Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp Koch sử dụng để xác định mật độ vi sinh vật: Mật độ vi sinh vật được xác định dựa trên phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, tính số lượng
Trang 1NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI
SINH PHÒNG TRỪ BỆNH HÉO LẠC VÀ VỪNG
Lê Thị Thanh Thủy, Lê Như Kiểu, Nguyễn Văn Huân, Trần Thị Lụa, Trần Quang Minh
SUMMARY
Study on the construction of process for production of microbial preparation
to control of wilt disease of groundnut and sesame
Isolation, selection, assessment of biological activities and the ability to against bacterial wilt
disease caused by Ralstonia solanacearum and Fusarium oxysporum of bacterial strains have
been done 2 groups of microorganisms used to make microbial preparation for groundnut (PS1, TS6, Pb8, Ba51, T15) and sesame (HS10, CRT, HS8, M, CX1) were selected In the mixed condition, all of selected bacterial strains can be existed well together and had positive effects to
growth, development and inhibition of disease caused by R solanacearum and F oxysporum
These selected bacterial strains have potential to produce microbial preparation to control of wilt disease of groundnut and sesame We constructed of process for production of microbial preparation VSV1 used for groundnut and VSV2 used for sesame Both of microbial preparations contained multi- antagonistic strains have density of microorganism is about 109 cfu/g Quality of microbial preparation was insured in 3 months keeping time in room temperature
Keywords: Disease of groundnut, disease of sesame, bacterial wilt, R solanacearum, F oxysporum,
antagonistic bacteria
I MỞ ĐẦU
Ở nước ta, cây lạc và cây vừng là
những cây có giá trị kinh tế cao trên một
đơn vị diện tích gieo trồng Do vậy phát
triển trồng lạc và vừng không chỉ thúc đNy
chuyển dịch cơ cấu cây trồng trong nông
nghiệp mà còn nâng cao thu nhập cho
người nông dân Tuy nhiên, thực tế trồng
lạc và vừng ở các nước trên thế giới nói
chung và ở Việt Nam nói riêng gặp rất
nhiều khó khăn, đặc biệt là bệnh héo xanh
do vi khuNn R solanacearum gây ra trên lạc
và vừng [3] Ở nước ta bệnh héo xanh do vi
khuNn đã phát sinh ở hầu hết các địa phương
có trồng các cây như: cà chua, vừng, lạc,
thuốc lá, khoai tây, ở rất nhiều tỉnh thành
như: Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Thái
Nguyên, Thanh Hoá, Nghệ An có nơi, có
lúc bệnh đã gây thiệt hại nặng tới mức gây
chết 100% cây trồng Cho tới nay những
nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuNn ở lạc
và vừng chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân bố của bệnh và bước đầu xác định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống lạc và vừng hiện có Tuy nhiên do khả năng có thể biến đổi tính
độc của các chủng vi khuNn R solanacearum
gây bệnh và hạn chế của thuốc bảo vệ thực vật đối với loại vi khuNn này, nên các biện pháp phòng trừ sinh học bệnh héo xanh vi khuNn bằng các vi sinh vật đối kháng đã cho thấy nhiều hứa hẹn khả quan và là biện pháp rất cần thiết để thay thế các loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật [1, 3] Bài báo này sẽ đưa ra những kết quả trong nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất chế phNm vi sinh phòng trừ bệnh héo lạc và vừng
