Luận án nghiên cứu biểu hiện dấu ấn tế bào gốc ung thư trong ung thư biểu mô tế bào gan

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch đối với 3 dấu ấn: CK19, CD44, EpCAM nhằm xác định kiểu biểu hiện, đồng biểu hiện tế bào gốc ung thư của gan tro

MỞ ĐẦU

Theo Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) ung thư gan là bệnh lý ung thư thường xảy ra và là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở các nước kém phát triển Trong ung thư gan thì ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG) chiếm đa số (khoảng 90%), còn lại

là ung thư biểu mô tế bào đường mật hoặc ung thư biểu mô phối hợp tế bào gan và tế bào đường mật Khoảng 70-90% UTBMTBG có liên quan đến viêm gan siêu vi B, C mạn tính; xơ gan; bệnh lý gan do rượu; bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu,…ngoài ra còn có các yếu tố nguy cơ khác như nhiễm độc, hút thuốc lá,… Do có liên quan đến nhiều yếu tố nguy cơ và tính đa dạng của tế bào mà tiên lượng của UTBMTBG rất khác nhau Với sự phát triển của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã nghiên cứu về

sự đột biến của tế bào ung thư gan và phát hiện quần thể tế bào có đặc tính tương tự tế bào gốc bình thường [2],[5],[85]

Trong những năm gần đây, lý thuyết tế bào gốc ung thư đã chứng minh tế bào gốc ung thư có những đặc điểm sau: (i) tự tái tạo, (ii) biệt hóa, (iii) sự hình thành u, và (iv) kháng hóa/xạ trị liệu Từ những đặc tính độc đáo này có thể ứng dụng vào lâm sàng, như: hỗ trợ chẩn đoán, dự đoán tiên lượng thông qua biểu hiện của dấu ấn tế bào gốc ung thư và định hướng phát triển điều trị nhắm trúng đích đối với tế bào gốc ung thư Gần đây, trên thế giới có nhiều nghiên cứu sử dụng các dấu ấn khác nhau: EpCAM, CK19, CD133, CD90, CD44, CD24 và CD13, như là các dấu ấn bề mặt tế bào đặc hiệu để biểu hiện tế bào gốc ung thư của gan trong UTBMTBG [30],[32] Tuy nhiên, do đặc tính không đồng nhất của UTBMTBG nên tính đặc hiệu riêng của mỗi dấu ấn tế bào gốc ung thư của gan là có giới hạn Vì vậy, các nhà nghiên cứu thường phối hợp nhiều dấu ấn tế bào gốc ung thư của gan kết hợp với các đặc điểm lâm sàng-giải phẫu bệnh để chẩn đoán và tiên lượng bệnh UTBMTBG [106]

Tại Việt Nam, chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào về kiểu biểu hiện, đồng biểu hiện của các dấu ấn tế bào gốc ung thư của gan trong UTBMTBG được công bố Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch đối với 3 dấu ấn: CK19, CD44, EpCAM nhằm xác định kiểu biểu hiện, đồng biểu hiện tế bào gốc ung thư của gan trong UTBMTBG vì những lý do sau:

- CK19 là dấu ấn biểu hiện đặc tính biệt hóa kém, xâm lấn, di căn của tế bào gốc ung thư của gan Theo phân loại u hệ thống đường tiêu hóa phiên bản thứ 5, năm

2019 của TCYTTG, UTBMTBG có tế u dương tính với CK19 thì tiên lượng xấu và kháng với các phương pháp điều trị tại chỗ như TACE, RFA,…[10],[98],[119]

- CD44 là dấu ấn quan trọng được dùng để kết hợp với những dấu ấn khác làm tăng khả năng hiện diện của TBGUT của gan và mức độ biểu hiện của CD44 là một yếu tố tiên lượng xấu của UTBMTBG [58],[94]

- EpCAM là dấu ấn không biểu hiện trong tế bào gan bình thường nhưng biểu hiện rõ trong mô gan tiền ung thư vì vậy EpCAM được xem là dấu ấn phát hiện sớm

và giữ vai trò quan trọng trong sự khởi phát và tiên lượng của UTBMTBG [18],[70],[88]

Như vậy, trong UTBMTBG tỉ lệ biểu hiện, đồng biểu hiện của các dấu ấn EpCAM, CK19, CD44 là bao nhiêu? Và có liên quan như thế nào đối với đặc điểm giải phẫu bệnh UTBMTBG?

