tám hợp chất lần đầu phân lập từ cây đu đủ đực (Carica papaya L.) là:

vitexoid (CP3); lariciresinol (CP4); dehydrodiconiferyl alcohol (CP5); 2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid (CP9); 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid (CP10); hỗn hợp 3-hydroxy-3-methyl-5-hexanolide và leucine (CP11); 2,6-

6-hydroxy-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol (CP14); indole-3-aldehyde (CP19); dihydroxycholest-5-ene (CP20); cholest-5-ene-3β,7β-diol (CP21); saringosterol (CP22); quercitrin (CPE3); kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (CPE5);

3β,7α-quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside (CPE6);

kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside (CPE7); tetratriacontanyl palmitate (CPL-C1);

1-hentriacontanol (CPL-C2) và vanillin (CPL-C3)

Lần đầu tiên kết quả nghiên cứu v ho t t nh gây độc tế bào in vitro trên ba

dòng tế bào ung thư ở người A549, MCF-7, Hep3B của 24/30 hợp chất phân lập từ

hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.) được công bố Hầu hết các hợp chất

được thử nghiệm đ u thể hiện khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư khảo sát với các mức độ khác nhau

Lần đầu tiên xác định được khả năng ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao methanol và 9/26 hợp chất phân lập từ hoa cây đu đủ đực (Carica papaya L.)

Hợp chất mới caricapapayol (CP12A) thể hiện ho t tính ức chế enzyme tyrosinase

m nh gần tương đương khi so sánh với chất đối chứng dương acid kojic

8 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 130 trang, trong đó có 41 Bảng và 58 Hình Phần mở đầu 04 trang, kết luận và kiến nghị 03 trang, danh m c các công trình khoa học đã công bố

01 trang, tài liệu tham khảo 14 trang Nội dung của luận án chia làm 04 chương: Chương 1 Tổng quan tài liệu, 25 trang

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu, 6 trang

Chương 3 Thực nghiệm, 18 trang

Chương 4 Kết quả và thảo luận, 59 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu v cây đu đủ

Tên khoa học: Carica papaya Linn

Tên Việt Nam: Thù đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua, Phan qua th ,

Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung (Lào), Má hống (Thái)

Đ c điểm thực vật: Cây nhỏ ho c nhỡ, cao từ 2-4 mét, thân thẳng, không

phân nhánh Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn Cuống lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy l i chia tiếp thành nhi u thùy nhỏ không đ u, gân

lá hình chân vịt, hai m t nhẵn [1], [2], [10] Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng

đu đủ có thể xếp thành 3 lo i trên phương diện giới t nh: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây đu đủ cũng có thể thuộc cả ba lo i nói trên Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà l i pha lẫn nhi u t đ c tính của

ba lo i hoa (Hình 1.1) Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra như khô h n và thay đổi nhiệt độ [19]

Phân bố và sinh thái: Cây đu đủ có nguồn gốc Châu Mỹ Họ đu đủ trên thế

giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [32], [148] Ở Việt Nam có một chi và một loài [2], [10] Ở nước ta, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các lo i đất phù sa Một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng bao gồm [19]:

- Giống đu đủ ta: Bao gồm các giống đu đủ có từ lâu đời ở nước ta Đ c tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp

- Giống đu đủ Mehico: Là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ XX Quả dài, tương đối đ c ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao Lá xanh đậm, phiến

lá dày, cuống lá to, màu xanh

- Giống đu đủ So Lo: Còn có tên gọi khác là đu đủ Mỹ, thân cây cao trung bình, sinh trưởng khỏe Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt, năng suất cao Là giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam

- Giống đu đủ Trung Quốc: Là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao Quả dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến

lá dày

- Giống đu đủ Thái Lan: Là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt Tuy nhiên giống này d bị nhi m bệnh khảm lá

- Giống đu đủ Đài Loan: Là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhi m bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg quả/cây Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, m m mà không nát, vỏ quả cứng d bảo quản

và vận chuyển Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày

A: hoa cái B: hoa lưỡng tính C: hoa đực

D: quả của cây cái E: quả lưỡng tính F: cây đực

H nh 1.1 H nh ảnh cây đu đủ

Các tỉnh trồng nhi u cây đu đủ như Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam, V nh Phúc, Quảng Nam, Ti n Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên, với giống chủ yếu phổ biến hiện nay là giống đu đủ Đài Loan, một giống lai F1 được nhập từ Đài Loan Diện tích trồng cây đu đủ của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả một năm [19]

Công dụng: Cây đu đủ là lo i cây d trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng

thời các bộ phận của cây đu đủ đ u được sử d ng với nhi u m c đ ch chữa bệnh khác nhau Quả đu đủ ch n là món ăn bổ dưỡng và giúp sự tiêu hóa thịt, lòng trắng trứng Quả đu đủ xanh được nấu kỹ với thịt gà có tác d ng chữa viêm lo t d dày Nhựa đu đủ được dùng làm thuốc diệt giun Lá cây đu đủ được sử d ng làm m m thịt khi nấu Hoa cây đu đủ đực tươi ho c phơi khô hấp với đường phèn được dùng chữa bệnh ho, viêm cuống phổi, khàn tiếng ho c mất tiếng ở người lớn, nhất là ở trẻ

em Ngoài ra, hoa cây đu đủ đực được dùng để chữa sỏi thận hiệu quả [59]

1.2 T nh h nh nghiên cứu v thành phần hóa học của cây đu đủ

Trong ph m vi và khả năng tìm hiểu, tra cứu tài liệu tham khảo, chúng tôi nhận thấy các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước đã phân lập, xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất của cây đu đủ

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về t a ọ a đu đ t o ước

Năm 1983, Nguy n Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được

alkaloid carpaine (1) trong lá cây đu đủ [20]

Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự đã sử d ng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá cây đu đủ Kết quả cho thấy

β-carotene (2), luteine (3) chiếm tỷ lệ tương ứng là 57,050% và 11,864% so với

tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopene [12]

Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập được 4 hợp chất từ

phân đo n n-hexane của lá cây đu đủ Bao gồm β-sitosterol (4), daucosterol (5), cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) (6) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol (7) Trong đó, sterculin A (6) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol (7) là 2 triterpene lần

đầu tiên phân lập từ lá cây đu đủ [4]

Cũng trong năm 2012, Nguy n Văn Rư và Vũ Quang Thái đã tách chiết chymopapain từ nhựa quả đu đủ xanh và chế thử thành d ng bột pha tiêm [15] Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đo n dịch chiết MeOH từ lá cây

đu đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, CH2Cl2, EtOAc,

n-butanol) Từ c n chiết CH2Cl2 phân lập được 6 hợp chất: danielone (8), carpainone (9), acid pluchoic (10), apocynol A (11), carpaine (1), pseudocarpaine (12) Trong

đó carpainone (9) là hợp chất mới và 2 hợp chất danielone (8), apocynol A (11) lần

đầu tiên được phân lập từ lá cây đu đủ [5]

Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên đã khảo sát định t nh sơ

bộ thành phần hóa học của hoa cây đu đủ đực Kết quả cho thấy sự có m t của alkaloid, ester, acid b o và một số sterol trong hoa cây đu đủ đực thu hái t i Đà Nẵng [9]

Năm 2016, Trần Thanh Hải đã phân lập được 2 hợp chất kaempferol (13) và

kaempferol-3-O-β-glucopyranosid (14) từ phân đo n ethyl acetate hoa cây đu đủ

đực thu hái trên địa bàn tỉnh Quảng Nam [6]

Năm 2017, Lê Thị Thanh Phương đã phân lập được 2 hợp chất kaempferol

(13) và β-sitosterol glucoside (5) từ phân đo n chloroform hoa cây đu đủ đực thu

hái trên địa bàn Quảng Nam-Đà Nẵng [14]

Cũng trong năm 2017, Đỗ Thị Hoa Viên và Trần Văn Lộc đã phân lập và định

lượng carpaine (1) từ lá cây đu đủ thu hái t i Đông Anh, Hà Nội Kết quả cho thấy

carpaine chiếm 63% tổng hàm lượng alkaloid chiết được từ lá cây đu đủ [57] Năm 2020, Võ Thị Ngà và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 6 hợp

chất stigmast-4-ene-3-one (15), β-sitosterol 3-O-β-glucopyranosid (16), tetradecanoyl-β-D-glucopyranosyl)-β-sitosterol (17), benzyl-β-D-glucoside (18),

3-O-(6-O-uracil (19) và acid palmitic (20) từ phân đo n ethyl acetate hoa và cuống lá cây đu

đủ đực thu hái t i xã Diêu Trì, huyện Tuy Phước, tỉnh Bình Định Trong đó, stigmast-4-ene-3-one (15), 3-O-(6-O-tetradecanoyl-β-D-glucopyranosyl)-β-

sitosterol (17) và uracil (19) là 3 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ hoa và cuống lá

cây đu đủ đực [140]

1.2.2 i ứ ề t a ọ a đu đ t th giới

Năm 1965, Govindachari T.R., Nagarajan K và Viswanathan N đã xác định

được cấu trúc của carpaine (1) và pseudocarpaine (12) là alkaloid được phân lập từ

lá cây đu đủ [73] Carpaine (1) được phân lập từ lá cây đu đủ trồng ở Nigeria với

hàm lượng 0,01-0,015% so với lá khô và thấp hơn ở Mỹ và châu Á [130], [136]

Năm 1967, carpaine (1) cũng được phân lập từ lá cây Azima tetracantha Lam bởi

Ball và cộng sự [37]

Năm 1979, Chung-Shih Tang đã phân lập được 2 alkaloid piperideine là

dehydrocarpaine I (21) và dehydrocarpaine II (22) từ lá cây đu đủ [137]

Năm 2002, David S và cộng sự đã phân lập và xác định được glycoside là

prunasin (23) và sambunigrin (24) trong lá và thân cây đu đủ [56]

Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự đã nghiên cứu các hợp chất phenol

trong lá cây đu đủ, kết quả thu được các hợp chất như sau: acid caffeic (25), acid coumaric (26), acid protocatechuic (27), kaempferol (13), quercetin (28) và 5,7- dimethoxycoumarin (29) [46]

p-Năm 2008, Krishna K.L và cộng sự đã tổng hợp các công trình nghiên cứu v thành phần hóa học của các bộ phận cây đu đủ [91]:

- Quả: protein, chất b o, carbohydrate, chất khoáng: Ca, P, Fe, vitamin C, B,

B2, B3 và carotene, amino acid, acid citric (30), acid malic (31) (quả xanh), linalool

(32), benzyl isothiocyanate (33), cis- (34) và 2-ol (35), carpaine (1), benzyl-β-D-glucoside (18), 2-phenylethyl-β-D-glucoside (36), 4-hydroxyphenyl-2-ethyl-β-D-glucoside (37) và 4 đồng phân malonate benzyl- β-D-glucoside (38-41)

trans-2,6-dimethyl-3,6-epoxy-7-octen Nước p quả: acid ntrans-2,6-dimethyl-3,6-epoxy-7-octen butyric (42), acid ntrans-2,6-dimethyl-3,6-epoxy-7-octen hexanoic (43), acid ntrans-2,6-dimethyl-3,6-epoxy-7-octen octanoic (44),

acid myristic (45), acid palmatic (46), acid stearic (47), acid linoleic (48), acid

linolenic (49), acid cis-vaccenic (50), acid oleic (51) và lipid

- H t: acid béo, protein, chất xơ, dầu, carpaine (1), benzyl isothiocyanate (33), benzyl glucosinolate (52), glucotropacolin (53), benzyl thiourea (54),

hentriacontane (55), β-sitosterol (4), caricin (56) và enzyme myrosin

- R : carposide (57) và enzyme myrosin

- Lá: carpaine (1), pseudocarpaine (12), dehydrocarpaine I (21), dehydrocarpaine II (22), choline (58), carposide (57), vitamin C và vitamin E

- Vỏ cây: β-sitosterol (4), glucose, fructose, sucrose, galactose và xylitol (59)

- Nhựa mủ: enzyme proteolytic; papain và chemopapain; glutamine cyclotransferase; chymopapain A, B và C; peptid A, B và lysozyme

Năm 2012, Adlin Afzan và cộng sự đã xác định được cấu trúc 12 hợp chất hóa học trong lá cây đu đủ bao gồmalkaloid carpaine (1); acid hữu cơ: acid malic (31), acid quinic (60); dẫn xuất của acid malic: caffeoyl malate (61), p-coumaroyl malate

(isomer 1 (62), isomer 2 (63)), feruloyl malate (isomer 1 (64), isomer 2 (65));

flavonol glycoside: quercetin-3-O-(2′′,6′′-di-O-rhamnopyranosyl)glucopyranoside

(manghaslin) (66), kaempferol-3-O-(2′′,6′′-di-O-rhamnopyranosyl)glucopyranoside

(clitorin) (67), quercetin-3-O-rutinoside (rutin) (68), kaempferol-3-O-rutinoside

(nicotiflorin) (69) [25]

Cũng trong năm 2012, T Oduola và cộng sự đã phân lập được một hợp chất

chống ăn mòn mới caricapinoside (70) từ phân đo n ethyl acetate của chiết xuất

methanol quả đu đủ xanh [111]

Năm 2013, Ikeyi Adachukwu và cộng sự đã phân t ch thành phần hóa học trong lá cây đu đủ Kết quả cho thấy sự xuất hiện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin, tannin và glycoside bằng các thuốc thử đ c trưng [79]

Năm 2015, K Kayalvizhi, Dr L Cathrine và K Sahira Banu đã khảo sát thành phần hóa học của lá cây đu đủ cái ở Ấn Độ với 7 dung môi ethanol, methanol, acetone, chloroform, petroleum ether, hexane và ethyl acetate Kết quả cho thấy sự

có m t của các hợp chất phenol, protein, amino acid, carbohydrate, glycoside, flavonoid, saponin, alkaloid, phytosterol và terpenoid [86]

Năm 2015, Stephen Chinwendu và cộng sự công bố thành phần hóa học của

hoa cây đu đủ ở Nigeria Kết quả cho thấy trong hoa chứa saponin (0,07%), alkaloid (0,05%), tannin (0,002%) và flavonoid (2,8%) Ngoài ra còn chứa các nguyên tố vô

cơ Na, Ca, Mg, P và các vitamin như B1, B2, B3, C [49]

Cũng trong năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố kết quả trong

hoa cây đu đủ đực có chứa các thành phần gồm triterpenoid, steroid, flavonoid, tannin, glycoside và saponin [106]

Năm 2017, Sunday Ahamefula Ezekwe và cộng sự đã xác định các hợp chất hóa học trong quả đu đủ xanh bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ GC-

MS bao gồm acid octadecanoic (71) (23,84%), acid hexadecenoic (72) (19,17%) và acid hexadecanoic (73) (18,25%) [63]

Năm 2017, Agung Nugroho và cộng sự đã phân lập, định lượng 7 flavonoid gồm quercetin-3-(2G-rhamnosylrutinoside) (74), kaempferol-3-(2G-

rhamnosylrutinoside) (75), quercetin-3-rutinoside (68), myricetin-3-rhamnoside (76), kaempferol-3-rutinoside (69), quercetin (28) và kaempferol (13) từ lá cây đu

đủ thu hái t i thành phố Pelaihari, tỉnh South Kalimantan, Indonesia Kết quả cho thấy kaempferol-3-(2G-rhamnosylrutinoside) (75) là flavonoid chiếm hàm lượng cao

nhất ở cả dịch chiết methanol lẫn trong phân đo n n-butanol [110]

Cũng trong năm 2017, Muhamad và cộng sự đã xác định được 28 hợp chất hóa học trong dịch chiết petroleum ether của vỏ quả đu đủ bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ GC-MS Kết quả thu được cho thấy 28 hợp chất hóa học thuộc các lớp chất acid béo, ester, ankan, tocopherol và sterol Trong các sterol thu

được thì thấy có sự xuất hiện của stigmasterol (77) t i thời gian lưu 36,727 [105]

Năm 2018, Yunahara Fariada và Iswahyuni Iswahyuni đã phân lập được hợp

chất 2-methoxy-4-vinylphenol (78) từ dịch chiết ethanol lá cây đu đủ thu hái t i

thành phố Balittro, tỉnh Bogor, Indonesia [65]

Cấu trúc hóa học của một số hợp chất đã phân lập từ cây đu đủ được trình bày trên Hình 1.2

HN

O

NH

O O

H2C C

(CH2)7

C=O O

C=O

H C

H2C C

H2C O

H3C

H

CH3H

rhamnopyranosyl)glucopyranoside

(69) R = O-rutinoside

(75) R = 2G-rhamnosylrutinoside

O

CH3

O H

O

H3C O

N

O

CH3

O N O

(21)

O OH

C

O HO

C

O HO

HO

OH O

HO OH

O

OH

OH O

OH HO

HO

C O HO

OH

OH HO

H nh 1.2 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất phân lập từ cây đu đủ

Tóm tắt kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của các bộ phận cây đu đủ được thể hiện ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cây đu đủ

Bộ phận

Nhóm chất: Glucosinolate [91]

Quả Benzyl isothiocyanate (33), benzyl glucosinolate (52)

H t Benzyl isothiocyanate (33), benzyl glucosinolate (52),

glucotropacolin (53) Nhóm chất: Phenolic, flavonoid [5], [6], [14], [25], [46], [65], [108], [110]

Quả Kaempferol (13), acid caffeic (25), acid p-coumaric (26), acid

protocatechuic (27), quercetin (28), rutin (68), acid ferulic (79), acid gallic (80), myricetin (81), isorhamnetin (82)

Lá Danielone (8), acid pluchoic (10), apocynol A (11), kaempferol

(13), acid caffeic (25), acid p-coumaric (26), acid protocatechui (27), quercetin (28), 5,7-dimethoxycoumarin (29), quercetin-3-

2-Hoa đu đủ đực Kaempferol (13), kaempferol-3-O-β-glucopyranosid (14)

Nhóm chất: Carotenoid [12], [108]

Quả β-carotene (2), luteine (3), α-carotene (83), 9-cis β-carotene

(84), lycopene (85), α-cryptoxanthin (86), β-cryptoxanthin (87)

Lá β-carotene (2), luteine (3)

Nhóm chất: Alkaloid [5], [20], [25], [57], [73], [91], [139]

Lá Carpaine (1), carpainone (9), pseudocarpaine (12),

dehydrocarpaine I (21), dehydrocarpaine II (22), choline (58)

Quả, h t Carpaine (1)

Nhóm chất: Glycoside [56], [91], [140]

Quả Benzyl-β-D-glucoside (18), 2-phenylethyl-β-D-glucoside (36),

4-hydroxyphenyl-2-ethyl-β-D-glucoside (37), 4 đồng phân malonate benzyl-β-D-glucoside (38-41)

Lá, thân Prunasin (23), sambunigrin (24)

Hoa, cuống lá

đu đủ đực

Benzyl-β-D-glucoside (18)

Nhóm chất: Triterpene [4]

Lá Sterculin A (6) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol (7)

Nhóm chất: Acid hữu cơ và dẫn xuất [25], [63], [91], [140]

Lá Acid malic (31), acid quinic (60); dẫn xuất của acid malic:

caffeoyl malate (61), coumaroyl malate (isomer 1) (62), coumaroyl malate (isomer 2) (63), feruloyl malate (isomer 1) (64), feruloyl malate (isomer 2) (65)

p-Quả Acid citric (30), acid malic (31), acid butyric (42), acid

n-hexanoic (43), acid n-octanoic (44), acid myristic (45), acid

palmatic (46), acid stearic (47), acid linoleic (48), acid linolenic

(49), acid cis-vaccenic (50), acid oleic (51), acid octadecanoic

(71), acid hexadecenoic (72), acid hexadecanoic (73)

