Luận án nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms)

Do đó, để theo kịp với sự phát triển của khoa học hiện đại và tiềm năng sẵn có thì cần các nghiên cứu mới theo hướng ứng dụng dựa trên thành phần hóa học và tác dụng sinh học.. Chính vì

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, thế giới có xu hướng quay về với nguồn dược liệu thiên nhiên do phát hiện nhiều tác dụng không mong muốn của nhiều loại thuốc được sản xuất bằng con đường tổng hợp hóa học Đặc biệt các dược liệu có tác dụng bổ, tăng lực, chống stress được chú ý do đời sống người dân ngày càng được nâng cao nên nhu cầu bảo vệ, nâng cao sức khỏe được xã hội quan tâm Nhân sâm là vị thuốc

bổ đã được nhân dân tín nhiệm lâu đời Hơn nữa, trong những năm gần đây tác dụng bảo vệ gan, thận của Nhân sâm trước ảnh hưởng của thuốc hóa trị đang được các nhà nghiên cứu quan tâm và chứng minh [105], [115], [180] Tuy nhiên, Nhân sâm khó trồng, hiếm, giá thành cao nên trong khoảng 50 năm qua các nhà khoa học trong và ngoài nước luôn tìm kiếm những loài dược liệu khác thuộc họ Nhân sâm để thay thế một số tác dụng mang lại từ Nhân sâm, trong đó có những cây thuộc chi Polyscias Đây là chi lớn thứ 2 trong họ Nhân sâm Đa số được sử dụng làm cây cảnh, chỉ có vài loài được sử dụng làm thuốc, trong đó Đinh lăng thuộc loài Polyscias fruticosa (L.) Harms được sử dụng làm thuốc phổ biến Polyscias fruticosa được nghiên cứu bắt đầu từ những năm 60, là một cây thuốc quý được đưa vào Dược điển Việt Nam [3] như một vị thuốc bổ khí, lợi sữa, tăng lực và chống stress; còn gọi là “Nhâm sâm của người nghèo”

Nhiều nghiên cứu cho thấy loài Polyscias fruticosa có thành phần saponin, polyacetylen, tinh dầu, flavonoid có nhiều tác dụng sinh học mang lại như chống oxy hóa [126], [135], cải thiện số lượng tinh trùng, cải thiện cơ trơn tử cung [58], [59], cải thiện trí nhớ [11], hạ đường huyết [30], [125], chống hen suyễn, kháng histamin [107], [108], chống hủy tế bào xương [174] Bên cạnh đó, Đinh lăng là loại cây dễ trồng, rẻ tiền do phù hợp với điều kiện môi trường ở nước ta Vì thế, hiện nay Đinh lăng được Thủ Tướng Chính Phủ phê duyệt quy hoạch vùng trồng nhiều nơi trong cả nước [41] với hy vọng tìm ra những công dụng thay thế cho Nhân sâm là vị thuốc được nhân dân sử dụng từ lâu

Mặc dù, Đinh lăng được nghiên cứu từ khá lâu ở nước ta, nhưng chỉ có rễ và cao rễ Đinh lăng được đưa vào Dược điển Việt Nam 5 dùng làm thuốc và nghiên cứu

Trong khi đó, tình hình thực tế hiện nay ngoài việc sử dụng rễ thì người dân còn sử dụng lá Đinh lăng rất phổ biến trong thực phẩm hằng ngày, đồng thời để phòng và hỗ trợ điều trị bệnh Vì lá Đinh lăng hàng năm cho nguồn sinh khối phong phú, dễ thu hái nhất trong tất cả các bộ phận của cây Đinh lăng Từ đó hàng loạt chế phẩm trên thị trường sử dụng lá là bộ phận dùng chính ra đời, cũng như dân gian dùng lá để làm gỏi cá và gối nằm cho trẻ nhỏ Do đó, để theo kịp với sự phát triển của khoa học hiện đại và tiềm năng sẵn có thì cần các nghiên cứu mới theo hướng ứng dụng dựa trên thành phần hóa học và tác dụng sinh học Thêm vào đó, để tăng cường các nghiên cứu mang tính thuyết phục hơn về mặt thực vật, hóa học cũng như sinh học, đề tài sẽ

kế thừa các nghiên cứu trước đây để mở rộng và phát triển sâu hơn cho dược liệu Đinh lăng dễ trồng quý giá này

Chính vì những lý do trên, để tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác, sử dụng hiệu quả và khẳng định giá trị cây Đinh lăng thuộc họ Nhân sâm theo hướng kế thừa, phát triển và ứng dụng các nghiên cứu mới về tác dụng sinh học để hỗ trợ điều trị bệnh, bên cạnh tác dụng nổi trội của họ Nhân sâm như bồi bổ, tăng lực và tăng cường miễn dịch thì đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)" được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Phân tích được đặc điểm thực vật học và định danh loài Đinh lăng

2 Xác định được thành phần hóa học có trong lá cây Đinh lăng

3 Đánh giá được tác dụng bảo vệ gan, thận của cao toàn phần lá, rễ và cao phân đoạn tiềm năng trước độc tính của thuốc hóa trị

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI POLYSCIAS

1.1.1 Thực vật học chi Polyscias

Chi Polyscias được Forster J.R & Forster G (1775) đặt tên đầu tiên từ hơn hai thế kỷ trước, sau đó tiếp tục được nhiều nhà phân loại thực vật nghiên cứu trên thế giới như Frodin & Govaerts (2003), Baker (1877), Viguier (1905), Hutchinson (1967), Smith & Stone (1965), Bernardi (1971), (Plunkett & Lowry 2010)…[121] nhiều lần mở rộng và thu hẹp các loài thuộc chi Polyscias và cuối cùng được sự đồng thuận cao của các nhà thực vật học hoàn thiện đi đến thống nhất

Hiện nay, Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa của Takhtajan A [172], loài Polyscias fruticosa (L.) Harms có vị trí phân loại như sau:

Giới thực vật (Plantae)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Bộ Hoa tán (Apiales)

Họ Nhân sâm (Araliaceae)

Chi Đinh lăng (Polyscias)

Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại thực vật của chi Polyscias theo Takhtajan A Polyscias là chi lớn thứ 2 trong họ Araliaceae Họ Araliaceae gồm 55 chi và hơn 1500 loài, phân bố đa số ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc đông y và làm kiểng [103] Chi Polyscias có nguồn gốc từ 2 từ tiếng Hy Lạp: 'poly' có nghĩa là nhiều và 'skia' có nghĩa là bóng râm biểu thị tán lá dày, đó là đặc điểm của chi Polyscias Các loài thuộc chi Polyscias thường là cây bụi sống lâu năm, hiếm khi ra hoa, thường là những cây gỗ nhỏ hay nhỡ có dáng mảnh

và có tán lá đẹp Lá kép chân vịt hay lá đơn có thùy chân vịt hoặc lá kép lông chim với các lá chét có hình dạng thay đổi; lá kèm không có hay hợp lại ở gốc thành một phần phụ nhỏ Có nguồn gốc ở Đông Nam Á và các đảo Polynesia ở Thái Bình Dương, khu vực các đảo nhiệt đới [51] Ngoài ra, 1 số loài còn mọc và được trồng ở Indonesia, Malaysia, Lào và Việt Nam [26]

