Nghiên Cứu Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Các Hoạt Chất Chính Trong Dược Liệu Giảo Cổ Lam Gynostemma Pentaphyllum (Thunb.) Makino 6734282.Pdf

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB ) MAKINO[.]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-VŨ VĂN TUẤN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƯỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM

GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB.) MAKINO

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-VŨ VĂN TUẤN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƯỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM

GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB.) MAKINO

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phương Thiện Thương và PGS.TS Từ Bình Minh đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Dược liệu và các anh chị, các bạn công tác tại khoa Hoá phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu trong môi trường với nhiều máy móc, trang thiết bị hiện đại

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học Hoá khóa K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm Hoá phân tích khóa K24 đã giúp

đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia

sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, tháng 03 năm 2016

Học viên

Vũ Văn Tuấn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 01

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 03

1.1.Tổng quan về dược liệu Giảo cổ lam… ……… 03

1.1.1 Đặc điểm thực vật… ……… 03

1.1.2 Phân bố và sinh thái.……… 04

1.1.3 Thành phần hóa học của Giảo cổ lam……… 05

1.1.4 Công dụng và tác dụng sinh học của Giảo cổ lam…… ………… 07

1.2 Tổng quan về phương pháp phân tích thành phần hóa học……… 08

1.2.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu …… 08

1.2.2 Phân tích thành phần hóa học của dược liệu Giảo cổ lam ……… 09

1.2.3 Kiểm nghiệm dược liệu Giảo cổ lam.……… 12

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu dược liệu……… 13

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu……… 14

2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị……… 16

2.2.1 Chất chuẩn……… 16

2.2.2 Hóa chất… ……… 16

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ… ……… 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu.………… ……… 17

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn……… ……… 17

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu ……… 17

2.3.3 Phương pháp phân tích……… 18

2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích………… 19

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích HPLC……….……… 19

2.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích ……… 19

2.4.3 Phân tích mẫu thực tế……… 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký……… 22

3.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu….… 22

3.1.2 Khảo sát thành phần pha động……… 24

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột……… 29

3.1.4 Điều kiện tối ưu cho quá trình tách hai hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1………

31 3.1.5 Định tính các hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1 trong mẫu Giảo cổ lam………

31 3.2 Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng……… 32

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn……… 32

3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng……… 34

3.2.3 Đánh giá phương trình đường chuẩn……… 36

3.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu……… 39

3.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết……… 39

3.3.2 Khảo sát phương pháp chiết siêu âm……… 40

3.3.3 Khảo sát phương pháp chiết hồi lưu……… 42

3.3.4 Phương pháp xử lý mẫu dược liệu Giảo cổ lam……… 44

3.4 Đánh giá phương pháp phân tích……… 45

3.4.1 Đánh giá độ đúng của phương pháp……… 45

3.4.2 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại……… 48

3.5 Phân tích mẫu thực tế……… 52

BÀN LUẬN……… 56

KẾT LUẬN……… 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Thông tin về các mẫu phân tích……… 15

Bảng 2.2: Chương trình dung môi rửa giải……… 19

Bảng 3.1: Chương trình gradient thử nghiệm với pha động MeOH–nước……… 24

Bảng 3.2: Thời gian lưu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với từng chương trình gradient……… 25

Bảng 3.3: Các chương trình gradient thử nghiệm với pha động ACN–nước… … 26

Bảng 3.4: Thời gian lưu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử ứng với từng chương trình gradient……… 26

Bảng 3.5: Chương trình gradient tối ưu với pha động ACN–nước chứa 0,01% axit photphoric……… 28

Bảng 3.6: Thời gian lưu, độ phân giải và hệ số đối xứng pic của các cấu tử với pha động ACN–nước chứa 0,01% axit photphoric ……… …… 28