1.3 T nh h nh nghiên cứu v hoạt tính sinh học của cây đu đủ

Các phương pháp nghiên cứu v ho t tính sinh học của thực vật được các nhà khoa học đ c biệt quan tâm [1], [23], [82] Ho t tính sinh học các bộ phận của cây

đu đủ được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới nghiên cứu và công bố khá

phong phú

1.3.1 t i

Năm 1994, Satrija F và cộng sự nghiên cứu tác d ng trị giun sán của nhựa đu

đủ đã được thử nghiệm để diệt giun sán ở súc vật Kết quả thu được cho thấy tác

d ng trên Asaris sum (sán lợn) ghi nhận li u 4g và 8g nhựa/kg có khả năng diệt

được 80% và 100% sán sau 7 ngày trị liệu [125]

Năm 2001, Kermanshai R và cộng sự nghiên cứu dịch chiết từ h t đu đủ được

thử nghiệm để trị sán Caenorhabdi tiselegans Kết quả cho thấy trong h t có benzyl

isothiocyanate (BITC) (33) là ho t chất chính có tác d ng diệt giun sán Các bộ

phận khác nhau của cây cũng đã được thử nghiệm v ho t tính diệt giun Ascaridia galli nhi m ở gia cầm [88]

1.3.2 ạ t

Năm 2000, Eno AE và cộng sự nghiên cứu dịch chiết ethanol từ quả đu đủ xanh được thử nghiệm trên chuột cống trắng đực Chia chuột thành 3 nhóm (mỗi nhóm 15 con), nhóm cao huyết áp do thận, cao huyết áp do muối-DOCA và nhóm bình thường Mỗi nhóm l i chia thành các nhóm ph : nhóm không chữa trị, nhóm trị bằng hydralazin và nhóm trị bằng dịch chiết từ quả đu đủ Kết quả ghi nhận dịch chiết (20 mg/kg, dùng IV) có ho t tính làm h huyết áp tương đương với hydralazin (200 microg/100g, dùng IV) và dịch chiết còn làm h huyết áp m nh hơn hydralazin (28%) ở nhóm chuột có huyết áp cao Các kết quả này cho rằng nước ép từ quả đu

đủ gây h huyết áp do ho t tính trên các th thể α-adrenoceptive [60]

1.3.3 k i k

Năm 1997, Giordani R và cộng sự nghiên cứu tác d ng của nhựa đu đủ ức chế

sự tăng trưởng của nấm Candida albicans khi thêm vào môi trường cấy nấm Sự ức

chế xảy ra ở giai đo n tăng trưởng lũy tiến và do tác động gây phân hủy vách tế bào nấm bằng cách gây rối lo n thành phần polysaccharid của vách tế bào [71]

Năm 1999, Nguy n Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình đã nghiên cứu tác

d ng kháng khuẩn của flavonoid chiết từ lá cây đu đủ Các tác giả th nghiệm với 5 chủng vi khuẩn và 2 chủng nấm gây bệnh Nồng độ flavonoid th nghiệm là 0,4 mg/mL Kết quả, flavonoid trong lá đu đủ thể hiện ho t t nh kháng khuẩn tốt đối với

các chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm bao gồm Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella typhi T239, Salmonella typhi T241, Candida albicans, Candida stellaloides [7]

Năm 2006, Đỗ Huy Bích và Đ ng Quang Chung đã công bố nghiên cứu cao lá

cây đu đủ có tác d ng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và Staphylococcus aureus Cao chiết từ vỏ và h t có tác d ng kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri Benzyl isothiocyanate (33) phân lập

từ cây đu đủ, ức chế sự phát triển của nhi u lo i vi khuẩn gram dương, gram âm

như Escherichia coli, Penicillium notatum và Shigella R cây đu đủ có tác d ng

Năm 2012, Moses Alo và cộng sự đã chứng minh dịch chiết lá cây đu đủ bằng

nước l nh và ethanol đ u có ho t t nh ức chế vi khuẩn Salmonella typhi [31]

Năm 2013, Okunola và cộng sự đã dùng nước, ethanol, acetone chiết lá cây đu

đủ tươi và khô Nồng độ dịch chiết thử nghiệm là 25; 50; 100 μg/mL trên cả vi khuẩn và nấm Các dịch chiết đ u có ho t t nh kháng vi khuẩn gram dương và gram

âm Dịch chiết ethanol, acetone có ho t t nh m nh hơn so với dịch chiết nước Dịch chiết từ lá khô có tác d ng m nh với vi khuẩn gram dương và gram âm Trong khi

đó, dịch chiết từ lá tươi chỉ có tác d ng m nh với vi khuẩn gram âm Dịch chiết từ

lá khô còn có khả năng kháng một số lo i vi khuẩn mà thuốc kháng sinh đã không thể ức chế, đồng thời ho t t nh kháng khuẩn m nh hơn ho t t nh kháng nấm [28]

Từ năm 2008-2013, một số tác giả ở Ấn Độ đã nghiên cứu ho t t nh kháng khuẩn, kháng nấm của một số lo i lá, trong đó có lá cây đu đủ Các tác giả khẳng

định, dịch chiết lá cây đu đủ bằng nước, ethanol, chloroform, n-hexane đ u có ho t

tính kháng khuẩn, kháng nấm tốt [22], [40], [138]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã chứng minh hợp chất pseudocarpaine (12) có khả

năng kháng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus với IC50 = 80 µg/mL, không thể hiện ho t tính kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/mL (với IC50 > 128 µg/mL) [5]

Năm 2015, K Kayalvizhi và cộng sự đã công bố ho t tính kháng khuẩn của lá cây đu đủ cái thu hái ở Ấn Độ đối với các vi khuẩn gram dương và gram âm Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol lá cây đu đủ cái ức chế các vi khuẩn gram dương:

Staphylococcus aureus, Staphylococcus faecalis và các vi khuẩn gram âm: Escherichia coli, Klebsiella pneumonis, Enterobacter aerogenes, Salmonella paratyphi, Vibro chloreae [86]

Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết các bộ phận cây đu đủ đều có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung khảo sát về dịch chiết thô, chưa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất hóa học phân lập từ cây đu đủ Chưa có nhiều công bố về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của hoa đu đủ đực

1.3.4 t ướ t ư

Năm 2001, Ph m Kim Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá cây đu đủ có tác d ng ức chế sự phát triển u báng gây ra bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [11]

Năm 2002, Asmah Rahmat và cộng sự đã kiểm tra khả năng ức chế sự tăng

sinh của tế bào ung thư vú, ung thư gan bằng lycopene tinh khiết, lycopene (85)

tách chiết từ quả đu đủ, dưa hấu và nước ép quả đu đủ Kết quả, nước ép quả đu đủ

và lycopene tinh khiết đã ức chế tế bào ung thư gan Hep-G2 với IC50 tương ứng là

20 mg/mL và 22,8 µg/mL Tuy nhiên, nước ép quả đu đủ và lycopene tinh khiết đ u

không ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú MDA-MB-21 Lycopene chiết từ quả đu đủ không ức chế sự tăng sinh của các dòng tế bào khác [118]

Năm 2006, Đỗ Thị Thảo đã công bố c n chiết methanol của lá cây đu đủ chỉ

có tác d ng gây độc tế bào ung thư phổi LU-1 với IC50 = 19,2 μg/mL và không có tác d ng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư

vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư ti n liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7 Đồng thời c n chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [17]

Năm 2006, Rumiyati và Sismindari dan Ariyani đã chứng minh trong lá cây

đu đủ có chứa protein bất ho t ribosome (RIPs) RIPs có khả năng gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư vú T47D với IC50 = 2,8 μg/mL Đồng thời nghiên cứu này đã chứng minh ảnh hưởng của protein có chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2, ảnh hưởng của các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thư vú T47D Mức độ biểu hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn 63% Các kết quả này cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của

tế bào ung thư [123]

Năm 2008, Morimoto và cộng sự đã công bố chất chiết bằng nước từ các bộ phận khác nhau của cây đu đủ có tác d ng ngăn ngừa, tiêu diệt ho c ức chế nhi u

lo i tế bào ung thư như d dày, phổi, tuyến t y, gan, máu, lymphoma, bệnh b ch cầu, Các tác giả đã thử dịch chiết cây đu đủ với nồng độ 1,25-27 mg/mL và sử

d ng 3H-thymidine là yếu tố đánh dấu Kết quả, các bộ phận khác nhau của cây đu

đủ (r , thân, quả) đ u có ho t t nh chống ung thư Các tác giả đã tiến hành sắc k lọc gel dịch chiết lá cây đu đủ để chia thành các phân đo n có trọng lượng khác nhau, sau đó đánh giá ho t t nh chống ung thư của các phân đo n Họ tìm thấy hai phân đo n có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, một phân đo n chứa các phân tử có trọng lượng 1700; 1000; 700 và 300; phân đo n còn l i gồm các hợp chất với trọng lượng phân tử 600, 400 và 200 Các hợp chất trong phân đo n chứa các phân tử có trọng lượng 1700; 1000; 700 và 300

có UV ở bước sóng 260 nm [103]