Hiện nay, trên thế giới theo tra cứu tại trang chuyên khảo về thực vật của "The Plant list" [186] có tổng cộng 655 tên, trong đó có 176 loài được chấp nhận, có 473 loài đồng nghĩa, 6 loài chưa giải quyết Trong khi đó, hệ thống phân loại thực vật theo

"Catalogue of Life" [187] thì có 174 loài, 4 dưới loài và 6 thứ thuộc chi Polyscias Theo Phạm Hoàng Hộ cho biết ở Việt Nam có 8 loài thuộc chi Polyscias, trong đó loài Polyscias guilfoylei Bail có 3 thứ [12] Theo điều tra của Trung tâm Sâm Việt Nam ở các tỉnh phía Nam chi Polyscias có 6 loài [7] Đa số các loài thuộc chi Polyscias được làm cây cảnh, chỉ có một số loài được nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học để sử dụng làm thuốc, trong đó loài Polyscias fruticosa (L.) Harms được sử dụng phổ biến nhất

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Polyscias ở Việt Nam STT Tên khoa học các loài Polyscias ở Việt Nam Tên Việt Nam

1 Polyscias fruticosa (L.) Harms Đinh lăng lá xẻ

2 Polyscias scutellaria (Burm F.) Fosberg Đinh lăng lá đĩa

3 Polyscias filicifolia (C Moore ex E Fourn.) L H Bailey Đinh lăng đuôi phụng

4 Polyscias balfouriana (André) L H Bailey Đinh lăng lá tròn

5 Polyscias guilfoylei (W Bull) L H Bailey Đinh lăng lá trổ

7 Polyscias sambucifolia (Sieber ex DC.) Harms Đinh lăng lá cơm cháy

1.1.2 Thành phần hóa học của chi Polyscias

Việc nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Polyscias được nghiên cứu chủ yếu bắt đầu vào những năm 80 Tuy nhiên, cho đến nay có khoảng hơn 200 hợp chất đã được phân lập từ 12 loài thuộc chi (P amplifolia, P australiana, P balfouriana, P dichroostachya, P duplicata, P fulva, P fruticosa, P guilfoylei, P murrayi, P nodosa, P scutellaria, P serrata) trong 176 loài được chấp nhận [186] Các hợp chất phân lập chủ yếu thuộc các nhóm triterpenoid và saponin triterpenoid Bên cạnh đó còn có một số nhóm hợp chất khác như polyacetylen, tinh dầu, flavonoid, hợp chất phenol, sterol, ceramid, cerebrosid, dẫn xuất acid propanoic, lignan, dẫn xuất cyanogen khác

1.1.2.1 Thành phần triterpenoid và saponin triterpenoid

Đa số các saponin hiện diện với phần aglycon là acid oleanolic, với phần đường thường được gắn vào vị trí C3 và C28 của aglycon

Về số lượng đường của các saponin triterpenoid thì rất đa dạng có từ 1 đến 5 đơn vị đường Thành phần đa số là D-glucose và D-glucuronic; ít gặp hơn là D-galactose, D-xylopyranosyl, L-rhamnose, L-arabinose Các glycosid này có thể tổ hợp gắn với nhau ở các vị trí khác nhau tạo nên sự phong phú về cấu trúc của các triterpenoid Ngoài ra, các glycosid: L-arabinose, L-rhamnose, D-glucose, D-galactose có thể bị acetyl hóa ở một số vị trí; trong khi đó, D-glucuronic có thể gắn thêm metyl tại C6 được bắt gặp ở loài P balfouriana [171] và P fulva [137] Phần lớn các triterpenoid hiện diện trong chi Polyscias dưới dạng glycosid với phần aglycon có khung oleanan (thường là acid oleanolic, còn 1 số ít là hederagenin, acid echynocystic, 3-hydroxyoleanan, collinsogenin), dammaran và cycloartan

Acid oleanolic Hederagenin Acid echynocystic

Ara: α- L -arabinopyranosyl Gal: β- D

-galactopyranosyl Glc: β-D-glucopyranosyl

Xyl: β- D -xylopyranosyl Rha: α- L

-rhamnopyranosyl glucuronopyranosyl GlcA: β-DHình 1.1 Khung cơ bản và phần đường phổ biến của các saponin thuộc chi Polyscias

-Bảng 1.2 Thành phần triterpenoid và saponin triterpenoid trong chi Polyscias Hợp

1.1.2.2 Thành phần polyacetylen

Các hợp chất polyacetylen trong chi Polyscias thường có cấu trúc mạch thẳng, chứa nối ba nằm ở C4 và C6, nối đôi thường nằm ở C1, đôi khi xuất hiện ở C8 hoặc C9 và nhóm hydroxyl đa số ở C3, đôi khi xuất hiện ở C8, C10

Bảng 1.3 Các polyacetylen được phân lập từ chi Polyscias

1.1.2.5 Thành phần chất bay hơi

Thành phần chất bay hơi ở các loài P fruticosa, P balfouriana và P guilfoylei của chi Polyscias chủ yếu là các hợp chất thuộc loại sesquiterpen

Bảng 1.4 Thành phần chất bay hơi của chi Polyscias

P guilfoylei [52]

(73) Anisyl methyl keton P guilfoylei [113]

Hợp chất Tên cấu tử Loài TLTK

Hợp chất Tên cấu tử Loài TLTK (130) (Z)-Hex-3-en-1-yl acetat P fruticosa [60] (131) (Z)-Hex-3-en-1-ol P fruticosa [60]

P guilfoylei [52] (144) 6-Methylhept-5-en-2-on P fruticosa [13]

P guilfoylei [52]

P guilfoylei [52] (159) 7-epi-α-Selinen P guilfoylei [113]

Hợp chất Tên cấu tử Loài TLTK

Hình 1.2 Cấu trúc một số chất bay hơi chiếm hàm lượng cao trong chi Polyscias

1.1.2.4 Thành phần flavonoid

Đa số hợp chất flavonoid trong chi Polyscias đều có khung flavonol Các flavonol này thường tạo glycosid với đường glucose, galactose, rhamnose gắn vào aglycon tại C3, C7

Bảng 1.5 Các flavonoid của chi Polyscias Hợp

1.1.2.6 Thành phần sterol

Các sterol trong chi Polyscias thường có khung stigmastan

Bảng 1.7 Các sterol được phân lập từ chi Polyscias Hợp

P fulva

[69], [132], [141]

(190)

3-O-β-D-glucopyranos

yl-β-sitosterol

P fulva P.balfouriana

[132], [43]

P balfouriana

[129], [43]