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột……… 30

Bảng 3.8: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất……… 32

Bảng 3.9: Phương trình đường chuẩn của các chất……… 34

Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất……… 35

Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường

chuẩn Rutin……… 36

Bảng 3.12: Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phương trình đường chuẩn

của Rutin 38

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết……… 40

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết siêu âm……… 41

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm……… 42

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết hồi lưu……… 43

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết và số lần chiết……… 44

Bảng 3.18: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phương pháp

phương pháp thêm chuẩn của 3 kỹ thuật viên khác nhau………….……… 49 Bảng 3.24: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích tiến hành bởi ba kỹ thuật viên khác nhau……… 50 Bảng 3.25: Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp lại của phương pháp phân tích……… 51 Bảng 3.26: Kết quả phân tích mẫu dược liệu Giảo cổ lam……… ……… 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Dược liệu Giảo cổ lam……….……… 03

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của một vài saponin và flavonoid có trong Giảo cổ lam ……… 06

Hình 2.1: Hình ảnh dược liệu Giảo cổ lam và sản phẩm trà Giảo cổ lam………… 15

Hình 3.1: Phổ UV-VIS của hai hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1……… …… 22

Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC đối với các chương trình gradient thử nghiệm với

hệ dung môi MeOH–nước……… 25

Hình 3.3: Sắc ký đồ HPLC đối với các chương trình gradient thử nghiệm với

hệ dung môi ACN–nước……… 26

Hình 3.4: Sắc ký đồ HPLC của các cấu tử ứng với chương trình gradient thử nghiệm với hệ dung môi ACN–nước chứa 0,01% axit photphoric……… 29

Hình 3.5: Sắc ký đồ định tính Rutin và Ginsenoside Rb1 trong mẫu Giảo cổ lam Vĩnh Phúc……… ………

32 Hình 3.6: Khoảng tuyến tính……… 33

Hình 3.7: Đường chuẩn các chất……… 34

Hình 3.8: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lượng Rutin và Ginsenoside Rb1 trong các mẫu dược liệu Giảo cổ lam ……… 54

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

Abs Absorbance: Độ hấp thụ quang

AS Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic

HPLC High performance liquid chromatography: Sắc ký lỏng hiệu

năng cao HPLC-ESI-MS/MS Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ

HPLC-DAD/FLD Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và phát quang

HPLC-DAD-APCI/MSn

Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA và khối phổ với hệ ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển

LOD Limit of Detection: Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation: Giới hạn định lượng

PDA Photo-diode-array: Mảng điot điện tử

ppm Parts per million: Phần triệu

ppb Parts per billion: Phần tỷ

ppt Parts per trillion: Phần nghìn tỷ

R Correlation coefficient: Hệ số tương quan

RS Resolution: Độ phân giải

RP-HPLC Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo

% RSD % Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tương đối

% RSDR % Reproducibility standard deviation: % Độ lệch chuẩn tái lặp

tương đối

SD Standard deviation: Độ lệch chuẩn

tR Retention time: Thời gian lưu

UV-VIS Ultraviolet-Visible: Tử ngoại và khả kiến

VWD Variable Wavelength Detector

MỞ ĐẦU

Theo số liệu thống kê của Viện Dược liệu, hiện nay ở nước ta có gần 5000 loài thực vật đã được người dân sử dụng trong y học cổ truyền, y học dân gian, chiếm gần

1/3 tổng số loài thực vật đã biết ở Việt Nam Giảo cổ lam có tên khoa học Gynostemma

pentaphyllum (Thunb.) Makino, là một trong các cây thuốc quý hiếm được người dân

sử dụng trong việc điều trị các bệnh biến chứng về tim mạch, làm tan các cục máu đông, chống huyết khối, hạ mỡ máu Uống nước từ cây thuốc Giảo cổ lam hàng ngày giúp giảm căng thẳng, tăng cường sức khỏe, chống lại quá trình lão hóa, hạ đường huyết, bảo vệ tế bào gan, tăng tiết mật, tăng cường chức năng giải độc cho gan, hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Thậm chí ở Nhật Bản và Trung Quốc, người ta còn coi Giảo cổ lam như một phương thuốc trường sinh Theo các nghiên cứu đã công bố thì hai nhóm hoạt chất chính và có tác dụng trong Giảo cổ lam là flavonoid và saponin

Nước ta hiện có 05 loài thuộc chi Gynostemma [3] Các loài này có đặc điểm hình thái rất giống nhau Các dược liệu không phải loài Gynostemma pentaphyllum vẫn