Năm 2010, Noriko Otsuki và cộng sự đã nghiên cứu tác d ng chống ung thư của dịch chiết lá cây đu đủ bằng nước (nồng độ 0,625-20 µg/mL) với các dòng tế bào ung thư khác nhau, bao gồm các dòng tế bào khối u rắn và tế bào t o máu Kết quả không có sự khác biệt giữa các dòng tế bào ung thư, đi u đó có ngh a là cơ chế diệt tế bào được thông qua việc k ch ho t quá trình tự chết của tế bào ung thư Tác giả chứng minh dịch chiết từ lá đu đủ làm tăng hàm lượng các cytokine, hỗ trợ hệ

mi n dịch để tấn công vào các tế bào ung thư Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine d ng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống l i khối u Sau đó tác giả sử d ng màng lọc để tách

thành 2 phần có trọng lượng phân tử khác nhau Các chất có ho t t nh chống ung thư và đi u hòa mi n dịch được xác định là nằm ở phần có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 1000 [112]

Năm 2013, Khaled N Rashed và Gerda Fouche đã nghiên cứu tác d ng chống ung thư trên các dòng tế bào TK10 (thận), UACC62 (ung thư hắc tố) và MCF-7

(vú) của các dịch chiết cây đu đủ ở đi u kiện in vito Kết quả cho thấy dịch chiết

ether dầu hỏa ở nồng độ 100 µg/mL có tác d ng chống ung thư đáng kể đối với dòng tế bào ung thư MCF-7 và có tác d ng chống ung thư t hơn đối với hai dòng tế bào ung thư TK10 (thận), UACC62 (ung thư hắc tố) trong khi các chiết xuất khác

có tác d ng chống ung thư nhẹ đối với ba dòng tế bào ung thư trên [120]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định được phân đo n dịch chiết CH2Cl2 của lá cây đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/mL), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/mL) và ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16

µg/mL) Đồng thời hai hợp chất carpaine (1) và pseudocarpaine (12) phân lập từ

phân đo n CH2Cl2 của lá cây đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có ho t tính gây độc m nh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người bao gồm ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1 và ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) Bên c nh đó, Hồ Thị Hà lần đầu tiên chứng minh được khả năng k ch ho t

enzyme caspase 3/7 của hai hợp chất carpaine (1) và pseudocarpaine (12) (tương

ứng là 386,5 và 778 RFU) phân lập từ lá cây đu đủ ở nồng độ thử nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30 µg/mL) nhưng không m nh khi so sánh với chất đối chứng là tamoxifen (3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/mL) [5]

Năm 2015, Marline Nainggolan và Kasmirul công bố nghiên cứu dịch chiết ethanol của hoa cây đu đủ đực có tác d ng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư

vú MCF-7 [106]

Năm 2016, Thao T Nguyen và cộng sự đã công bố kết quả nước ép lá cây đu

đủ không chỉ thể hiện tác d ng gây độc tế bào m nh đối với tế bào ung thư biểu mô

tế bào vảy ở người SCC25, mà còn t o ra hiệu quả chọn lọc ung thư đáng kể đối với các tế bào keratinocyte không gây ung thư ở người [107]

Năm 2020, Võ Thị Ngà và cộng sự đã xác định dịch chiết ethanol của lá, hoa,

r cây đu đủ cái và cây đu đủ đực cùng các hợp chất stigmast-4-ene-3-one (15),

benzy-β-D-glucoside (18), uracil (19) được phân lập từ hoa và cuống lá cây đu đủ

đực thu hái t i xã Diêu Trì, huyện Tuy Phước, tỉnh Bình Định không có tác d ng gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư MCF-7, Hep-G2, HeLa, NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/mL [140]

Các nghiên cứu ở đi u kiện in vitro v việc dùng các bộ phận cây đu đủ để ức

chế, tiêu diệt tế bào ung thư được tóm tắt trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Tác dụng của dịch chiết và hợp chất hóa học từ cây đu đủ lên các

dòng tế bào ung thư hác nhau trong đi u kiện in vitro [5], [67], [106], [108]

Dòng tế bào ung thư Phương pháp xử lý Kết quả

- Ung thư vú

- Lycopene (85) tinh khiết

và nước p quả đu đủ ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan Hep-G2 (IC50 tương ứng là 22,8 µg/mL và 20 mg/mL) nhưng không ức chế tế bào ung thư vú và tế bào thường

Ung thư vú MCF-7 xử l

sodium nitroprusside,

oxide nitric

Dịch chiết ethanol vỏ quả đu đủ (50-640 µg/mL)

Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú MCF-7

Ung thư vú T47D Phân mảnh protein

RIPS phân lập từ lá cây đu đủ

- Các phân mảnh protein gây độc tế bào (IC50 = 2,8 µg/mL)

- K ch th ch quá trình tự chết với biểu hiện của p53 (tăng 59,4%) và BCl-2 (giảm 63%)

- Ung thư d dày

- Ung thư tuyến t y

- Ung thư buồng trứng

- Tế bào lymphoma

- Ung thư vú MCF-7

- Ung thư tử cung

Dịch chiết nước của lá cây đu đủ (1,25-27 mg/mL)

Tác d ng chống ung thư, nồng độ tác d ng ph thuộc vào từng dòng tế bào ung thư và ngăn ch n

sự tổng hợp ADN

- Tế bào T

- Tế bào lymphoma

- Bệnh b ch cầu mãn t nh

- Ung thư gan Hep-G2

Dịch chiết nước của lá cây đu đủ (0,625-20 mg/mL)

- Ức chế sự tăng sinh của các dòng tế bào khối u rắn

và tế bào t o máu

- Dịch chiết nước lá cây đu

Dòng tế bào ung thư Phương pháp xử lý Kết quả

- Ung thư phổi PC-14

- Ung thư tuyến t y

- Ung thư biểu mô H2452

- Ung thư vú MCF-7

đủ làm giảm cytokine IL-2

và IL-4, trong khi đó l i làm tăng cytokine Th1 như

Ức chế đáng kể sự phát triển của tế bào ung thư phổi (IC50 tương ứng 18,21 µg/mL), tế bào ung thư vú (IC50 tương ứng 19,16 µg/mL) và tế bào ung thư biểu mô (IC50tương ứng 18,44 µg/mL)

- Ung thư biểu mô KB

- Ung thư máu HL-60

- Ung thư phổi LU-1

- Ung thư vú MCF-7

Chất tinh khiết carpaine (1) và pseudocarpaine (12)

phân lập từ lá cây đu

đủ

Carpaine (1) và

pseudocarpaine (12) ức

chế đáng kể sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô (IC50 lần lượt tương ứng 1,13 và 1,66 µg/mL), tế bào ung thư máu (IC50 lần lượt tương ứng 2,94 và 3,49 µg/mL), tế bào ung thư phổi (IC50 lần lượt tương ứng 1,29 và 2,17 µg/mL) và tế bào ung thư

vú (IC50 lần lượt tương ứng 1,34 và 2,43 µg/mL) Ung thư vú MCF-7 Dịch chiết ethanol của

hoa cây đu đủ đực

Ức chế đáng kể sự phát triển của dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ở nồng độ khảo sát

Tóm tắt kết quả nghiên cứu v ho t t nh gây độc tế bào ung thư và cơ chế tác

d ng của các nhóm chất glucosinolate, phenolic, flavonoid, carotenoid, alkaloid được tìm thấy trong các bộ phận khác nhau của cây đu đủ được thể hiện ở Bảng 1.3

Bảng 1.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của glucosinolate, phenolic, flavonoid, carotenoid và alkaloid trong cây đu đủ [5], [108]

Các hợp chất hóa học Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ

của các hợp chất hóa học Nhóm chất: Glucosinolate

- Benzyl glucosinolate (52): 12,7 µmol/g

h t, < 0,03 µmol/g thịt quả

- Benzyl isothiocyanate (33): 4,6 µmol/g,

< 0,0003 µmol/g thịt quả

Nghiên cứu in vivo trên chuột, các hợp

chất này đã có tác d ng ức chế ung thư ruột, ung thư gan, ung thư phổi đã di căn, ung thư tuyến t y

- Benzyl glucosinolate (52): 4 µmol/g

h t; 0,04 µmol/g thịt quả; 2 µmol/g vỏ

- Benzyl isothiocyanate (33): giảm trong

vỏ và tăng trong thịt quả suốt thời gian

phát triển

Ung thư bàng quang, ung thư vú

Nghiên cứu in vitro trên ung thư vú

MDA-MB-231, ung thư vú MCF-7, ung thư ruột kết HCT116 và ung thư

ti n liệt tuyến

- Glucosinolate tổng số: 18±0,8 µmol/g

h t

- Benzyl glucosinolate (52): 6-8 µmol/g

h t; 0,4-0,6 µmol/g thịt quả (quả non)

- Ung thư máu HL-60

- Ung thư tuyến t y

- Ung thư xương sarcoma U-2

- Ung thư d dày AGS

- Ung thư ruột kết HT29

- Kiểm soát chu kỳ phân bào

- Trong thịt quả: có vết của acid caffeic

(25), acid gallic (80), acid protocatechuic

(27)

Nghiên cứu in vivo trên chuột có tác

d ng ức chế ung thư gan, ung thư biểu

mô, ung thư ti n liệt tuyến, ung thư đ i trực tràng, ung thư vú và ung thư phổi

Các hợp chất hóa học Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ

Nghiên cứu in vivo có tác d ng ức chế

ung thư phổi, ung thư ti n liệt tuyến, ung thư dòng tế bào monocytic U937

và ung thư tuyến t y T98G

- Ức chế sự tăng sinh tế bào

- Cảm ứng biểu hiện gen ức chế khối u

- Tăng cường chức năng mi n dịch

- Ức chế enzyme ở pha I và II trong chu kỳ phân bào

- Ức chế sự kết d nh tế bào và xâm lấn

- Cảm ứng quá trình tự chết

- Ức chế sự truy n t n hiệu

- Ngăn ch n sự hình thành m ch máu trong khối u

Nghiên cứu in vivo trên cơ thể người

có tác d ng phòng ung thư phổi, ung thư ti n liệt tuyến và ung thư tuyến

Nghiên cứu in vivo trên chuột có tác

d ng ức chế ung thư da, ung thu phổi, ung thư vú, ung thư ruột kết, ung thư

ti n liệt tuyến, ung thư d dày và ung thư gan

Các hợp chất hóa học Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ

Nghiên cứu in vivo có tác d ng ức chế

ung thư ruột kết HuCC, ung thư b ch cầu EHEB, tế bào lympho nguyên bào, ung thư gan, ung thư biểu mô, ung thư

ti n liệt tuyến và ung thư ruột kết

- Cảm ứng quá trình phân chia tế bào

- Phát hiện các yếu tố báo hiệu

- Ức chế sự hình thành m ch máu trong khối u

Nghiên cứu in vitro có tác d ng ức chế

các tế bào ung thư:

- Ung thư biểu mô KB

- Ung thư máu HL-60

- Ung thư phổi LU-1

- Ung thư vú MCF-7

Cơ chế tác d ng: Tế bào ung thư phổi LU-1 chết do quá trình k ch ho t enzyme caspase 3/7, không phải chết

do quá trình gây độc tế bào

Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong cây đu đủ có nhiều hợp chất hóa học có hoạt tính chống ung thư Một số hợp chất hóa học trong cây đu đủ

đã được chứng minh là tác dụng lên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau theo nhiều cơ chế như gây độc tế bào, cảm ứng quá trình tự chết, cảm ứng quá trình

phân chia tế bào, hạn chế sự xâm lấn và di căn, hạn chế sự hình thành mạch máu nuôi khối u, ức chế enzyme ở pha I và II trong chu kỳ phân bào, ức chế sự kết dính

tế bào và xâm lấn, ức chế sự truyền tín hiệu và điều hòa miễn dịch,….Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào bộ phận lá và quả đu đủ Chưa có nhiều công bố về hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất hóa học phân lập từ hoa cây đu đủ đực

1.3.5 ống oxy hóa

Gốc tự do là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ra nhi u lo i bệnh trong cơ thể, trong đó có bệnh ung thư Gốc tự do được t o ra trong cơ thể bởi nhi u cách khác nhau như ô nhi m môi trường, chất phóng x , thuốc, hóa chất, căng thẳng thần kinh,

Năm 2008, Ayoola và cộng sự đã chứng minh chất chiết từ lá cây đu đủ bằng ethanol có ho t t nh chống oxy hóa Nồng độ chất chiết cần để ức chế 50% gốc tự

do DPPH IC50 là 0,58 mg/mL, trong khi đó vitamin C có IC50 là 0,054 mg/mL [35] Năm 2010, Srikanth G.S và cộng sự dùng nước để chiết các chất có trong lá cây đu đủ Chất chiết thu được đem thử ho t tính chống oxy hóa bằng các phương pháp khác nhau như DPPH; 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate); acid nitric; superoxit; hydroxyion và lipid peroxidase Giá trị IC50 tương ứng của các phương pháp là 198, 185, 244, 323, 461 và 922 µg/mL [134]

Năm 2011, Aysun và cộng sự đã chứng minh các giống đu đủ khác nhau có tổng hàm lượng phenol khác nhau và ho t t nh chống oxy hóa cũng khác nhau Có mối quan hệ tỷ lệ thuận giữa khả năng chống oxy hóa và tổng hàm lượng phenol trong lá cây đu đủ Đi u đó chứng tỏ phenol gây ra ho t t nh chống oxy hoá [114] Năm 2013, Vuong và cộng sự đã tối ưu hóa đi u kiện chiết phenol tổng số trong lá cây đu đủ bằng dung môi nước Bột chiết phenol tổng số thô đem so sánh

ho t t nh chống oxy hóa với butylate hydroxytoluen, vitamin C, vitamin E và epigallocatechin gallate Kết quả, bột chiết phenol tổng số thô từ lá đu đủ có ho t

t nh chống oxy hóa thấp hơn butylate hydroxytoluen, vitamin C, vitamin E và epigallocatechin gallate [141]

Cũng trong năm 2013, Maisarah A.M và cộng sự nghiên cứu ho t tính chống oxy hóa từ các bộ phận khác nhau của cây đu đủ bao gồm quả chín, quả xanh, h t

và lá non Hai tác nhân được sử d ng để đánh giá là DPPH và β-carotene Kết quả

cho thấy ho t tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự lá non → quả xanh → quả

ch n → h t Tuy nhiên, các ho t chất có tác d ng chống oxy hóa còn chưa được phân lập [98]

Năm 2017, Agung Nugroho và cộng sự đã đánh giá ho t tính chống oxy hóa của 7 flavonoid được phân lập từ lá cây đu đủ thu hái t i thành phố Pelaihari, tỉnh South Kalimantan, Indonesia bằng phương pháp peroxynitrite-scavenging Kết quả thu được cho thấy cả 7 flavonoid đ u thể hiện ho t tính chống oxy hóa bằng phương

pháp này và khả năng chống oxy hóa m nh hơn chất đối chứng dương penicillamine [110]

L-Năm 2018, Yunahara Fariada và Iswahyuni Iswahyuni đã nghiên cứu ho t tính chống oxy hóa của dịch chiết ethanol lá cây đu đủ thu hái t i thành phố Balittro,

tỉnh Bogor, Indonesia bằng phương pháp của Wiliam et al và Blois với tác nhân sử

d ng để đánh giá là DPPH Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol lá cây đu đủ có ho t tính oxy hóa m nh với IC50 là 100,0±0,07 ppm [65]

Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết các bộ phận cây đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung ở dịch chiết thô, nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất hóa học phân lập

từ cây đu đủ còn rất hạn chế Chưa có nhiều công bố về hoạt tính chống oxy hóa của hoa cây đu đủ đực

1.3.6 t ượ k

Ngoài những ho t t nh sinh học trên, các bộ phận khác nhau của cây đu đủ cũng đã được chứng minh có tác d ng kháng virus sốt xuất huyết, tác d ng giảm

thời gian đông máu, kháng viêm,

Năm 2008, Bamidele V và cộng sự đã công bố ho t tính kháng viêm của dịch

chiết cồn từ lá cây đu đủ [113]

Năm 2011, các tác giả ở Malaysia đã cho chuột uống chất chiết từ lá cây đu đủ với li u lượng 2000 mg/kg thể trọng, uống một li u duy nhất, theo dõi trong 14 ngày Kết quả, chuột không bị chết, không làm thay đổi trọng lượng cơ thể Các cơ quan nội t ng bình thường Ngoài chất b o trung t nh, các thông số sinh hóa khác không thay đổi so với nhóm đối chứng [74]

Cũng trong năm 2011, Nisar và cộng sự đã sử d ng chất chiết lá cây đu đủ bằng nước để đi u trị cho bệnh nhân sốt xuất huyết Kết quả cho thấy lá cây đu đủ chiết bằng nước có khả năng chống l i bệnh sốt xuất huyết [26]

Năm 2012, Adlin và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu độc t nh cấp của lá cây

đu đủ trên chuột Tác giả đã cho chuột uống 0,01; 0,14; 2 g/kg thể trọng, li u l p l i trong 28 ngày Kết quả, chất chiết không làm chuột chết, trọng lượng cơ thể, lượng thức ăn, nước uống không thay đổi Các thông số huyết học giữa nhóm th nghiệm

và nhóm đối chứng không có sự khác biệt Kiểm tra mô bệnh học của tất cả các cơ quan nội t ng không có sự thay đổi [25]

Năm 2013, các nhà khoa học Nigeria đã công bố chất chiết lá cây đu đủ bằng nước được sử d ng để chống viêm và giảm đau, được thử nghiệm trên chuột Kết quả cho thấy chất chiết với li u lượng sử d ng 100 và 200 mg/kg trọng lượng cơ thể

đã làm giảm nhẹ các khối viêm đồng thời có tác d ng giảm đau rõ rệt [29]

Cũng trong năm 2013, Swati Patil và cộng sự đã công bố chất chiết lá cây đu

đủ bằng nước làm tăng số lượng tiểu cầu và làm giảm thời gian đông máu ở chuột [115]

Nhận xét chung – các v đề c n nghiên cứu ti p theo

Như vậy, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các bộ phận cây đu đủ

đã được nghiên cứu trong và ngoài nước Tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào bộ phận lá và quả đu đủ, các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bộ phận hoa cây đu đủ đực hầu như còn ít Việc sử dụng hoa cây đu đủ đực để chữa bệnh trong dân gian, đặc biệt là hỗ trợ điều trị bệnh ung thư chủ yếu dựa vào kinh nghiệm Vì vậy, việc nghiên cứu phân lập các hợp chất hóa học từ bộ phận hoa cây đu đủ đực, xác định cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất là mục tiêu nghiên cứu của luận

án, tạo cơ sở khoa học ban đầu về việc sử dụng nguồn dược liệu bổ ích này

Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của bộ phận lá cây đu đủ đực với mục đích đóng góp các thông tin khoa học của cây đu đủ đực vào kho tàng các hợp chất thiên nhiên của Việt Nam và thế giới, đồng thời cũng góp phần định hướng việc khai thác và sử dụng cây đu đủ đực vào thực tiễn một cách có hiệu quả

Hiện nay, nám da là một bệnh rất phổ biến, đặc biệt là ở các khu vực có lượng ánh sáng mặt trời với cường độ cao như ở nước ta Nám da thường ảnh hưởng nhiều đến phái nữ, do sự tăng sắc tố ở những vùng đặc biệt của làn da như vùng mặt sẽ làm giảm mức độ thẩm mỹ Mặc dù, đã có khá nhiều phương pháp điều trị mới, có rất nhiều mỹ phẩm và thuốc điều trị nám da trên thị trường nhưng vẫn chưa đáp ứng được hết nhu cầu làm đẹp, thêm vào đó những phương pháp này vẫn còn khá nhiều tác dụng phụ không mong muốn Vì vậy, vẫn rất cần những nghiên cứu