1.1.3 Tác dụng sinh học của chi Polyscias

Việc nghiên cứu về tác dụng sinh học của chi Polyscias bắt đầu vào những năm 60 do các khoa dược lý, dược liệu và giải phẫu bệnh lý Viện y học quân sự Việt Nam nghiên cứu chủ yếu loài P fruticosa Cho mãi đến khoảng năm 2003 về sau, thì các nước trên thế giới bắt đầu quan tâm nghiên cứu về tác dụng sinh học ở một số loài như P amplifolia, P balfouriana, P duplicata, P filicifolia, P fulva, P guilfoylei, P murrayi và P scutellaria Các nghiên cứu thử nghiệm in vitro, in vivo trên dịch chiết, cao chiết và một số hợp chất phân lập được từ các loài thuộc chi Polyscias đã được chứng minh có tác dụng đáng kể là nhóm hợp chất saponin và tinh dầu

P amplifolia: Hợp chất (20-23) được phân lập từ loài P amplifolia có hoạt tính ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư buồng trứng A2780 với giá trị IC50 trong khoảng 6,7-10,8 µg/ml với chứng dương là actinomycin D [66]

P balfouriana: Thành phần tinh dầu trong loài P balfouriana có tính kháng lại vi khuẩn Escherichia coli (MIC 156,3 µg/ml) và nấm men Candida albican (MIC 78,13 µg/ml) [52] Trong khi đó, cao phân đoạn n-BuOH rễ có tác dụng kích thích hệ miễn dịch được đánh giá qua sự gia tăng chỉ số thực bào và gây tăng bạch cầu Sử dụng bột rễ Nhân sâm được dùng làm đối chứng Cao phân đoạn n-BuOH rễ làm tăng chỉ số thực bào tốt nhất ở liều 500 mg/kg và tăng số lượng bạch cầu tốt nhất ở liều

136 mg/kg [162] Đồng thời cao lá, cao rễ trong thí nghiệm gây loét dạ dày chuột bởi các phương pháp vật lý và hóa học và được điều trị bằng cao lá và rễ Đinh lăng lá tròn ở các liều 250 mg/kg và 500 mg/kg trọng lượng cơ thể, kết quả cho thấy cao lá

ở liều 500mg/kg thể hiện tác dụng chống loét tốt hơn cao rễ [163]

P duplicata: Cao rễ và hợp chất saponin triterpenoid (44-45), (50), (53-55), (60) trong loài P duplicata ức chế tăng trưởng tế bào ung thư buồng trứng A2780 ở người với IC50 lần lươt là 6 µg/ml, 3,4 µg/ml, 3,4 µg/ml, 10 µg/ml, 13 µg/ml, 8 µg/ml, 7 µg/ml, 2,8 µg/ml [77]

P filicifolia: Trong nghiên cứu in vitro, các dịch chiết saponin từ rễ và lá loài này có khả năng ức chế các gốc hydroxyl, superoxid, peroxid và nitric oxid Nghiên cứu đã chỉ ra rằng P filicifolia ức chế các gốc oxy hóa tự do như hydroxyl, superoxid,

peroxid và nitric oxid là tác nhân gây viêm [74] Đồng thời, saponin toàn phần từ rễ

và lá ở liều 500 mg/ml thể hiện hoạt động ức chế COX-2 (35,75 % lá và 50,95 % rễ) đáng kể so với ibuprofen (63,16 %) với mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan trên chuột được đánh giá bởi phương pháp gây u hạt [74]

P fulva: Hợp chất saponin triterpenoid (44-45) trong loài P fulva có khả năng

ức chế sự phát triển của 7 loại nấm men: Candida albicans, C krusei, C parapsilosis,

C lucitaniae, C glabrata, Cryptococcus neoformans và Candida guilliermondii và

11 loại nấm da: Microsporum audouinii, Trichophyton rubrum, Trichophyton ajelloi, Trichophyton equinum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton terrestre, Microsporum gypseum, Epidermophyton floccosum, Trichophyton violaceum, Microsporum canis, Microsporum ferrugeneum với các giá trị MIC dao động từ 0,78-

100 µg/ml [137]

P guilfoylei: Cao lá MeOH toàn phần có tính kháng lại vi khuẩn Escherichia coli với giá trị MIC 9,76 µg/ml) [50] Trong đó, tinh dầu với liều 25-50 µg/ml có tác dụng ức chế tế bào ung thư hạch với giá trị CD50 là 5,96 µg/ml bằng phương pháp MTT trên in vivo [113] Thành phần tinh dầu có hoạt tính ức chế sự phát triển dòng

tế bào ung thư biểu mô với IC50 là 70,62 µg/ml bằng phương pháp MTT [52] Ngoài

ra, hợp chất saponin triterpenoid (56) có khả năng ức chế sự tăng trưởng 3 dòng tế bào ở người và chuột với IC50 là 0,19 ± 0,001 μM đối với tế bào đại thực bào J774.A.1, 0,35 ± 0,003 μM cho tế bào biểu mô thận HEK-293 và 0,64 ± 0,045 μM cho tế bào

da WEHI-164 tương ứng [68] Đồng thời, hợp chất (69), (210) có khả năng ức chế sự phóng thích histamin bằng cách sử dụng bạch cầu đơn nhân U937 với giá trị IC 50 tương ứng

1.2 TỔNG QUAN VỀ LOÀI POLYSCIAS FRUTICOSA

1.2.1 Thực vật học của P fruticosa

1.2.1.1 Vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Đinh lăng

Tên tiếng Anh: Ming aralia

Tên gọi khác: Cây Gỏi cá, Nam dương lâm, Đinh lăng lá xẻ, Đinh lăng lá nhỏ Tên khoa học: Polyscias fruticosa (L.) Harms

Tên đồng nghĩa: Panax fruticosum L., Nothopanax fruticosum (L.) Miq.,

Tieghemopanax fruticosus (L.) R Vig

Thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) [6], [26]

lá Cụm hoa tán tụ thành chùm ở ngọn cành Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính, mẫu 5 Cuống hoa hình trụ, màu xanh, dài 0,3-0,4 cm Lá bắc tập hợp ở gốc cuống hoa (tổng bao lá bắc), hình tam giác nhọn Bao hoa thu hẹp chỉ còn 5 răng, đều, rời, dạng vảy màu xanh; 5 cánh hoa rời, đều, màu xanh, hình bầu dục thuôn nhọn ở đỉnh, dài 0,25-0,3

cm, rộng 0,1-0,15 cm, có gân giữa, tiền khai hoa van Bộ nhị: 5 nhị rời, đều, đính xen

kẽ với cánh hoa; chỉ nhị dạng sợi mảnh, màu trắng, dài 0,1-0,15 cm; bao phấn 2 ô thuôn dài màu vàng, nứt dọc, hướng trong, đính gốc Hạt phấn rời, hình cầu có 3 lỗ, màu vàng nhạt, đường kính 30-35 µm Bộ nhụy: 2-3 lá noãn, bầu dưới 2 ô hay 3 ô, mỗi ô 1 noãn, đính noãn trung trụ; 2-3 vòi rời úp sát vào nhau, thẳng đứng, màu xanh đậm, dài 1 cm; đầu nhụy hình điểm Quả hình trứng, dẹt, vỏ quả màu xanh đậm có những nốt tròn màu trắng bạc, dài 4-6 mm, rộng 3-4 mm [6], [188]