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 21 Vật liệu
- Vi khuNn R.solanacearum và nấm
F.oxysporum gây bệnh héo được phân lập
từ các cây lạc và vừng có biểu hiện triệu
chứng nhiễm bệnh điển hình [5] ở một số
tỉnh như: Hà Nội, Thanh Hoá, Nghệ An và
Vĩnh Phúc Các mẫu đất trồng cây họ cà
(ớt, cà chua), cây lạc và vừng
2 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp Koch sử dụng để xác
định mật độ vi sinh vật: Mật độ vi sinh vật
được xác định dựa trên phương pháp nuôi
cấy trên môi trường thạch đĩa, tính số lượng
vi sinh vật trên mililit hoặc trên gam mẫu
thông qua số khuNn lạc phát triển trong các
đĩa môi trường
- Phương pháp xác định hoạt tính đối
kháng vi khuNn, nấm gây bệnh: được xác
định bằng cách đo đường kính vòng ức chế;
đó là vòng tròn trong suốt bao quanh khuNn
lạc (đối với trường hợp cấy điểm) hoặc lỗ
thạch (đối với trường hợp khoan lỗ thạch),
nơi mà vi sinh vật gây bệnh không sinh
trưởng được [4]
- Phương pháp Salkowsky cải tiến
(Misra và cs., 1989) sử dụng để xác định
khả năng sinh tổng hợp IAA thô: Các chủng
vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường
có bổ sung 0,1% Triptophan Sau thời gian
nuôi cấy, ly tâm, thu được dịch trong Cho
2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml
thuốc thử Salkowsky cải tiến Lắc đều, để
yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy
với bước sóng 530 nm Hàm lượng IAA tạo
ra trong môi trường được tính toán trên cơ
sở đồ thị IAA chuNn Thuốc thử Salkowsky
cải tiến: FeCl3 0,5M 15 ml; H2SO4 98%
300 ml; nước cất 500 ml
- Phương pháp đánh giá tính độc của các chủng vi khuNn sử dụng theo 10TCN:
216-1995 (216-2003) [2] Thí nghiệm chia thành
6 công thức: CT1: Công thức đối chứng là đất không nhiễm sinh khối vi khuNn; CT2:
Đất nhiễm R solanacearum (104-105cfu/g); CT3: Đất nhiễm F oxysporum (104-105bt/g);
CT4: Đất nhiễm hỗn hợp các chủng vi khuNn; CT5: Là CT2+hỗn hợp vi khuNn; CT6: Là CT3+hỗn hợp vi khuNn
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng để sản xuất chế ph/m vi sinh
Từ các mẫu đất, mẫu thân cây vừng và cây lạc khỏe ở các tỉnh Vĩnh Phúc, Hà Tĩnh, Hà Nội và Thanh Hóa đã phân lập được 24 chủng vi khuNn đối kháng, đây là nguồn nguyên liệu quý cho việc tuyển chọn chủng có tiềm năng cao trong sản xuất chế phNm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh lạc, vừng Tiêu chuNn chọn lựa các chủng vi khuNn đối kháng là phải có hoạt lực đối kháng mạnh, tác dụng trên nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh, ổn định lâu dài trong chế phNm và không gây bệnh cho động vật máu nóng Từ 24 chủng vi khuNn đối kháng trên chúng tôi lựa chọn được 2 tổ hợp, bao gồm
10 chủng vi khuNn điển hình làm vật liệu trong nghiên cứu sản xuất chế phNm vi sinh
sử dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc
và vừng Trong đó có 8 chủng đối kháng cả
R solanacearum và F oxysporum với kích
thước vòng ức chế từ 10-20 mm
Bảng 1 Tổ hợp các chủng vi khu n sử dụng trong nghiên cứu sản xuất chế ph m vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh lạc và vừng (tháng 10-2008, tại Viện Thổ nhưỡng 9ông hóa)
Chế
Ký hiệu
Trang 3Cây
lạc
Pseudomonas
fluorescens
Pseudomonas sp
Bacillus sp
Bacillus subtilis
Bacillus megaterium
Ps1 TS6 Pb8 Ba5.1 T15
ĐKVK & N héo xanh ĐKVK & N héo xanh ĐKVK & N héo xanh ĐKVK & N héo xanh, KTSTTV,