để tìm ra những loại thuốc khác giúp hỗ trợ cho việc điều trị và ít gây ra các tác dụng phụ không mong muốn Để hướng đến điều trị bệnh nám da thì một số nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta tập trung vào việc tìm kiếm các cây thuốc và hoạt chất ức chế enzyme tyrosinase giúp ngăn ngừa sự tạo thành sắc tố melanin Cho đến nay vẫn chưa có công bố về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của bộ phận hoa cây đu đủ đực cũng như các hợp chất hóa học phân lập từ bộ phận này Chính

vì vậy trong luận án này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính sinh học của hoa cây đu đủ đực theo định hướng về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase

1.4 Giới thiệu v enzyme tyrosinase

1.4.1 Khái ni m và vai trò c a enzyme tyrosinase

Tyrosinase (a tyrosine hydroxylase; EC 1.14.18.1) là enzyme chính, có vai trò oxy hóa L-tyrosine thành 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) và DOPA thành DOPA quinone Đây là hai phản ứng đầu tiên và quan trọng nhất trong tổng hợp melanin [43] Ngoài ra, còn có hai enzyme khác tham gia vào quá trình tổng hợp melanin là TRP-1 (DHICA oxidation) và TRP-2 (DOPAchrome tautomerase) [62], [89]

Melanin là một hợp chất phenolic sinh học cao phân tử có vai trò quan trọng trong việc t o nên sắc tố da ở người Ở người, melanin được tìm thấy trong da, tóc,

tế bào biểu mô sắc tố nằm dưới võng m c, tủy xương và lớp trong của tuyến thượng thận, vân m ch của tai trong và sắc tố mang tế bào thần kinh của một số h t nhân não sâu [43] Melanin giúp bảo vệ da chống l i các tác h i của tia cực t m, ngăn

ch n tia cực tím thâm nhập vào cơ thể một cách tự nhiên Melanin cũng rất quan trọng cho độ sắc nét của thị lực, có tác d ng làm giảm thiểu số lượng của chùm ánh sáng vào mắt Ngoài ra, melanin còn là chất chống oxy hóa, chất kháng khuẩn và nấm gây h i cho cơ thể

Một số bệnh v da có thể dẫn đến sự t ch lũy vượt mức lượng melanin ở biểu

mô Các bệnh này bao gồm nám da, tàn nhang và tăng sắc tố sau viêm [38] Biểu hiện bên ngoài của những bệnh này có thể tác động m nh đến tâm l người bệnh cũng như làm giảm các ho t động xã hội, hiệu quả trong công việc [48] Tuy nhiên,

t i nhi u quốc gia, các chất làm trắng da như hydroquinone, corticosteroids, các hợp chất chứa thủy ngân vẫn còn được sử d ng bất chấp sự nguy h i của chúng [68] Một số chất khác như arbutin, acid kojic, vitamin C cũng được sử d ng nhưng các chất này có nhược điểm là hiệu quả không cao ho c không b n Do đó, nhi u công trình đang được thực hiện để tìm ra các hợp chất làm trắng da mới, an toàn và hiệu quả hơn [90], [133]

1.4.2 Các ch t ức ch enzyme tyrosinase

a Các chất ức chế enzyme tyrosinase có nguồn gốc thiên nhiên

Polyphenol thực vật là nhóm các hợp chất có nhi u nhóm chức phenol, tiêu biểu là flavonoid Hơn 4000 flavonoid phân bố trong lá, h t, vỏ cây và hoa đã được xác định Các hợp chất này bảo vệ thực vật bằng cách chống l i tia cực t m và tác

nhân gây bệnh [75] Một số flavonoid như kaempferol (13), quercetin (28) và morin

thể hiện tác d ng ức chế enzyme tyrosinase, trong khi những flavonoid khác như catechin và rhamnetin l i đóng vai trò là các cơ chất của enzyme tyrosinase Một số

nghiên cứu cho thấy flavonoid có chứa nhóm α-keto có tác d ng ức chế enzyme

tyrosinase m nh [36]

Nhi u aldehyde và các hợp chất khác cũng được phân lập và xác định là có tác

d ng ức chế enzyme tyrosinase như cinnamaldehyde, (2E)-alkenal,

2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde, anisaldehyde, cuminaldehyde và acid cumic [92] Ho t động

ức chế enzyme tyrosinase của anisaldehyde và cuminaldehyde m nh hơn khoảng 2,5 và 16 lần tương ứng so với benzaldehyde Một số alkanal có tác d ng ức chế enzyme tyrosinase có thể là do sự tương tác kỵ nước của chúng với enzyme, làm

ảnh hưởng đến cấu trúc bậc ba của enzyme [52] Hợp chất (2E)-alkenal ức chế quá

trình oxy hóa L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) của enzyme tyrosinase, là

chất ức chế không c nh tranh và phần alkyl kỵ nước có liên quan đến ho t động ức chế của chúng [52]

Bên c nh những thực vật bậc cao thì trong nấm cũng có một số hợp chất có tác

d ng ức chế enzyme tyrosinase Acid dicarboxylic bão hòa được t o thành bởi quá

trình peroxy hóa lipid và ester hóa acid b o bằng nấm men, vi nấm Pityrosporum ovale có tác d ng gây độc nhất định trên các tế bào biểu bì t o sắc tố của khối u ác

t nh ở da, m c dù bình thường tế bào biểu bì t o sắc tố không bị ảnh hưởng [126]

Acid kojic (5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-γ-pyrone), một chất chuyển hóa của nấm được sản xuất bởi nhi u loài thuộc chi Aspergillus và Penicillium, có tác d ng ức chế sự hình thành sắc tố từ phản ứng oxy hóa L-DOPA, norepinephrin và dopamin

dưới sự xúc tác của enzyme tyrosinase Đi u này có ngh a rằng, acid kojic có thể

giảm chuyển hóa O-quinone thành O-diphenol, ngăn cản t o thành các sắc tố [83]

b Các chất ức chế enzyme tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp

Các hợp chất có nguồn gốc tổng hợp như hydroxylamin, các hợp chất chứa thiol, acid carboxylic thơm, dẫn xuất của acid cinnamic, trihydroxy chalconas, peptid, acid alkylbenzoic [77], N-hydroxy-N’-phenyl urea và N-hydroxy-N’-phenyl thiourea [53] có tác d ng ức chế enzyme tyrosinase Tropolone (2-hydroxy-2,4,6-

cycloheptatrien-1-on), có cấu trúc tương tự các cơ chất O-diphenolic của tyrosinase

[84], là một trong những chất ức chế enzyme tyrosinase m nh nhất Resorcinol được gắn nhóm thế ở vị tr C-4 là các chất ức chế tyrosinase yếu Trong các hợp chất này, tác d ng ức chế m nh nhất đ t được khi thay thế nhóm kỵ nước vào vị tr C-4, chẳng h n như 4-hexyl resorcinol và 4-dodecyl resorcinol Hợp chất 4-hexyl resorcinol là chất ức chế tyrosinase hiệu quả nhất khi sử d ng trong ngành công nghiệp thực phẩm vì khả năng hòa tan trong nước, ổn định, không độc h i, không gây đột biến, không gây ung thư và chất này cũng đã được công nhận là an toàn trong việc kiểm soát sự sẫm màu của táo cũng như khoai tây và bơ khi để ngoài không kh một thời gian dài [69]

c Các thuốc ức chế enzyme tyrosinase

Captopril là thuốc ức chế ho t động monophenolase và diphenolase của enzyme tyrosinase [61] Captopril được biết đến là chất t o chelat với đồng [81] Do

đó, có thể cho rằng captopril chủ yếu có tác d ng ức chế là do t o chelat với ion đồng ở vị tr ho t động của enzyme tyrosinase

Một số thuốc khác cũng có tác d ng ức chế ho t động của enzyme tyrosinase như penicillamine, được sử d ng trong đi u trị bệnh Wilson [96] và methimazole là thuốc kháng tuyến giáp Methimazole (1-methyl-2-mercaptoimidazole) ức chế cả

ho t động monophenolase và diphenolase của enzyme tyrosinase nấm Methimazole

ức chế ho t động enzyme tyrosinase của nấm bằng hai cách: liên hợp với

O-quinone, do đó ức chế rõ sự hình thành sắc tố và t o chelat với đồng t i vị tr ho t động của enzyme tyrosinase [21]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.) được thu hái t i Quảng

Nam-Đà Nẵng vào tháng 12 năm 2016 (Hình 2.1) Tên khoa học của mẫu được xác định bởi TS Ngô Văn Tr i, Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản số DD001 được lưu giữ t i

Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Ph l c 29)

H nh 2.1 Hoa và lá cây đu đủ đực

Hoa và lá cây đu đủ đực sau khi thu hái được lo i bỏ phần hư hỏng, rửa s ch, thái nhỏ, phơi trong bóng râm rồi sấy ở 50-60oC cho đến khô Sau đó, mẫu được xay thành bột Bột hoa và lá cây đu đủ đực được chia thành nhi u phần, bảo quản trong tủ l nh để sử d ng cho nhi u nội dung thực nghiệm (Hình 2.2)

Hình 2.2 Bột hoa và lá cây đu đủ đực

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

Dung môi sử d ng để chiết mẫu, ch y cột và triển khai sắc k lớp mỏng trong

nghiên cứu bao gồm n-hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate,

methanol lo i tinh khiết đã được cất l i qua cột Vigereux trước khi dùng để lo i bỏ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Đối với kỹ thuật chiết lỏng-lỏng: Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi với m c đ ch phân chia cao methanol tổng thành các cao phân đo n có

t nh phân cực khác nhau Cao methanol tổng được hòa tan vào một lượng methanol tối thiểu, sau đó thêm vào một lượng lớn nước cất và chiết phân bố lần lượt với các

dung môi n-hexane, chloroform và ethyl acetate bằng ph u chiết Với mỗi lo i dung

môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhi u lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể t ch dung môi Các dịch chiết được cất lo i dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất

quay chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao chiết n-hexane,

chloroform và ethyl acetate) để tiếp t c nghiên cứu

2.3.2 ư đ i oạt tí độc t o t ư c a các cao chi t

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm

sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển ho c diệt tế bào ung

thư ở đi u kiện in vitro

Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên t p chí Immunological Methods năm 1983 [104] Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá v sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám

ch t vào ti thể của tế bào ho t động, dưới tác d ng của enzyme dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ

và có độ ch nh xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và ho t động của tế bào