1.2.1.3 Đặc điểm sinh học phân tử

Nguyễn Thị Ngọc trâm và cs (2014) đã sử dụng 33 mồi RAPD để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu Đinh lăng (Polyscias fruticosa L Harms) ở các tỉnh Hưng Yên, Phú Yên, Đồng Nai và Bình Dương cho thấy khoảng cách di truyền rất nhỏ với hệ số tương đồng giữa các mẫu dao động trong khoảng 0,90-0,98 [40] Năm 2019, Trịnh Việt Nga và cs đã sử dụng kết hợp 3 gen matK, rbcL và trnH-psbA để phân tích mã vạch ADN của 18 mẫu giống Đinh lăng thuộc loài P fruticosa,

P balfouriana, P guilfoylei, P australiana và Polyscias sp thu thập ở Việt Nam Trình tự vùng rbcL sau khi xử lý có kích thước là 1375 bp Tuy nhiên, các trình tự gen rbcL nhóm Polyscias trên GenBank có kích thước khoảng 500-900 bp, chỉ có một loài Polyscias guilfoylei (U50251.1) có kích thước 1428 bp Do đó, khi thực hiện BLAST, chỉ xuất hiện sự tương đồng với các nhóm thuộc họ Araliaceae và loài Polyscias guilfoylei Điều này chứng tỏ, cơ sở dữ liệu vùng gen rbcL thuộc chi Polyscias trên GenBank chưa cao, không đủ cơ sở để so sánh với các mẫu trong nghiên cứu Kết quả chỉ ra rằng vùng gen matK và rbcL của Đinh lăng có tính bảo tồn và tương đồng cao, ít sự khác biệt giữa các mẫu Đinh lăng trong nghiên cứu Trong khi đó vùng gen trnH-psbA có sự khác biệt di truyền nhiều hơn [32]

Đến năm 2020, Trịnh Việt Nga và cs đánh giá đa dạng di truyền của 8 mẫu giống Đinh lăng lá nhỏ được thu thập từ nhiều vùng khác nhau ở Việt Nam thông qua

kỹ thuật ISSR-PCR Kết quả cho thấy 8 mẫu giống Đinh lăng lá nhỏ có mức độ tương đồng di truyền cao, dao động trong khoảng 0,57-0,90 [33]

Định danh dược liệu bằng phương pháp chỉ thị ADN kết hợp với đặc điểm hình thái được nhiều nước trên thế giới quan tâm, đi đến thống nhất xây dựng phương pháp và ngân hàng dữ liệu gen trên NCBI Vì thế, dữ liệu trên ngân hàng gen là sự cấp thiết cần có để kết hợp định danh thực vật Nhưng vào thời điểm năm 2019, trên Genbank NCBI được các nhà khoa học công bố dữ liệu đoạn gen matK, trnH-psbA

và ITS của loài P fruticosa [190] Trong khi 3 gen của lục lạp (rbcL, matK, psbA) đang được các nhà nghiên cứu dùng song song hoặc phối hợp [109] Vì vậy, xây dựng mã vạch ADN vùng gen rbcL của loài P fruticosa là sự cần thiết thực hiện

trnH-Hình 1.3 Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)

“Nguồn: Bernal, 2015” [185], [188]

1.2.1.4 Phân bố, sinh thái, bộ phận dùng

Đinh lăng có nguồn gốc ở các vùng đảo Polynesia ở Thái Bình Dương Vì Đinh lăng có nhiều công dụng có ích nên hiện nay được nhân rộng ra trồng ở Malaysia, Indonesia, Campuchia, Lào, Ấn Độ, miền Nam Trung Quốc và rải rác khắp Việt Nam [26], [6] Ở Việt Nam, trước đây Đinh lăng được người dân trồng để làm cây cảnh, tuy nhiên hiện nay định hướng thực hiện theo Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 của Thủ tướng Chính phủ phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020, định hướng đến năm 2030 [41] trong 8 vùng sinh thái như vùng Tây Bắc, Đông Bắc, đồng bằng sông Hồng, Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ

Đinh lăng có thể sử dụng được toàn bộ các bộ phận từ rễ, thân (cành) và lá để làm thuốc trị bệnh, bồi bổ sức khỏe Đặc biệt lá được làm gia vị, làm gỏi cuốn với cá cho một số món ăn vì thế dân gian gọi là cây gỏi cá Cây phát triển xanh tốt quanh năm, lá cho một lượng sinh khối rất lớn và hiện nay được sử dụng khá nhiều, đây là một tiềm năng lớn cho các công ty sản xuất với số lượng lớn dược liệu từ loài này Nhưng trước đây các nhà khoa học chủ yếu tập trung nghiên cứu rễ và được đưa vào chuyên luận Dược điển Việt Nam chỉ có rễ và cao rễ Đinh lăng Cây có khả năng tái sinh dinh dưỡng cao Còn thân Đinh lăng người ta thường dùng để nhân tạo giống,

bằng cách giâm cành (thân); chọn những cành già, chặt thành đoạn ngắn 15-20 cm, cắm xuống đất đều trở thành cây mới Đinh lăng ưa đất tơi xốp, cao ráo, thoát nước tốt Cây có thể chịu hạn và bóng râm

Cây trồng từ 3 năm trở lên có thể thu hoạch [6], [26] Trên thực tế, sau từ 3 năm sinh trưởng trong điều kiện chăm sóc đúng quy trình, cây Đinh lăng sẽ tích lũy

đủ các hoạt chất và cho thu hoạch Trong khi đó, kỹ thuật trồng Đinh lăng khá đơn giản Đã có một số nghiên cứu về hàm lượng hoạt chất chính trong Đinh lăng từ 1-5 năm tuổi, kết quả cho biết với thời gian tích lũy hoạt chất từ 3 năm trong cây thì có thể thu hái để sử dụng với chất lượng tương đối tốt, ổn định về mặt kinh tế và chất lượng [39]

1.2.2 Thành phần hóa học của P fruticosa

Cho đến nay, nghiên cứu hóa học trên loài này chưa nhiều Các nghiên cứu chủ yếu là tập trung vào các nhóm hợp chất quan trọng như: Triterpenoid, saponin triterpenoid, polyacetylen, tinh dầu, flavonoid

Việc nghiên cứu về thành phần hóa học của Polyscias fruticosa được nghiên cứu chủ yếu bắt đầu vào những năm 1985 Theo Ngô Ứng Long và cộng sự (Viện Y học Quân sự) và Viện Y sinh học Liên Xô thì rễ và lá Đinh lăng chứa saponin, alkaloid, các vitamin tan trong nước như B1, B2, B6, C…, 20 loại acid amin, glycosid, phytosterol, tanin, acid hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lượng và 21,10% đường [26]