PG kitin ĐKVK héo xanh
Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) IAA: µg/ml
Đường kính VPGKT (mm) Đường kính VƯC (mm)
12; 12 12; 10 16; 16 15; 15,5
182
32
20 Cây
vừng
Pseudomonas sp
Pseudomonas putida
Bacillus sp
Bacillus velezensis
Bacillus polyfermenticus
HS10 CRT HS8 M CX1
ĐKVK & N héo xanh ĐKVK héo xanh ĐKVK & N héo xanh, ĐKVK & N héo xanh, KTSTTV
PG kitin ĐKVK & N héo xanh
Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) IAA: µg/ml
Đường kính VPGKT (mm) Đường kính VƯC (mm)
16; 16
20 12; 12 15; 15,5
160
37 15; 15
ĐKVK & N: Đối kháng vi khuNn và nấm IAA: Indol Acetic Acid
VƯC: Vòng ức chế vi khuNn/nấm gây bệnh KTSTTV: Kích thích sinh trưởng thực vật
Các chủng vi khuNn lựa chọn thuộc các
chi Pseudomonas và Bacillus đều có hoạt tính
đối kháng cao với vi khuNn R solanacearum
và nấm F oxysporum gây héo lạc, vừng và
ổn định hoạt tính trong nhiều lần thí nghiệm
Kết quả minh họa trên hình 1
Tiến hành xác định định tính tác động
tương hỗ giữa các chủng bằng phương pháp
cấy vạch tiếp xúc giữa các chủng vi khuNn trên môi trường thạch Kết quả cho thấy, các chủng vi khuNn tuyển chọn đều phát triển tốt trên cùng một môi trường dinh dưỡng, không có biểu hiện kìm hãm sinh trưởng giữa các chủng nghiên cứu Kết quả minh họa trên hình 2
Hình 1 Đánh giá hoạt lực đối kháng vi khuNn
R solanacearum và nấm F oxysporum gây
héo xanh lạc và vừng
Hình 2 N uôi cấy vạch các chủng vi khuNn tuyển chọn trên cùng môi trường dinh dưỡng
Bảng 2 Ảnh hưởng của hỗn hợp vi khu n đối kháng đến sinh trưởng, phát triển và khả năng hạn chế bệnh héo xanh giống lạc MD7 (thí nghiệm nhà lưới, Viện Thổ nhưỡng 9ông hóa 2008)
cây (cm)
Trọng lượng khô thân lá (g)
Tỷ lệ cây chết (%) do
R solanacearum F oxysporum
Trang 4CT5: Nhiễm R solanacearum + hỗn hợp vi khuẩn 21,0 1,55 25,0 -
CT6: Nhiễm F oxysporum + hỗn hợp vi khuẩn 20,1 1,58 - 37,5
Kết quả bảng 2 cho thấy khi nhiễm
bệnh nhân tạo tỷ lệ cây chết héo do
R solanacearum là 87,5%, do F oxysporum
là 75% Nhiễm đồng thời tổ hợp các chủng
vi khuNn đối kháng và vi khuNn
R solanacearum tỷ lệ cây chết chỉ còn
25%, tổ hợp các chủng vi khuNn đối kháng
và nấm F oxysporum tỷ lệ cây chết chỉ còn
37,5% Trong khi đó công thức nhiễm hỗn hợp vi khuNn, cây lạc sinh trưởng, phát triển bình thường, cây không bị chết héo
Bảng 3 Ảnh hưởng của hỗn hợp vi khu n đối kháng đến sinh trưởng, phát triển và khả năng hạn chế bệnh héo xanh giống vừng V6 (thí nghiệm nhà lưới, Viện Thổ nhưỡng 9ông hóa, 2008)
Công thức
Cao cây (cm)
Khối lượng khô thân lá (g)
Tỷ lệ cây chết (%) do
R solanacearum F oxysporum
CT5: Nhiễm R solanacearum + hỗn hợp vi khuẩn 55,06 120,96 25,0 -
CT6: Nhiễm F oxysporum + hỗn hợp vi khuẩn 58,15 119,07 - 40,5
Đối với vừng khi nhiễm bệnh nhân tạo tỷ
lệ cây chết héo xanh do R solanacearum là
80% Nhiễm đồng thời tổ hợp các chủng vi
khuNn đối kháng và vi khuNn R solanacearum
tỷ lệ cây chết chỉ còn 25%, tỷ lệ cây chết chỉ
còn 40,5% ở tổ hợp các chủng vi khuNn đối
kháng và nấm F oxysporum Công thức
nhiễm hỗn hợp chủng vi khuNn đối kháng,
cây vừng sinh trưởng, phát triển tốt, cây
không bị chết héo, minh họa ở bảng 3 N hư
vậy, các chủng vi khuNn đối kháng nghiên
cứu có đủ điều kiện để sản xuất chế phNm vi
sinh sử dụng trong phòng chống bệnh héo
lạc và vừng