Mẫu thử: các cao chiết từ hoa và lá cây đu đủ đực

Các dòng tế bào thử nghiệm: A549 (ung thư phổi ở người), MCF-7 (ung thư

vú ở người) và Hep3B (ung thư gan ở người) do GS Jeong-Hyung Lee, Trường Đ i học Quốc gia Kangwon, Hàn Quốc cung cấp

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 ho c DMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS), 100 U/mL penicillin và 100 µg/mL streptomycin ở 37 ºC trong tủ ấm 5% CO2 Các tế bào được cấy chuyển vào phiến 96 giếng (mật độ tế bào 1×105 tế bào/giếng) và xử lý với các nồng độ mẫu thử khác nhau trong DMSO Sau 48 giờ ủ, thêm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) (5 mg/mL) vào các giếng và ủ tiếp 4 giờ Sau

đó g n bỏ môi trường và hòa tan tinh thể formazan trong 100 μL isopropanol Giá trị mật độ quang (OD) được đo bằng máy đọc Elisa (Mark Pro, Biorad, USA) ở bước sóng 570 nm Camptothecin được sử d ng làm đối chứng dương

Kết quả t nh được biểu di n bằng tỷ lệ tế bào sống sót (CS %)

CS % = [OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100

[OD (DMSO) – OD (ngày 0)]

2.3.3 ư phân lập các hợp ch t

Sắc k lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715) và RP-18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngo i ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm ho c dùng thuốc thử H2SO4 10% phun đ u lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

Sắc ký lớp mỏng đi u chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngo i ở hai bước sóng 254

nm và 366 nm, ho c cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch sulfuric acid 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép l i bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó c o lớp silica gel có chất, giải hấp ph và tinh chế l i bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp

Sắc k cột (CC) được tiến hành với chất hấp ph là silica gel pha thường và silica gel pha đảo Silica gel pha thường có cỡ h t là 40-63 m (240-430 mesh, Merck, Đức) Silica gel pha đảo YMC RP-18 (30-50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.) Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich, Mỹ) [3], [13]

2.3.4 ư x đ nh c u trúc hóa học c a các hợp ch t

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp giữa các thông số vật l , các dữ kiện phổ và các chuyển hóa hóa học cùng với việc phân t ch, so sánh với các tài liệu tham khảo [16], [18]

Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) được đo trên máy FT-ICR-Mass spectrometer t i Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

c Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ h t nhân một chi u (1

H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phổ cộng hưởng từ h t nhân hai chi u (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội) t i Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

(4-(2 Mẫu thử: các hợp chất phân lập từ hoa và lá cây đu đủ đực

- Các dòng tế bào thử nghiệm: A549 (ung thư phổi ở người), MCF-7 (ung thư

vú ở người) và Hep3B (ung thư gan ở người) do GS J M Pezzuto, Trường Đ i học Hawaii, Mỹ và GS Jeanette Maier, trường Đ i học Milan, Italia cung cấp

b Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

Các dòng tế bào ung thư ở người được nuôi cấy dưới d ng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbecco'

s Modified Eagle Medium) với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine; 1,5 g/L sodium bicarbonate; 4,5 g/L glucose; 10 mM

HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS (Gibco) Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm

CO2 ở đi u kiện 37oC, 5% CO2

c Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thư

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia

Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển ho c tiêu diệt

tế bào ung thư ở đi u kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp

của Monks [102] Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của

tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhi u (lượng protein càng nhi u) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong đi u kiện

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để

đi u chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (190 L môi trường) và

để chúng phát triển trong vòng 3-5 ngày

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190 L) được chuẩn bị thành 3 cột để làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, đ a đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng trichloroacetic acid –TCA

- Sau giai đo n phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 oC Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng

- Cuối cùng, sử d ng dung dịch tris(hydroxymethyl)aminomethane 10 mM để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đ a, lắc nhẹ trong 10 phút và sử d ng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả v hàm lượng màu của chất nhuộm SRB thông qua phổ hấp th ở bước sóng 515-540 nm

Tỷ lệ tế bào bị ức chế (%) khi có m t chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

% Tế bào bị ức chế = 100% - [OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100

[OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)]

- Các phép thử được l p l i 3 lần để đảm bảo tính chính xác Ellipticine Aldrich, Mỹ) ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL luôn được sử

(Sigma-d ng làm chất đối chứng (Sigma-dương DMSO 10% luôn được sử (Sigma-d ng như đối chứng âm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần m m máy tính TableCurve 2Dv4 (System software Inc., San Jose, California, Mỹ)

2.3.6 ư đ i oạt tính ức ch enzyme tyrosinase

Tác d ng ức chế enzyme tyrosinase in vitro được đánh giá theo phương pháp

của Mashuda và cộng sự với một số thay đổi nhỏ [101]

Mẫu thử: cao methanol và các hợp chất phân lập từ hoa cây đu đủ đực

Chuẩn bị mẫu thử: cao methanol và các hợp chất được hòa tan trong dung môi DMSO và đệm phosphate thành các dung dịch mẫu thử có nồng độ 0-100 µM Mẫu chứng có các thành phần tương tự như mẫu thử nhưng dung dịch mẫu thử được thay bằng dung dịch đệm kali phosphate Song song với mẫu chứng và mẫu thử, chuẩn bị mẫu trắng chứng và mẫu trắng thử nhưng 50 µL dung dịch tyrosinase 2,0 µM được thay bằng 50 µL dung dịch đệm kali phosphat

Cơ chất: L-tyrosine

Các bước tiến hành như sau: Lấy 130 µL dung dịch tyrosinase (113,3 U/mL) trong dung dịch đệm kali phosphate 50 mM (pH 6,5) trộn với 20 µL dung dịch mẫu thử (0-100 µM) trong 96 giếng Sau đó, bổ sung 50 µL dung dịch tyrosinase 2,0 µM vào hỗn hợp phản ứng và tiến hành phản ứng ở nhiệt độ 37oC trong máy ủ ELISA

200 Pro (TECAN) Ho t tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro trên đ a UV 96

giếng được đo ở 475 nm mỗi phút 1 lần, đo trong 20 phút Giá trị mật độ quang (OD) được đo bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 475 nm Acid kojic được sử d ng làm chất đối chứng dương Tỷ lệ ức chế enzyme tyrosinase (I %) được tính theo công thức sau:

I % = 100% - [OD (mẫu thử) – OD (mẫu trắng thử)] x 100

[OD (mẫu chứng) – OD (mẫu trắng chứng)]

Các phép thử được l p l i 3 lần để đảm bảo tính chính xác Số liệu được biểu

di n dưới d ng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Xtb ± SD) So sánh giá trị trung bình của các mẫu bằng one-way ANOVA với test hậu kiểm GraphPad Prism 6 để so

sánh giá trị trung bình giữa các mẫu Sự khác biệt có ngh a thống kê nếu P < 0,05

Giá trị IC50 (μg/mL hay µM) là nồng độ của một mẫu thử nghiệm mà t i đó mẫu có thể ức chế 50% ho t tính của enzyme tyrosinase Giá trị này sẽ được tính dựa vào phương trình đường thẳng y = ax + b (y là tỷ lệ ức chế I % và x là nồng độ mẫu) với hai giá trị a và b suy ra từ đồ thị

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cao chiết

3.1.1 ẩ ao i t

Kỹ thuật chiết ngâm dầm nguyên liệu hoa và lá cây đu đủ đực trong dung môi methanol kết hợp với máy siêu âm được lựa chọn sử d ng trong luận án để thu nhận cao methanol, với m c đ ch rút ngắn thời gian chiết, giảm lượng dung môi sử d ng

và không ảnh hưởng đến cấu trúc hóa học của các hợp chất Cao chiết methanol chứa các lo i hợp chất có trong hoa và lá cây đu đủ đực từ không phân cực đến rất phân cực, vì thế rất khó để tách riêng từng hợp chất tinh khiết cho các nghiên cứu tiếp theo Do đó, chúng tôi đã sử d ng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng để phân chia cao chiết methanol thành những cao phân đo n có t nh phân cực khác nhau Bên c nh

đó, với m c đ ch thu nhận các cao phân đo n để sàng lọc ho t t nh gây độc tế bào ung thư ở người nên chúng tôi tiến hành th nghiệm với một lượng nhỏ nguyên liệu (100 g)

a Chuẩn bị các cao chiết từ hoa cây đu đủ đực

Lấy 100 g bột hoa cây đu đủ đực, ngâm chiết siêu âm với dung môi methanol (150 mL x 3 lần, 50o

C, 30 phút) thu được dịch chiết Tiến hành cất quay chân không dịch chiết thu được cao methanol (6 g) Tiến hành phân bố cao methanol vào nước

cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane (100 mL x 2 lần),

chloroform (100 mL x 2 lần), ethyl acetate (100 mL x 2 lần) thu được ba dịch chiết tương ứng Tiến hành cất lo i dung môi dưới áp suất thấp ba dịch chiết này thu

được ba cao chiết n-hexane (1,0 g), chloroform (0,2 g) và ethyl acetate (0,4 g)

b Chuẩn bị các cao chiết từ lá cây đu đủ đực

Lấy 100 g bột lá cây đu đủ đực, ngâm chiết siêu âm với dung môi methanol (100 mL x 3 lần, 50o