Năm 1990, Brophy và cộng sự [60] áp dụng kỹ thuật GC-MS đã phân tích trong lá của P fruticosa xác định được 24 hợp chất bao gồm: Aromadendren (77), α-bergamoten (79), (E)-γ-bisabolen (81), β-bourbonen (82), δ-cadinen (84), calacoren (87), calamenen (89), β-caryophyllen (91), α-copaen (100), α-cubeben (102), β-cubeben (103), β-elemen (107), -elemen (108), δ-elemen (109), germacren-B (119), germacren-D (120), β-gurjunen (126), (Z)-hex-3-en-1-yl acetat (130), (Z)-hex-3-en-1-ol (131), 1-hexanol (132), α-humulen (133), limonen (138), α-ylangen (167), β-ylangen (168)

Năm 1992, Lutomski và Trần Công Luận [123] đã phân lập được từ rễ của P fruticosa thu được 5 hợp chất polyacetylen bao gồm: (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-

diyn-3,10-diol (64), (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on (65), heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on (66), falcarinol (67) và panaxydol (68) Năm 1995-1996, Chaboud và cộng sự [64], [65] đã phân lập được từ lá của P fruticosa thu được acid 3-O--D-galactopyranosyl-(1→2)--D-glucopyranosyl oleanolic (8), 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)--D-glucopyranosyl oleanolic 28-O--D-glucopyranosyl ester (9)

(8Z)-Năm 1998, Võ Duy Huấn và cộng sự [179] đã phân lập được từ rễ của P fruticosa thu được 11 saponin triterpenoid 5 vòng, với phần aglycon thuộc khung cơ bản là oleanan Trong đó 4 saponin: Ladyginosid A, hợp chất số 6, polysciosid A và

D đều có trong lá và rễ Các saponin còn lại chỉ hiện diện trong lá như R1, polysciosid G và H hoặc ở trong rễ như polysciosid B, C, E và F: Ladyginosid A (acid 3-O--D-glucopyranosyl-(1→4)--D-glucuronopyranosyl oleanolic) (10), gingibrosid-R1 (acid 3-O--D-glucopyranosyl-(1→2)--D-glucuronopyranosyl oleanolic) (5), polysciosid A (acid 3-O-[-D-glucopyranosyl-(1→2), -D-glucopyranosyl-(1→4)]--D-glucuronopyranosyl oleanolic) (11), polysciosid B (acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), -D-glucopyranosyl-(1→4)]--D-glucuronopyranosyl oleanolic) (12), polysciosid C (acid 3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→2), -D-glucopyranosyl-(1→3)]--D-glucuronopyranosyl oleanolic) (13), 3-O-

zingibrosid--D-glucopyranosyl-(1→4)--D-glucuronopyranosyl oleanolic -28-O--Dglucopyranosyl ester (PFS) (14), polysciosid D (3-O-[-D-glucopyranosyl-(1→2), -

-D-glucopyranosyl-(1→4)]--D-glucuropyranosyl oleanolic 28-O--Dglucopyranosyl ester) (15), polysciosid E (3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), -D-glucopyranosyl-(1→4)]--D-glucuropyranosyl oleanolic 28-O--D-glucopyranosyl ester) (16), polysciosid F (3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→2), -D-glucopyranosyl-(1→3)]--D-glucuropyranosyl oleanolic 28-O--D-glucopyranosyl ester) (17), polysciosid G (3-O--D-glucopyranosyl-(1→4)- -D- glucuronopyranosyl oleanolic 28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]--D-glucopyranosyl ester) (18), polysciosid H (3-O-[-D-glucopyranosyl-(1→2), -D-glucopyranosyl-(1→4)]--D-

-glucuronopyranosyl oleanolic 28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)--Dglucopyranosyl ester) (19)

-Năm 2005, Divakar và cộng sự [75] đã phân lập được từ lá và rễ P fruticosa bao gồm: Acid oleanolic -28-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucopyranosyl-rhamnopyranosid (25) và acid 3-O-α-L-arabinopyranosyl oleanolic -28-O--D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl-rhamnopyranosid (26)

Năm 2012, Nguyễn Thị Luyến và cộng sự [30] đã phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ lá của P fruticosa bao gồm: Quercitrin (171), afzelin (172) và kaempferol-3-O-rutonosid (173)

Năm 2016, Lý Thị Thu Hoài và Nguyễn Thị Yến [13] áp dụng kỹ thuật

GC-MS đã phân tích trong lá cây P fruticosa xác định được các hợp chất trong tinh dầu bao gồm: Cadinen-G (86), 9-epi-(E)-caryophyllen (92), trans-α-bergamoten (117), β-copaen (101), elemen-D (110), 6-methylhept-5-en-2-on (144), muurolen-G (146), n-octanal (150), caryophyllen oxid (94), cis-β-elelmen (106), gurjunen-G (128) Năm 2016, Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cộng sự [91] đã phân lập được từ lá của P fruticosa hợp chất saponin là polysciosid I với tên 3-O-β-D-glucopyranosyl- (1→2) -β-D-glucopyranosyl- (1→4) -β-D-glucuronopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl (1→2)-β-D-galactopyranosyl ester (38)

Năm 2016, Nguyễn Thị Ngọc Đan và cộng sự [9] đã phân lập được 1 hợp chất polyacetylen từ rễ của P fruticosa là falcarindiol (69)

Năm 2017, Nguyễn Thị Thu Trâm và cộng sự [175] đã phân lập từ rễ của P fruticosa thu được 1 sterol có cấu trúc là 22-dehydro-24-isopropylcholesterol (195) Cây Đinh lăng thuộc họ Nhân sâm, nhìn chung hợp chất đặc trưng của loài này chủ yếu là các saponin triterpenoid với aglycon là acid oleanolic Số lượng cấu trúc được phân lập trong loài này so với một số cây thuộc họ Nhân sâm thì số lượng còn khá khiêm tốn đối với 1 loài cây đầy triển vọng và phong phú ở nước ta hiện nay Đặc biệt từ năm 2017 đến nay chưa có thêm công bố nào bổ sung thành phần hóa học cho loài này Vì vậy, cần tiến hành đầu tư nghiên cứu phân lập và xác định nhiều hợp chất hơn nữa để bổ sung thêm hợp chất mới trong tự nhiên nói chung và cho chi Polyscias nói riêng từ các phân đoạn phân cực đến kém phân cực