Với đặc tính của UTBMTBG là loại ung thư có hình thái đa dạng tế bào, tỉ lệ mắc bệnh cao, tỉ lệ tử vong cao; cũng như những lợi ích mà kết quả nghiên cứu có thể mang lại cho bệnh nhân ung thư gan ở Việt Nam, như: chẩn đoán, tiên lượng, định hướng điều trị trúng đích, và để trả lời câu hỏi nghiên cứu chúng tôi thực hiện nghiên cứu biểu hiện các dấu ấn tế bào gốc ung thư trong UTBMTBG với mục tiêu như sau:

1 Xác định kiểu biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch trong UTBMTBG

2 Xác định mối liên quan giữa kiểu biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM với các đặc điểm giải phẫu bệnh UTBMTBG

Hình 1.1: Sơ đồ hình thành tế bào gốc bình thường

“Nguồn: The European Cancer Stem Cell Research Institue, 2011”

Tự làm mới, là khả năng tự tạo ra các tế bào gốc có tiềm năng tăng sinh vượt

bậc, đặc tính này được xem là khả năng quan trọng nhất của một tế bào gốc Khả năng

tự làm mới giúp cho khoang tế bào gốc mở rộng đáp ứng với các tín hiệu toàn thân hay cục bộ để kích hoạt phát triển và duy trì những tế bào không biệt hoá chuyên biệt cho cơ quan hoặc mô cụ thể nào Cơ chế điều hòa sự tự làm mới của tế bào gốc thông qua các con đường tín hiệu vẫn còn mơ hồ

Biệt hóa là chức năng thứ hai của tế bào gốc, có liên quan đến hệ thống phân

tầng tế bào chuyển các thế hệ tế bào biệt hóa thành tế bào của mô chuyên biệt, thể hiện tiềm năng phát triển của các tế bào tiền thân và tế bào gốc Ở nhiều mô và cơ quan, do tế bào gốc có tuổi thọ lâu nhất nên tích lũy nhiều hơn các đột biến chuyển dạng ban đầu so với tế bào nguyên bản khuếch đại thoáng qua hoặc các tế bào trưởng thành có tuổi thọ ngắn hơn [8],[97]

1.1.2 Tế bào gốc ung thư:

Tế bào gốc ung thư (TBGUT) là những tế bào ung thư sở hữu khả năng tự làm mới và tạo ra những dòng tế bào ung thư không đồng nhất trong u TBGUT có các tính chất của tế bào gốc bình thường, có khả năng tăng sản quá mức, tự làm mới và khả năng biệt hóa thành những tế bào ung thư không sinh u

Hình 1.2: Sơ đồ hình thành tế bào gốc ung thư từ tế bào gốc tạo máu

“Nguồn: Lynch J., 2018” [59]

Ở người, TBGUT đầu tiên được xác định và phân lập là những tế bào biểu hiện với dấu ấn bề mặt CD34, không biểu hiện với CD38 trong bệnh lý bạch cầu cấp dòng tủy (hình 1.2) Đối với u đặc, TBGUT được ghi nhận đầu tiên trong bệnh lý ung thư

vú Gần đây, một số dấu ấn bề mặt TBGUT được xác định, như: CD133 (prominin-1)

là một dấu ấn TBGUT quan trọng của một số u đặc ác tính, như: não, tiền liệt tuyến, buồng trứng, đại trực tràng, xương và phổi; CD44 liên quan đến tế bào gốc sinh u của ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, carcinôm tế bào gai ở đầu, cổ

và ung thư tiền liệt tuyến Vai trò của TBGUT đã được chứng minh trong một số bệnh ung thư nhưng nguồn gốc của TBGUT vẫn còn chưa rõ ràng [43] [83],[108]

1.1.3 Lý thuyết tế bào gốc ung thư

TBGUT sở hữu những đặc tính của tế bào gốc bình thường: (i) tự làm mới, (ii) biệt hóa, (iii) sự hình thành u, (iv) kháng hóa/xạ trị liệu và (v) khả năng tăng sinh tạo ra khối u mới với kiểu hình chuyển dạng có tế bào u khác tế bào ban đầu (hình 1.3)

[96],[104],[113],[116] Như vậy, khi xác định TBGUT trong khối u thì có thể dự đoán được sự di căn, sự tái phát tại chỗ, di căn xa và khả năng kháng hóa trị của tế bào u Ứng dụng những đặc tính độc đáo này vào lâm sàng để hỗ trợ chẩn đoán, dự đoán tiên lượng thông qua phát hiện biểu hiện dấu ấn của những TBGUT, và định hướng phát triển mục

tiêu điều trị là TBGUT [7],[8],[54],[87]