C, 30 phút) thu được dịch chiết Tiến hành cất quay chân không dịch chiết thu được cao methanol (10 g) Tiến hành phân bố cao methanol vào nước

cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane (100 mL x 2 lần),

chloroform (100 mL x 2 lần), ethyl acetate (100 mL x 2 lần) thu được ba dịch chiết tương ứng Tiến hành cất lo i dung môi dưới áp suất thấp ba dịch chiết này thu

được ba cao chiết n-hexane (3,5 g), chloroform (1,5 g) và ethyl acetate (0,3 g)

3.1.2 Đ i oạt tí độ t o t ư a ao i t

Ho t tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết n-hexane,

chloroform, ethyl acetate từ hoa và lá cây đu đủ đực được tiến hành thử nghiệm trên

ba dòng tế bào ung thư phổi ở người (A549), ung thư gan ở người (Hep3B) và ung thư vú ở người (MCF-7) theo phương pháp đã mô tả ở m c 2.3.2 với m c đ ch sàng lọc các cao chiết có ho t t nh gây độc tế bào ung thư

Quá trình thử nghiệm ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết được thực hiện t i trung tâm tiên tiến v Hóa sinh Hữu cơ – Viện Hóa sinh

biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2 Phân lập các hợp chất

Sau khi đánh giá sàng lọc ho t t nh gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao

chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate từ hoa và lá cây đu đủ đực, kết hợp với

việc khảo sát thăm dò các cao chiết trên sắc k bản mỏng, các thuốc thử đ c trưng

và tài liệu tham khảo [5], chúng tôi tiến hành thu các cao chiết chloroform, dichloromethane, ethyl acetate từ hoa cây đu đủ đực và cao chiết chloroform từ lá cây đu đủ đực để ph c v cho việc phân lập các hợp chất Để có đủ lượng cao chiết cho quá trình phân lập, chúng tôi tiến hành chiết một lượng lớn nguyên liệu (5 kg) Quá trình thu nhận các cao chiết từ hoa và lá cây đu đủ đực được trình bày trên Hình 3.1 và Hình 3.5

Quá trình phân lập các hợp chất từ hoa và lá cây đu đủ đực được thực hiện theo phương pháp đã mô tả ở m c 2.3.3, c thể được trình bày trên Hình 3.2, Hình 3.3, Hình 3.4 và Hình 3.6 Thực nghiệm phân lập các hợp chất được tiến hành t i phòng th nghiệm Hóa hữu cơ – Khoa Hóa – Trường Đ i học Sư ph m – Đ i học

Đà Nẵng và phòng nghiên cứu Cấu trúc – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2.1 ậ ợ t từ hoa cây đ đ đ

a Chuẩn bị các cao chiết

Bột hoa cây đu đủ đực (5,0 kg) được ngâm chiết siêu âm với methanol (8 lít x

3 lần, 50oC, 30 phút) Dịch methanol được lọc qua giấy lọc nhi u lần, gom l i và đem cất lo i dung môi dưới áp suất thấp thu được 300 g cao chiết methanol Cao chiết này sau đó được hòa tan với nước cất rồi tiến hành chiết phân bố lần lượt với

các dung môi n-hexane (5 lít x 2 lần), chloroform (5 lít x 2 lần), dichloromethane (5

lít x 2 lần) và ethyl acetate (5 lít x 2 lần) Các dịch chiết này được đem cất lo i dung

môi dưới áp suất thấp thu được các cao chiết tương ứng n-hexane (CPH, 54 g),

chloroform (CPC, 12 g), dichloromethane (CPD, 52 g) và ethyl acetate (CPET, 20 g) (Hình 3.1)

H nh 3.1 Sơ đồ tạo các cao chiết từ hoa cây đu đủ đực

b Quá trình phân lập các hợp chất

 Phân lập các hợp chất từ cao chloroform (CPC)

Cao chiết chloroform (CPC, 12 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu

chloroform, sau đó tẩm với 50 g silica gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô Tiến hành phân tách hỗn hợp này bằng cột silica gel pha thường, rửa giải gradient bằng

hệ dung môi dichloromethane/methanol với độ phân cực tăng dần (dichloromethane/methanol, 99:1 → 10:1, v/v) thu được 5 phân đo n CPC1 (3,4 g), CPC2 (1,8 g), CPC3 (1,4 g), CPC4 (1,2 g) và CPC5 (2,3 g)

Phân đo n CPC2 (1,8 g) được phân tách bằng cột silica gel pha đảo, rửa giải với hệ dung môi methanol/nước (2/1, v/v) thu được 3 phân đo n từ CPC2A đến

CPC2C Hợp chất C1 (10 mg) thu được sau khi sử d ng sắc k cột silica gel pha

thường với hệ dung môi dichloromethane/methanol/nước (3/1/0,1, v/v) cho phân

đo n CPC2B

Phân đo n CPC5 (2,3 g) được cho qua cột silicagel pha thường, rửa giải bằng

hệ dung môi dichloromethane/methanol (95/5, v/v) thu được 4 phân đo n từ

CPC5A đến CPC5D Hợp chất C2 (3 mg) thu được sau khi sử d ng sắc ký cột silica

gel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (4/1, v/v) cho phân đo n CPC5B Tiến hành cô quay khô và hòa tan phân đo n CPC5D vào dung môi ethyl acetate thu được kết tủa trắng, hòa tan kết tủa và kết tinh l i trong hệ dung

môi dichloromethane/methanol (1/1, v/v) thu được hợp chất C3 (27 mg) (Hình 3.2

và Bảng 3.1)

Bột hoa cây đu đủ đực (5,0 kg)

1 Ngâm chiết siêu âm bằng methanol (8 lít x 3)

2 Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

CPET (20 g) Cao ethyl acetate CPC (12 g)

Cao chloroform

C2

(3 mg)

CPC2A CPC2B CPC2C

(4)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chloroform của hoa cây đu đủ đực

Bảng 3.1 Các loại silica gel và hệ dung môi sử dụng

trong sơ đồ phân lập ở Hình 3.2 Pha t nh Pha động

(1) Silica gel Gradient CH2Cl2-MeOH (99:1→10:1, v/v)

(2) YMC RP-18 MeOH-H2O (2:1, v/v)

(3) Silica gel CH2Cl2-MeOH (95:5, v/v)

(4) Silica gel CH2Cl2-MeOH-H2O (3:1:0,1, v/v)

(5) Silica gel CH2Cl2-MeOH (4:1, v/v)

(6) Kết tinh l i CH2Cl2-MeOH (1:1, v/v)

 Phân lập các hợp chất từ cao dichloromethane (CPD)

Cao chiết dichloromethane (CPD, 52 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu

dichloromethane, sau đó tẩm với 150 g silica gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô Tiến hành phân tách hỗn hợp này bằng cột silica gel pha thường, rửa giải gradient bằng hệ dung môi dichloromethane/methanol với độ phân cực tăng dần (dichloromethane/methanol, 100:0 → 0:100, v/v) thu được 5 phân đo n CPD1 (20,6 g), CPD2 (4,0 g), CPD3 (2,5 g), CPD4 (3,5 g) và CPD5 (15,1 g)

Phân đo n CPD2 (4,0 g) được phân tách bằng cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (20/1, v/v) thu được 4 phân đo n CPD2A (1,2 g), CPD2B (0,8 g), CPD2C (0,5 g) và CPD2D (1,24 g) Phân đo n

CPD2A (1,2 g) được phân tách bằng cột silica gel đảo với hệ dung môi

acetone/nước (2/1, v/v) thu được 2 hợp chất CP1 (5 mg) và CP3 (7 mg) Phân đo n

CPD2B (0,8 g) được phân tách bằng cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa

giải dichloromethane/ethyl acetate (2/1, v/v) thu được 2 hợp chất CP4 (5 mg) và CP5 (2,5 mg) Tiếp t c sử d ng sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa

giải methanol/nước (2/1, v/v) cho phân đo n CPD2C (0,5 g) thu được 2 hợp chất

CP11 (6 mg) và CP12A (9 mg) Phân đo n CPD2D (1,24 g) được phân tách bằng

sắc ký cột silica gel đảo với hệ dung môi methanol/nước (2/1, v/v) thu được 3 phân

đo n CPD2D1, CPD2D2 và CPD2D3 Hợp chất CP6 (3 mg) thu được sau khi sử

d ng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/acetone (5/1, v/v) cho phân đo n CPD2D1 Phân đo n CPD2D2

được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải

n-hexane/acetone (2,5/1, v/v) thu được hợp chất CP17A (8 mg)

Phân đo n CPD4 (3,5 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (20/1, v/v) thu được 3 phân

đo n CPD4A (0,6 g), CPD4B (1,5 g) và CPD4C (1,1 g) Phân đo n CPD4A (0,6 g) được phân tách bằng cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/ethyl acetate (2/1, v/v) thu được 4 phân đo n CPD4A1, CPD4A2, CPD4A3 và CPD4A4 Phân đo n CPD4A1 được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/acetone (4/1, v/v) thu

được hợp chất CP19 (9 mg) Hai hợp chất CP20 (5 mg) và CP21 (7 mg) thu được

sau khi sử d ng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải

n-hexane/ethyl acetate (1/1, v/v) cho phân đo n CPD4A3 Tiếp t c phân tách phân

đo n CPD4A4 bằng sắc k cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải

dichloromethane/methanol (10/1, v/v) thu được 2 hợp chất CP9 (10 mg) và CP10

(8 mg) Phân đo n CPD4C (1,1 g) được phân tách bằng sắc k silica gel cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (2/1, v/v) thu được 3 phân đo n CPD4C1, CPD4C2 và CPD4C3 Phân đo n CPD4C2 tiếp t c được phân tách khi sử d ng sắc

ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/acetone (3/1, v/v) thu

được 2 hợp chất CP14 (7 mg) và CP22 (6 mg) (Hình 3.3 và Bảng 3.2)