1.2.3 Tác dụng sinh học của loài P fruticosa

Trong khoảng 50 năm trở lại đây, nhiều nhóm tác giả đã nghiên cứu khá sâu

về tác dụng sinh học của loài Đinh lăng này Chủ yếu các công trình nghiên cứu ở trong nước là chủ yếu, còn tình hình nghiên cứu ngoài nước còn rất khiêm tốn Đinh lăng được các nhà khoa học Liên Xô (trước đây) thử nghiệm tác dụng tăng lực và chống stress trên sức khỏe của các phi công Đặc biệt là ở nước ta vào những năm 80 thì nhóm nghiên cứu của Ngô Ứng Long và cộng sự cho biết rễ Đinh lăng ít độc hơn Sâm triều tiên, Đinh lăng có tác dụng bổ, tăng lực, ăn ngon, ngủ tốt, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng khả năng thích nghi trong điều kiện bất lợi, cải thiện trí nhớ…Rễ Đinh lăng được dùng làm thuốc bổ, tăng lực, trị suy nhược cơ thể, tiêu hóa kém, phụ

nữ sau khi sanh ít sữa Còn dùng làm thuốc chữa ho, ho ra máu, thông tiểu tiện, chữa kiết lỵ Thân và cành chữa phong thấp, đau lưng Lá dùng chữa cảm sốt, mụn nhọt, sưng tấy, dị ứng mẩn ngứa… Ở Ấn Độ, Đinh lăng được dùng làm thuốc trị sốt rét

Rễ và lá sắc uống có tác dụng lợi tiểu chữa sỏi thận, sỏi bàng quang, chứng khó tiểu tiện Bột lá được giã với muối và đắp trị vết thương [6], [26]

Tiếp nối các nghiên cứu và phát triển về tác dụng sinh học của loài Đinh lăng này đó là nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thới Nhâm, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng

sự (Trung tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh – Viện Dược liệu) [7] và một số công trình trong và ngoài nước được tóm tắt ở Bảng 1.9

Bảng 1.9 Tổng hợp tác dụng sinh học của loài P fruticosa

1 Tác dụng tăng lực-chống nhược sức Cao ethanol

phối hợp lá

và rễ

Có tác dụng tăng lực ở liều <180 mg/kg được xác định bằng 2 nghiệm pháp thực hiện trên chuột nhắt: Chuột bơi kiệt sức của Brekhman và chuột leo dây của Cabureb [7]

2 Tác dụng trên sinh sản Cao ethanol

lá Cải thiện số lượng tinh trùng của mào tinh hoàn ở liều 100 và 500 mg/ kg Sự bất thường của tinh trùng giảm ở chuột đực ở liều 100 mg/ kg [59]

Cao ethanol

lá

Cải thiện cơ tử cung và tăng sự phát triển của nang trứng ở giai đoạn nang trứng nguyên thủy và sơ cấp với liều 100 mg/kg ở chuột cái không mang thai [58]

4 Tác dụng cải thiện trí nhớ Cao lá

ethanol

Liều 100 mg/kg thể hiện tác dụng cải thiện trí nhớ trên thực nghiệm gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin được đánh giá bằng 2 thực nghiệm mê cung bơi và tránh né thụ động [23]

5 Tác dụng chống xơ vữa động mạch, hạ cholesterol Cao ethanol

phối hợp lá

và rễ

Ở liều 90-180 mg/kg thể trọng làm giảm sự gia tăng cholesterol huyết và lipid toàn phần trong huyết thanh của động vật bị gây xơ vữa động mạch thực nghiệm bằng chế độ ăn giàu cholesterol (gây tăng cholesterol ngoại sinh) và bằng Tween 80 (gây tăng cholesterol nội sinh) [35]

Cao ethanol

lá

Ở liều 200 mg/kg làm hạ cholesterol chuột nhắt trên mô hình đánh giá tác dụng hạ cholesterol trên động vật gây tăng cholesterol máu bằng đường uống [5]

6 Tác dụng hạ đường huyết Hợp chất

7 Tác dụng lợi tiểu

lá

Ở liều 200 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa do làm giảm hàm lượng MDA trong não và gan chuột nhắt sau khi được gây tăng bằng CCl 4 trên mô hình gây tăng hàm lượng MDA ở não và gan chuột nhắt trắng [5]

9 Tác dụng bảo vệ gan Cao ethanol

Ở liều 100 mg/kg đã duy trì ở mức bình thường hàm lượng MDA trong gan chuột trong mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl 4 Tác dụng chống oxy hóa thể hiện qua việc ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào có thể là một trong những cơ chế tác dụng bảo vệ gan của Đinh lăng [20]

10 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương Cao ethanol

phối hợp rễ

và lá

Ở khoảng liều < 180 mg/kg trên chuột nhắt trắng, cao Đinh lăng có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, làm gia tăng vận động tự nhiên, rút ngắn thời gian ngủ của natri barbital Khi ở liều cao hơn, cao Đinh lăng thể hiện tác dụng ức chế thần kinh trung ương, làm giảm vận động tự nhiên, kéo dài thời gian ngủ của natri barbital [7]

11 Tác dụng chống stress tâm lý Cao ethanol

phối hợp lá

và rễ

Ở những liều 45, 90 và 180 mg/kg thể hiện tác dụng hồi phục thời gian ngủ

bị rút ngắn bởi stress và đưa trở về trạng thái bình thường trên thực nghiệm stress tâm lý (stress cô lập) [16]

Saponin lá Có tác dụng hồi phục giấc ngủ barbital bị rút ngắn bởi stress [7]

Cao ethanol

lá

Ở khoảng liều 50-100 mg/kg khi sử dụng 1 liều duy nhất không có tác dụng Khi sử dụng liều lặp lại trong 7 ngày liên tiếp có tác dụng chống trầm cảm trên mô hình thực nghiệm bơi cưỡng bức ở cơ địa chuột nhắt bình thường

và cơ địa bị stress [14]

12 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Cao ethanol

Mẫu thử Kết quả

13 Tác dụng kích thích miễn dịch Hợp chất

14 Tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm, chống loét Cao n-BuOH

Ở liều 100-500 mg/kg có tác dụng giảm tiết dịch, giảm ho trên mô hình gây

ho cho chuột bởi acid citric nên là lựa chọn trong việc làm giảm triệu chứng của hen suyễn [108]

Cao ethanol

lá

Ở liều 100-500 mg/kg có tác dụng chống hen suyễn, kháng histamin và duy trì sự ổn định của tế bào mast trên mô hình bệnh hen suyễn gây bởi ovalbumin và gây kích ứng co thắt phế quản bằng acetylcholin điều này có

ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị hen suyễn [106]

16 Tác dụng chống hủy tế bào xương Cao ethanol

lá, hợp chất

(14), (171)

Cao lá có tác dụng chống hủy tế bào xương ở nồng độ 50 μg/ml Hợp chất (48), (100) suy giảm quá trình tạo xương thông qua ức chế chức năng và hình thành quá trình hủy xương gây ra bởi RANKL với giá trị IC 50 là 25,2

± 3,2 μM/ml và 71,5 ± 6,9 μM/ml tương ứng [174]

Trong khoảng 50 năm gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu cho biết loài