được các thương gia gọi với tên "Giảo cổ lam" và quảng cáo những tác dụng chữa bệnh của dược liệu Giảo cổ lam Trên thị trường hiện nay, vị thuốc quý này chủ yếu được bán dưới dạng túi trà, các sản phẩm từ Giảo cổ lam không rõ nguồn gốc đang được bày bán rất nhiều Điều này không những ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị, sức khỏe và quyền lợi của người bệnh mà còn gây mất lòng tin của người tiêu dùng khi sử dụng thuốc từ dược liệu nói chung và Giảo cổ lam nói riêng Ngoài ra, thành phần hóa học, hàm lượng các hoạt chất của Giảo cổ lam ở các vùng có điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu khác nhau thì cũng khác nhau Đây cũng là một vấn đề cần phải nghiên cứu

Ở Việt Nam, Dược điển Việt Nam IV (2009) chưa có chuyên luận Giảo cổ lam [3] Do đó, việc kiểm soát, đánh giá chất lượng của các mẫu Giảo cổ lam và các sản phẩm từ dược liệu này gặp nhiều khó khăn Các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học Giảo cổ lam đã công bố ở trong nước chỉ dừng ở mức định tính hoặc là xác định một nhóm chất [9], [10], [12] Các nghiên cứu đã công bố ở nước ngoài sử dụng các kỹ

2

thuật, hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nên khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn

vị kiểm nghiệm và sản xuất trong nước Các phương pháp xử lý mẫu tốn kém, tốn nhiều thời gian [25], [31], [38] Ngoài ra, thành phần hóa học của các mẫu này cũng khác so với nguyên liệu Giảo cổ lam ở trong nước Do đó, việc xây dựng một phương pháp định lượng (khẳng định tính đúng và đánh giá chất lượng) của dược liệu Giảo cổ lam là hết sức cần thiết Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy, Rutin và Ginsenoside Rb1 là hai hợp chất chính trong Giảo cổ lam và có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe con người [23], [40]

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng

phương pháp định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu Giảo cổ lam Gynostemma

pentaphyllum (Thunb.) Makino” với các mục tiêu

- Xây dựng được phương pháp định lượng hai hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1 trong dược liệu Giảo cổ lam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Xác định được hàm lượng của hai hoạt chất này trong dược liệu Giảo cổ lam thu hái tại các vùng khác nhau, các mẫu thu mua trên thị trường và sản phẩm chế biến

từ dược liệu Giảo cổ lam

Chương I - TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về dược liệu Giảo cổ lam

Giảo cổ lam hay còn gọi là Cổ yếm, Thư tràng năm lá có tên khoa học là

Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [6],

[15] Theo nghiên cứu đã công bố, ở Việt Nam hiện nay có 05 loài thuộc chi

Gynostemma bao gồm Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino), Cổ

yếm lá bóng (Gynostemma laxum (Wall.) Cogn.), Giảo cổ lam Miến Điện (Gynostemma burmanicum King ex Chakrav.), Giảo cổ lam bảy lá (Gynostemma

longipes C Y W), Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X X Chen & D

R Liang [3] Trong các loài kể trên, loài Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) là

loài được quan tâm nghiên cứu hơn cả Các tác dụng của dược liệu Giảo cổ lam đã được chứng minh qua rất nhiều các nghiên cứu cả ở trong và ngoài nước Trong phạm

vi của luận văn, chúng tôi sử dụng dược liệu này làm đối tượng để nghiên cứu

Hình 1.1 Dược liệu Giảo cổ lam

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây thảo, thân và nhánh mảnh, có góc-rãnh, nhẵn hoặc có lông tơ rải rác Lá kép chân vịt 3-7 lá chét, có lông tơ hoặc nhẵn; lá chét hình trứng-thuôn hoặc mác, lá chét giữa 3-12 × 1,5-4 cm, lá chét bên nhỏ hơn, cả hai mặt đôi khi có lông cứng, gân bên 6-