2 0ghiên cứu qui trình sản xuất chế ph/m vi sinh vật đối kháng bệnh héo cây lạc và vừng trong phòng thí nghiệm
Thí nghiệm sử dụng các nguồn dinh dưỡng tổng hợp và nguồn dinh dưỡng tự nhiên dễ kiếm, rẻ tiền trong nuôi cấy nhân sinh khối các chủng vi khuNn Kết quả so sánh mật độ các chủng vi khuNn và hoạt tính của chúng trên các môi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau được thể hiện trong các bảng 4 và 5
Bảng 4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của các chủng vi khu n
Trang 5TT Kí hiệu
chủng
Mật độ tế bào (cfu/ml) của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường
1 Ps1 2,2 x 108 1,6 x109 2,4 x 108 2,9 x 108 4,2 x 109 9,8 x 107
2 TS6 3,1 x108 1,3 x109 2,0 x 108 5,2 x 108 3,4 x 109 7,8 x 107
3 Pb8 4,4 x 108 2,5 x 108 1,2 x 107 2,6 x 107 6,0 x 108 4,0 x 107
4 Ba5.1 6,0 x108 1,1 x108 1,8 x108 8,3 x108 6,9 x108 1,1 x108
5 T15 2,1 x 109 1,4 x108 8,5 x107 4,2 x109 3,8 x109 1,4 x108
6 HS10 2,5 x 108 2,5 x 109 2,5 x109 2,6 x109 4,6 x109 2,9 x108
7 CRT 2,0 x108 1,5 x109 1,4 x108 2,0 x108 1,4 x109 2,7 x108
8 HS8 3,4 x108 2,5 x108 1,3 x108 4,5 x108 3,2 x108 2,5 x108
9 M 5,6 x 108 2,0 x108 4,6 x108 5,4 x108 5,0 x108 1,8 x108
10 CX1 2,6 x 108 1,2 x108 1,0 x 107 2,4 x 107 4,6 x 108 5,0 x 107
Chú thích: * SX1, SX2, SX3, SX4: Là các môi trường chứa gỉ đường mía, dịch nước chiết đậu, có bổ sung một số chất dinh dưỡng và khoáng chất * KingB, Pseu: Là hai môi trường đặc hiệu cho nuôi cấy
các chủng thuộc chi Bacillus và Pseudomonas
Bảng 5 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt tính đối kháng của các chủng vi khu n
Đường kính vòng ức chế vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc,
vừng (D-d)(mm)
Kết quả bảng 4 và 5 cho thấy, các
chủng vi khuNn nghiên cứu đều phát triển
tốt trong môi trường đặc hiệu có nguồn gốc
tự nhiên (nước chiết đậu, gỉ đường) cho
từng chủng trên các môi trường Trên môi
trường sản xuất SX3 tất cả các chủng đều
có mật độ tế bào cao hoặc tương đương khi
nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu Kết quả
tương tự khi so sánh hoạt tính sinh học của
các chủng vi khuNn nghiên cứu trên các môi
trường nuôi cấy khác nhau Như vậy có thể
lựa chọn môi trường SX3 cho nhân sinh
khối các chủng vi khuNn lựa chọn để sản
xuất chế phNm cho cây lạc vừng, vì môi
trường này vừa đảm bảo mật độ tế bào cao
(từ 108-109/ml), vừa đảm bảo hoạt tính đối
kháng cao nhất (kích thước vòng phân giải
từ 15-20 mm) so với các môi trường khác Chất mang là giá thể mà ở đó vi sinh vật trú ngụ, đảm bảo đạt mật độ theo yêu cầu trong quá trình từ khi sản xuất đến lúc sử dụng Đã tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng tồn tại của các chủng vi khuNn tuyển chọn trên các nền chất mang khác nhau như than bùn, than bùn bổ sung xơ dừa, phân giun, phân compost, mai cua, đất xạ hiếm Trên cơ sở đó đã lựa chọn loại chất mang phù hợp cho nghiên cứu sản xuất chế phNm
vi sinh cho cây lạc, vừng là chất mang than bùn bổ sung gỉ đường và đất xạ hiếm Chất mang sử dụng làm chế phNm được
xử lý với các công đoạn:
Trang 6Nghiền nhỏ → Trung hòa pH → Phối
trộn gỉ đường, đất xạ hiếm → Điều chỉnh
độ Nm → Đóng gói → Khử trùng
Trên cơ sở tổng hợp các kết quả nghiên
cứu về công nghệ sản xuất chế phNm vi sinh
như: Tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật
sử dụng cho sản xuất chế phNm, lựa chọn
môi trường nhân sinh khối VSV, xác định điều kiện lên men nhân sinh khối, lựa chọn,
xử lý chất mang Kết quả đã xây dựng được
2 quy trình công nghệ sản xuất chế phNm vi sinh vật phòng trừ bệnh héo cây lạc và vừng và được tóm tắt trong sơ đồ 1 và 2
SƠ ĐỒ 1 QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV
ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÂY LẠC
SƠ ĐỒ 2 QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÂY VỪNG
Chế phNm VSV1 sử dụng cho cây lạc;
Chế phNm VSV2 sử dụng cho cây vừng,
là sản phNm lên men cấp hai nhân sinh
khối vi sinh vật và phối trộn với chất
mang Mật độ tế bào mỗi loại vi khuNn đạt
109 cfu/g và được bảo quản ở điều kiện
nhiệt độ phòng trong điều kiện râm mát,
sạch sẽ, không để gần nơi chứa chất độc
hóa học, thuốc trừ sâu Sử dụng tốt trong
vòng 3 tháng
IV KẾT LUẬN Phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu và đánh giá hoạt tính sinh học, khả năng đối kháng
bệnh héo xanh vi khuNn do R solanacearum
và bệnh héo do nấm F oxysporum Trong điều
kiện tổ hợp các chủng vi khuNn cho thấy, hỗn hợp các chủng vi khuNn sử dụng sản xuất chế phNm vi sinh cho lạc (PS1, TS6, Pb8, Ba51, T15) và chế phNm cho vừng (HS10, CRT, HS8, M, CX1) đều có thể tồn tại tốt cùng nhau
Chất mang
Trung hòa pH
Trộn gỉ đường,
đất xạ hiếm, phụ
gia
Kiểm tra tạp
nhiễm
Đóng gói, khử
trùng
Xử lý thô
(nghiền, sàng,
loại bỏ tạp chất)
Bảo quản sử dụng
Chủng giống VSV
Lên men cấp 1
Lên men cấp 2
Thu sinh khối
Phối trộn
Chế phẩm VSV1 bào VSV, tạp nhiễm Kiểm tra mật độ tế
Chất mang
Trung hòa pH
Trộn gỉ đường, đất xạ hiếm, phụ gia
Kiểm tra tạp nhiễm
Đóng gói, khử trùng
Xử lý thô (nghiền, sàng, loại bỏ tạp chất)
Bảo quản sử dụng
Chủng giống VSV
Lên men cấp 1
Lên men cấp 2
Thu sinh khối
Phối trộn
Chế phẩm VSV2 Kiểm tra mật độ tế
bào VSV, tạp nhiễm
Trang 7và có thể sử dụng trong sản xuất chế phNm vi sinh cho cây lạc và vừng
Xây dựng được qui trình sản xuất chế phNm VSV1 đối kháng sử dụng cho cây lạc và VSV2 đối kháng sử dụng cho cây vừng Các chế phNm
vi sinh chứa hỗn hợp chủng VSV đối kháng
bệnh do R solanacearum và F oxysporum có
mật độ tế bào mỗi chủng đạt 109 cfu/g, thời gian bảo quản 3 tháng ở nhiệt độ phòng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Lê 9hư Kiểu, Phạm Công Minh, Trần
Quang Minh và 9guyễn 9gọc Cường,
2005 Quy trình sản xuất chế phNm vi
khuNn đối kháng VK58 phòng chống bệnh héo xanh cà chua, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 43, số 5, tr 47-54
2 10TCN: 216-1995 (216-2003): Khảo nghiệm hiệu lực phân bón trên đồng ruộng đối với cây trồng
3 9guyễn Văn Viết và cs., 2003 Kết quả
nghiên cứu phòng trừ bệnh héo xanh vi khuNn hại lạc bằng giống kháng bệnh ở vùng đất cạn và đất dốc, 2001-2002 Tuyển tập các Công trình Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 74-79
4 10TCN 714-2006: Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng của vi sinh vật
có khả năng đối kháng vi khuNn
Ralstonia solanacearum gây bệnh héo
xanh cây trồng cạn
5 Black L.L., Green S.K., Hartman G.L.,
Poulos J.M., 1991 Pepper Diseases: A
Field Guide Asian Vegetable Research
& Development Center, AVRDC Publication No.31-347, 98pp
0gười phản biện: 0guyễn Văn Viết
Trang 8T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8