P fruticosa mang lại nhiều tác dụng sinh học quý giá Tuy nhiên, cho đến nay trên thế giới chưa có nghiên cứu nào về tác dụng hữu ích của Đinh lăng theo hướng bảo

vệ gan, thận theo cơ chế chống oxy hóa, chống các quá trình stress oxy hóa, viêm, quá trình appotosis do một số tác nhân gây tổn thương thận như tác dụng không mong muốn các thuốc trong phác đồ điều trị ung thư và biến chứng của các bệnh khác mang lại Vì vậy, để kế thừa nghiên cứu và phát triển theo hướng mới trên đối tượng đầy tiềm năng này trong việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến gan, thận trước các tác nhân hóa trị hiện nay là hết sức cần thiết và thời đại

1.3 MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU IN VIVO GÂY TỔN THƯƠNG GAN, THẬN 1.3.1 Mô hình gây tổn thương thận in vivo

Mô hình gây độc thận với cisplatin: Cisplatin là một thuốc hóa trị liệu chống ung thư chứa platin được sử dụng rộng rãi, có tác dụng độc với tế bào, chống u và có đặc tính sinh hóa tương tự như các chất alkyl hóa Thuốc thường được dùng trong nhiều phác đồ điều trị do tương đối ít gây độc cho huyết học Thuốc dễ gây thương tổn chức năng thận, nhà sản xuất khuyến cáo phải làm điện giải đồ, nồng độ creatinin huyết thanh và độ thanh thải creatinin, urê huyết trước khi bắt đầu điều trị và trước mỗi lần lặp lại liệu trình cisplatin, phải ngừng thuốc nếu nồng độ creatinin huyết thanh trên 1,5 mg/dl [4] Hiện nay, stress oxy hóa, viêm và quá trình apoptosis đã được chứng minh là cơ chế chính liên quan đến độc tính trên thận do cisplatin gây ra [99] Một số nghiên cứu đã được thực hiện gây độc tính thận và bảo vệ thận của các chất trên mô hình gây độc bởi cisplatin làm tăng ure, creatinin huyết, gây peroxyd hoá lipid gây tăng hàm lượng MDA, giảm hoạt tính các enzym và chất chống oxy hoá, đồng thời làm tăng tình trạng viêm [19], [37], [115], [144]

Mô hình gây độc thận với gentamycin: Gentamycin là kháng sinh nhóm aminoglycosid, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Gram âm

và Gram dương Một biến chứng chính khi điều trị bằng gentamycin là độc tính trên thận, chiếm 10-15% tổng số các trường hợp suy thận cấp Sự tích tụ các aminoglycosid trong vỏ thận được biết là có liên quan mật thiết đến cơ chế bệnh sinh của độc tính trên thận Cơ chế gây độc đã được đề cập liên quan đến stress oxy hóa, tăng peroxyd hóa lipid màng, biến tính protein, tổn thương ADN và tế bào [78]

Mô hình gây độc thận với vancomycin: Vancomycin là kháng sinh nhóm glycopeptid nhân 3 vòng phổ hẹp, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Gram dương Tuy nhiên, một biến chứng chính khi điều trị bằng vancomycin

là độc tính trên thận đáng kể, từ 0-17% trong các trường hợp đơn trị liệu và 7-35% trường hợp phối hợp với các kháng sinh khác Các nghiên cứu đã cho thấy vai trò của oxy hóa tiền viêm, rối loạn chức năng ty lạp thể và apoptosis gây ra các tổn thương chính [138]

Mô hình gây độc thận với acetaminophen: Acetaminophen là một trong những loại thuốc giảm đau và hạ sốt phổ biến nhất Tuy nhiên, khi sử dụng quá liều là nguyên nhân gây xơ gan và suy thận trên người và động vật Một số nghiên cứu trên mô hình độc thận với acetaminophen đã được báo cáo với liều 700 mg/kg [101]

Bảng 1.10 Một số mô hình in vivo gây tổn thương thận

Liều Nguyễn Thị Thu Hương và cs

[19] Chuột nhắt đực (Swiss albino) Cisplatin i.p 15 mg/kg Nguyễn Ngọc Phụng và cs [37] Chuột nhắt đực

(Swiss albino) Cisplatin i.p 15 mg/kg Park J Y và cs [144] Chuột nhắt đực

(C57BL) Cisplatin i.p 16 mg/kg Lee và cs [115] Chuột nhắt đực

(C57BL) Cisplatin i.p 16 mg/kg Erdem A và cs [78] Chuột cống đực

(Wistar) Gentamycin i.p 100 mg/kg

(BALB/c) Vancomycin i.p 200 mg/kg Kheradpezhouh E và cs [101] Chuột cống đực

(Sprague Dawley) Acetaminophen i.p 700 mg/kg

Nghiên cứu sử dụng mô hình in vivo gây tổn thương thận ở chuột nhắt trắng với tác nhân cisplatin với cơ chế gây độc thận đã được biết rõ và kế thừa trên cơ sở các nghiên cứu trước trên các đối tượng một số cây thuộc chi Panax (họ Nhân sâm) như sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) đã làm giảm đáng kể tổn thương thận trên mô hình gây tổn thương thận bằng thuốc hóa trị cisplatin [105], [115], [144], [180]

1.3.2 Mô hình gây tổn thương gan in vivo

Mô hình gây độc gan với cyclophosphamid: Cyclophosphamid là một tác nhân alkyl hoá chống ung thư, thuộc nhóm oxazaphosphorin Thuốc là một “tiền dược’’ chỉ tác dụng khi vào trong cơ thể được chuyển hoá ở gan thành các chất chuyển hoá

có hoạt tính và cyclophosphamid hoạt động như một tác nhân alkyl hoá, ngăn cản DNA sao chép và RNA phiên mã, cuối cùng dẫn đến phá vỡ chức năng acid nucleic [4] Stress oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh do cyclophosphamid gây ra những độc tính trên gan [166] Một số nghiên cứu đã được thực hiện gây độc tính gan và bảo vệ gan của các chất trên mô hình gây độc bởi

cyclophosphamid gây peroxyd hoá lipid gây tăng hàm lượng MDA, giảm hoạt tính các enzym và chất chống oxy hoá (ALT, AST, GSH, ), đồng thời làm tăng tình trạng viêm (tăng TNF-) [24], [10], [46], [49], [166]

Mô hình gây độc gan với acetaminophen: Acetaminophen là chất chuyển hóa

có hoạt tính của phenacetin, là thuốc giảm đau-hạ sốt hữu hiệu nên được sử dụng phổ biến Với liều điều trị, paracetamol chuyển hóa chủ yếu qua phản ứng liên hợp sulfat

và glucuronid Một lượng nhỏ thường chuyển thành một chất chuyển hóa độc, acetyl-p-benzoquinonimin (NAPQI) NAPQI được khử độc bằng glutathion và đào thải vào nước tiểu Khi chất chuyển hóa không được liên hợp với glutathion sẽ gây độc cho các tế bào gan và gây hoại tử tế bào Acetaminophen thường an toàn khi dùng với liều điều trị, vì lượng NAPQI được tạo thành tương đối ít và glutathion tạo thành trong tế bào gan đủ liên hợp với NAPQI Tuy nhiên, khi quá liều hoặc đôi khi với liều thường dùng ở một số người nhạy cảm, nồng độ NAPQI có thể tích lũy gây độc cho gan [4]