4

8 đôi, gốc hẹp dần vào cuống, mép khía tai bèo, đỉnh nhọn hoặc có mũi nhọn ngắn; cuống lá chét 1-5 mm Tua cuốn dạng chỉ, 2 nhánh Hoa đực trong cụm hoa chùy, cuống cụm hoa dạng chỉ, 10-15 (-30) cm, rất nhiều nhánh; cuống hoa dạng chỉ, 1-4 mm; lá bắc hình giùi; ống đài rất ngắn; thùy đài hình tam giác, khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn; tràng màu xanh lá cây nhạt hoặc trắng; thùy tràng hình trứng-mác, 2,5-3× khoảng 1 mm, 1 gân, đỉnh có mũi nhọn dài Hoa cái: cụm hoa chùy ngắn hơn cụm hoa đực; đài và tràng giống hoa đực; bầu hình cầu, 2 hoặc 3 ô; vòi nhụy 3; núm nhụy 2 thùy; nhị lép 5, ngắn Quả không tự mở, đen khi trưởng thành, hình cầu, đường kính 5-

6 mm; 2-3 hạt, nhẵn hoặc dày đặc lông cứng và lông tơ Hạt nâu, trứng-tim, đường kính khoảng 4 mm, dẹt, hai mặt có nhú, gốc tim, đỉnh tù Hoa tháng 3-11, quả tháng 4-

12 [3], [15]

1.1.2 Phân bố và sinh thái

Giảo cổ lam là cây ưa ẩm, ưa sáng đồng thời cũng hơi chịu bóng Cây thường mọc ở trong rừng, lùm bụi hoặc ven đường ở sườn núi, độ cao từ 100 đến hơn 3000 m [6]

Giảo cổ lam có ở nhiều quốc gia như Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Triều Tiên, Nhật Bản Ở nước ta, cây phân bố ở một số tỉnh như Lào Cai (Sapa), Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh (Móng Cái, Hà Côi), Hòa Bình, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Quảng Bình (Vườn Quốc gia Phong Nha-Kẻ Bàng), Kon Tum, Đồng Nai [3] Giảo cổ lam sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, từ tháng 4 đến tháng 8 Cây ra quả hàng năm Do trữ lượng tự nhiên hạn chế, lại bị tìm kiếm khai thác mạnh, nên Giảo cổ lam đã được đưa vào tài liệu “Danh lục đỏ các cây thuốc Việt Nam (2006)” và tài liệu “Sách đỏ Việt Nam, phần II-Thực vật (2007)” nhằm khuyến cáo bảo vệ Thời gian gần đây, để phục

vụ nhu cầu sử dụng cao của người dân, cây đã được đưa vào trồng ở một số địa phương miền núi và cho kết quả tốt [6], [15]

1.1.3 Thành phần hóa học của Giảo cổ lam

Các nghiên cứu đã được công bố ở trong và ngoài nước chỉ ra rằng thành phần

hóa học chính và có tác dụng của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino là

saponin và flavonoid [30], [35], [36], [37] Ngoài ra còn một số nhóm chất khác

1.1.3.1 Nhóm Saponin

Saponin là thành phần hóa học chính trong Giảo cổ lam Hàm lượng saponin toàn phần tính theo Ginsenoside Rb1 trong 3 mẫu thu hái tại Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Hòa Bình và Đà Lạt lần lượt là 4,12%; 5,10% và 4,12% [2], [12] Các saponin có trong Giảo cổ lam thuộc nhóm saponin triterpen có khung dammaran tương tự như trong

Nhân sâm (Panax gisneng) với nhiều tác dụng quý đã được chứng minh [26] Cho đến nay đã có khoảng trên 100 saponin được phân lập từ loài Giảo cổ lam (Gynostemma

pentaphyllum (Thunb.) Makino) Trong đó, có một vài các saponin khung

protopanaxadiol của loài Panax ginseng như Ginsenoside Rb1 (Gypenoside III),

Ginsenoside Rc, Ginsenoside Rb3 (Gypenoside IV), Ginsenoside Rd (Gypenoside VIII), Ginsenoside Rg3, Ginsenoside malonyl- Rb1 và Ginsenoside malonyl-Rd [20], [29], [25], [38] Hợp chất Ginsenoside Rb1 có hàm lượng cao trong các mẫu Giảo cổ lam thu hái tại Trung Quốc dao động trong khoảng từ 0,08-0,15% [28] Hợp chất này cũng được sử dụng làm chất đánh dấu trong phép phân tích xây dựng “dấu vân tay” bằng 02 phương pháp là sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng của dược liệu Giảo cổ lam [40]

1.1.3.2 Nhóm flavonoid

Cùng với sapomin, flavonoid là một trong hai nhóm chất chính có trong Giảo cổ

lam Các flavonoid có trong loài Gynostemma pentaphyllum chủ yếu là các flavonol

Một số flavonoid đã được tìm thấy trong loài này ở Việt Nam như: Ombuin, Ombuoside, Rutin, Quercetin, Quercetin-4,7-dimetylete [1] Ngoài ra sự có mặt của

các hợp chất như Vitexin, Quercetin-3-O-β-D-glucosid và Kaempferol-3-O-rutinosid

trong Giảo cổ lam cũng đã được công bố trong các nghiên cứu trước đây [25], [30],

6

[37] Trong các flavonoid nói trên, hợp chất Rutin là hợp chất có hàm lượng cao và đã được sử dụng làm chất đối chiếu trong phép phân tích xây dựng “dấu vân tay” bằng 02 phương pháp là sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng của dược liệu Giảo cổ lam [23], [28], [40]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của một vài saponin và flavonoid có trong Giảo cổ lam

1.1.3.3 Các thành phần khác

Ngoài 02 nhóm hoạt chất chính là saponin và flavonoid, trong loài Giảo cổ lam

còn chứa các sterol bao gồm ergostanol, β-sitosterolvà stigmasterol [33], các nguyên tố

vô cơ bao gồm: Al, Si, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag, polysaccharid, vitamin, khoáng chất và các amino axit [29]

1.1.4 Công dụng và tác dụng sinh học của Giảo cổ lam

Theo Y học dân gian, Giảo cổ lam có tác dụng tăng cường sinh lực, thanh nhiệt, giải độc Ở Trung Quốc, Giảo cổ lam được dùng làm thuốc bổ và được xếp vào 10 loại thảo dược có tác dụng bổ nhất ở Trung Quốc Lá loài này được dùng làm trà thuốc gọi

là trà dưỡng não Thân và lá còn được sử dụng để chữa bệnh đái tháo đường Ngoài ra, Giảo cổ lam còn được sử dụng để chữa viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp, đau nhức xương khớp, các bệnh về tim mạch, béo phì [6], [15]

GS.TS Phạm Thanh Kỳ (Đại học Dược Hà Nội) là nhà khoa học nghiên cứu đầu tiên và chuyên sâu về cây Giảo cổ lam ở Việt Nam Các kết quả nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã công bố cho thấy, dịch chiết cồn tỷ lệ 1:1 (1 ml dịch chiết tương đương 1 g dược liệu) của Giảo cổ lam có tác dụng hạ cholesterol máu trong

cả hai khảo nghiệm gây tăng cholesterol máu thực nghiệm bằng cách cho thỏ uống cholesterol (Cơ chế ngoại sinh) và gây tăng cholesterol máu thực nghiệm bằng cách tiêm tween 80 (Cơ chế nội sinh) Trong thử nghiệm gây tăng cholesterol ngoại sinh, sử dụng Giảo cổ lam với liều uống 10 g dược liệu/kg thể trọng chuột trong 10 ngày, có tác dụng ức chế sự tăng cholesterol 71% so với nhóm đối chứng Trong thử nghiệm gây tăng cholesterol nội sinh, cao chiết ethanol của Giảo cổ lam với liều 5g dược liệu /kg thể trọng thỏ có tác dụng hạ cholesterol máu 82% so với nhóm đối chứng [5], [7] Kết quả có ý nghĩa thống kê Bên cạnh đó, tác dụng tăng lực, tác dụng bảo vệ tế bào gan, tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng u, tăng cường miễn dịch của dược liệu Giảo

cổ lam thu hái ở Việt Nam cũng đã được chứng minh qua các nghiên cứu khoa học thực nghiệm [5], [7], [8]