N-Mô hình gây độc gan với ethanol: Rượu bia gây ảnh hưởng tới rất nhiều cơ quan như gan, thận, não… Trong đó gan là cơ quan bị tổn thương nhiều nhất Với trên 95% lượng rượu hấp thụ trong cơ thể sẽ được chuyển hóa ở gan, phần còn lại sẽ được bài tiết ra ngoài thông qua mồ hôi và nước tiểu Trong quá trình chuyển hóa rượu tạo ra các gốc tự do gây peroxy hóa làm tổn thương các tế bào gan dẫn đến một

số bệnh gan do rượu như gan nhiễm mỡ, xơ hóa gan, viêm gan, ung thư gan Ethanol làm tổn thương các tế bào gan bị hoại tử sẽ giải phóng các aminotransferase vào máu, hoạt độ của AST và ALT sẽ tăng cao hơn so với mức bình thường, trong quá trình chuyển hóa ethanol bởi enzym cytochrom P450 2E1 (CYP 2E1) đã hình thành các gốc tự do (ROS), nó tấn công vào các phospholipid màng tế bào gây ra quá trình peroxy hóa lipid hình thành MDA và ROS làm giảm GSH nội sinh [28]

Mô hình gây độc gan với D-galactosamin: D-galactosamin là một tác nhân gây độc cho gan và đã được phát hiện là gây ra thiệt hại gần giống với bệnh viêm gan

vi rút ở người Tăng sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) đã được báo cáo trong nuôi cấy sơ cấp tế bào gan chuột thiệt hại do D-galactosamin gây ra Mối quan hệ

giữa tổn thương oxy hóa và tổn thương tế bào gan đã được quan sát thấy thông qua nhiều nghiên cứu trước đây [167]

Mô hình gây độc gan với thioacetamid: Thioacetamid là một hợp chất hữu cơ

có chứa lưu huỳnh được sử dụng trong việc sản xuất các chất xúc tác, chất ổn định, chất ức chế trùng hợp, hóa chất chụp ảnh, thuốc trừ sâu Tuy nhiên, khi sử dụng

thanh, aspartate aminotransferase và bilirubin Hơn nữa, sự giảm hoạt động của enzym chống oxy hóa bao gồm superoxid dismutase và catalase cũng như sự gia tăng malondialdehyd đã được phát hiện trong nhóm đối chứng thioacetamid [165]

Bảng 1.11 Một số mô hình in vivo gây tổn thương gan

Liều Nguyễn Thị Thu Hương

và cs [24] Chuột nhắt đực (Swiss albino) Cyclophosphamid i.p 150 mg/kg Ngô Quốc Hận và cs

[10] Chuột nhắt đực (Swiss albino) Cyclophosphamid i.p 150 mg/kg

(Sprague Dawley) Thioacetamid i.p 200 mg/kg

Nghiên cứu sử dụng mô hình in vivo gây tổn thương gan trên chuột nhắt trắng với tác nhân cyclophosphamid theo cơ chế gây stress oxy hóa Trên cơ sở với các ưu điểm gồm cơ chế gây độc gan được biết rõ, tác động gây tổn thương cấp tính nhanh,

đã có nghiên cứu chứng minh rễ và lá cây Đinh lăng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học thể hiện khả năng chống oxy hóa, bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan cấp bằng CCl4 [20]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu 10 mẫu toàn cây Đinh lăng 3 năm tuổi (rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt) được thu hái đại diện tại các vùng sinh thái theo định hướng thực hiện theo Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 của Thủ tướng Chính phủ phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020, định hướng đến năm 2030 [41]

và được mã hóa tại Bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục mã hóa các mẫu Đinh lăng STT Nơi thu hái

(vĩ độ, kinh độ) Mã hóa mẫu tiêu bản Nơi lưu mẫu

Tịnh Biên-An Giang PFAG-2019

Tịnh Biên-An Giang PFAG-2020

Mẫu dùng cho nghiên cứu về thực vật học (hình thái, vi phẫu, soi bột), chiết xuất, phân lập, thử độc tính cấp, đánh giá tác dụng sinh học là mẫu PFAG-2016, toàn cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) được thu hái tháng 11 năm 2016, do trạm bảo vệ thực vật Tịnh Biên, tỉnh An Giang cung cấp Nguyên liệu được định danh bằng cách so sánh với hình thái tiêu bản gốc, tài liệu tham khảo của các tác giả Trương Thị Đẹp [188], Võ Văn Chi [6], Đỗ Tất Lợi [26], Bernard B.M [57] và trang chuyên khảo về thực vật của "The Plant list" [185], [186] Khoảng 60 kg lá tươi và 37 kg rễ (55 kg lá tươi, 35 kg rễ tươi, sau khi phơi khô còn 11 kg lá khô; 9,3 kg rễ khô để nghiên cứu hóa học và sinh học; phần dược liệu tươi còn lại để nghiên cứu về thực vật học và chiết tinh dầu, chất bay hơi)

Mẫu dùng cho định danh xác định ADN, xây dựng mã vạch là mẫu lá cây Đinh lăng tươi PFAG-2019 được thu hái tháng 5 năm 2019

Mẫu dùng cho đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử rbcL và chiết xuất, định lượng tinh dầu, chất bay hơi là mẫu PFĐB-2020, PFPT-2020, PFNĐ-2020, PFTH-2020, PFQN-2020, PFGL-2020, PFHCM-2020, PFĐN-2020, PFCT-2020, PFAG-2020 được thu hái tháng 7 năm 2020 Tất cả các mẫu được chọn lọc sau khi thu hái về được xử lý cùng 1 điều kiện và thời điểm nhất định

2.1.2 Động vật thử nghiệm

Chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh, chủng Swiss albino, trọng lượng 25 ± 2 g, 5-6 tuần tuổi, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế-TP Nha Trang Chuột khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thường Chuột được nuôi bằng thực phẩm viên (được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế-TP Nha Trang), nước uống đầy đủ và được để ổn định (trong điều kiện nhiệt độ phòng 28 ± 2 oC, độ ẩm tương đối 60-70%, ánh sáng đảm bảo 12 giờ tối/12 giờ sáng) ít nhất 5 ngày trước khi thử nghiệm Thể tích cho uống hay tiêm phúc mạc (i.p.) là 10 ml/kg trọng lượng chuột Các thí nghiệm trên động vật nghiên cứu được thực hiện theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế [2] và tuân thủ theo nguyên tắc 3R (Replacement, Reduction and Refinement) [94]