Ở trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu các tác dụng dược lý của loài Giảo cổ

lam (Gynostemma pentaphyllum) Các kết quả nghiên cứu cho thấy, tác dụng của dược

liệu Giảo cổ lam chủ yếu do hai thành phần là flavonoid và saponin (Gypenoside) có trong thành phần của nó mang lại Nghiên cứu tác dụng sinh học của loài Giảo cổ lam chủ yếu do các nhà khoa học Trung Quốc công bố [19], [22], [34], [39] Ngoài các tác

Trong các nghiên cứu định tính cũng như định lượng dược liệu Giảo cổ lam

(Gynostemma pentaphyllum), hai hợp chất được lựa chọn làm chất đối chiếu là

Ginsenoside Rb1 và Rutin (một hợp chất saponin và một hợp chất flavonoid) [23], [28], [40] Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy hai hợp chất này có rất nhiều tác dụng sinh học đáng quý Hợp chất Rutin đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống đái tháo đường, bảo vệ gan, hạ lipid máu, điều trị bệnh Alzheimer, tăng lực, hạ huyết áp, kháng u [16] Hợp chất Ginsenoside Rb1 có tác dụng tăng cường sức đề kháng, bảo vệ gan, hạ cholesterol máu [26], [27] Như vậy có thể thấy rằng, Ginsenoside Rb1 và Rutin là hai hợp chất chính trong Giảo cổ lam và có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe con người Vì vậy, trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi sẽ tiến hành xây dựng một phương pháp định lượng đồng thời hai hợp chất Rutin và Ginsenoside Rb1 nhằm đánh giá chất lượng dược liệu Giảo cổ lam, một cây thuốc quý ở Việt Nam

1.2 Tổng quan về phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu

1.2.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu

Dược liệu là đối tượng phân tích có thành phần nền phức tạp Thông thường, trong dược liệu chứa không chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau

mà thường chứa một nhóm chất có các tính chất tương đối giống nhau (flavonoid, anthraquinon, saponin, coumarin…) Các chất trong cùng một nhóm có khung cơ bản giống nhau, chỉ khác nhau về nhóm thế dẫn đến không có sự sai khác nhiều về tính chất hóa học cũng như tính chất vật lý Chính vì vậy, việc sử dụng các phương pháp như UV-VIS, IR, huỳnh quang để phân tích, định lượng một thành phần trong dược liệu gặp khó khăn và gần như là không thể thực hiện được

Sắc ký là một trong những phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất thông dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại Khác với các phép định lượng hóa học, phương pháp sắc ký cho phép định lượng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn hợp, phù hợp với quá trình phân tích các mẫu dược liệu Người ta có thể định lượng một chất hoặc nhiều chất đồng thời nếu lựa chọn được điều kiện sắc ký phù hợp Các phương pháp sắc ký hay được sử dụng là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản [4] Trong các phương pháp kể trên, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng Ưu điểm lớn nhất của phương pháp là có thể phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với phương pháp sắc ký khí (thường dùng với các đối tượng dễ bay hơi) Có thể dùng HPLC để phân tích các chất từ phân cực tới không phân cực, từ các chất dễ bay hơi đến khó bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly… Trong lĩnh vực dược liệu, HPLC thường được sử dụng nhất trong định lượng riêng lẻ các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu bằng việc

so sánh diện tích pic với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích [4] Với mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng phương pháp định lượng các hợp chất thuộc hai nhóm là flavonoid và saponin trong dược liệu Giảo cổ lam, chúng tôi lựa chọn phương pháp nghiên cứu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.2.2 Phân tích thành phần hóa học của dược liệu Giảo cổ lam

Có rất nhiều kỹ thuật ghép nối với hệ thống HPLC đã được sử dụng để phân tích các hợp chất thuộc hai nhóm flavonoid và saponin như HPLC-ESI-MS/MS, HPLC-DAD/FLD, HPLC-DAD-APCI/MS…Các kỹ thuật này đều hiện đại, đòi hỏi trang thiết

bị đắt tiền nên khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất Kỹ thuật HPLC-UV/VIS khắc phục được những nhược điểm trên, vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp này để phân tích các thành phần hóa học trong dược liệu Giảo cổ lam