Hình 1.3: Lý thuyết tế bào gốc ung thư

Tế bào tiền thân/ tế bào gốc của gan chuyển dạng là một trong những nguồn gốc TBGUT của gan, được xác định và phân loại bằng cách sử dụng các dấu ấn tế bào tiền thân/ tế bào gốc của gan bình thường, như EpCAM, Lgr5, CD133 và CD24

Quá trình tái tạo trong viêm gan mạn tính do viêm gan siêu vi B (HBV) và/ hoặc viêm gan siêu vi C (HCV); bệnh gan do rượu hoặc bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu) xảy ra sự phân tán tế bào tiền thân/ tế bào gốc của gan, sự tích lũy đột biến di truyền và/ hoặc thay đổi ngoài gen, và sự thay đổi của vi môi trường liên tục sẽ kích

hoạt khởi phát và/ hoặc thúc đẩy ung thư gan Hơn nữa, quá trình này có thể tạo thuận lợi cho sự chuyển dạng tế bào tiền thân/ tế bào gốc của gan thành TBGUT của gan [69]

Hình 1.4: Mô hình sinh ung thư phân tầng và ngẫu nhiên

“Nguồn: Plaks V., 2015" [74]

Như vậy, TBGUT của gan không chỉ có nguồn gốc từ tế bào tiền thân/ tế bào gốc của gan bình thường bị chuyển dạng, mà còn có nguồn gốc từ các loại tế bào khác nhau, cụ thể là các tế bào biệt hóa (như: tế bào gan và tế bào đường mật trưởng thành)

có thể chuyển dạng thành các TBGUT do biến đổi di truyền/ thay đổi ngoài gen trong quá trình tổn thương/ tái tạo của gan Tất cả các tế bào gan được truyền tính trạng tái lập trình để hình thành các TBGUT qua các biến đổi di truyền/ thay đổi ngoài gen TBGUT cũng có thể bắt nguồn từ tế bào gốc không ung thư bằng cách kích hoạt “sự hồi biệt hóa” Các yếu tố chỉnh sửa chất nhiễm sắc CHD1L đã thúc đẩy sự hồi biệt hóa của UTBMTBG và tạo ra các đặc tính giống tế bào gốc trên các tế bào này [31],[109],[114]

Hình 1.5: Mô hình phân tầng sinh ung thư của UTBMTBG

“Nguồn: Sia D., 2017” [86]

Những phát hiện này chứng minh rằng tế bào tiền thân/ tế bào gốc của gan, tế bào gan trưởng thành và tế bào ung thư gan biệt hóa có thể là nguồn gốc TBGUT của gan được hình thành theo thứ tự “sự chuyển dạng”, “sự khởi tạo tế bào” và “sự hồi biệt hóa” (Hình 1.5) [86]

1.1.5 Tế bào gốc ung thư của gan

Ung thư gan thường phát triển trên nền bệnh gan mạn tính, trong đó hiện tượng viêm và sự thoái hóa tế bào gan xảy ra liên tục So với tế bào gốc của các loại u khác, thì tế bào gốc của gan trong bệnh gan mạn tính thường tăng cao hơn đáng kể và khả năng tăng sinh có thể là vô hạn [91]

Tế bào mô đệm kích hoạt điều khiển những đường truyền tín hiệu khác nhau, như Wnt, FG, PDGF, VEGF, TGF-β,… và tạo ra sự tăng sinh TBGUT của gan Những tế bào tiền thân/ tế bào gốc của gan có nguồn gốc từ kênh Hering (còn có tên

là hốc tế bào gốc của gan), tiểu quản mật lót bởi tế bào gan và tế bào đường mật Trong UTBMTBG, những dấu ấn TBGUT của gan bao gồm: phân tử kết dính tế bào biểu mô (EpCAM), CD133, CD90, CD44, CD24, CD13 và OV6, một trong số các

dấu ấn này sẽ làm nổi bật tính năng của TBGUT, đó là tính xâm lấn và tính kháng hóa trị cao [22],[74]

Hình 1.6: Nguồn gốc tế bào gốc của gan

“Nguồn: Xu LB., 2014” [108]

Tùy theo mức độ tổn thương và tái tạo mô gan, có 3 loại tế bào tương ứng: (i)

tế bào gan trưởng thành, là “tế bào gốc đơn năng”, tăng sinh sau khi tái tạo mô gan bình thường và đáp ứng nhanh với tổn thương gan; (ii) các tế bào hình bầu dục, như là các “tế bào gốc lưỡng năng”, được kích hoạt tăng sinh khi tổn thương gan mạn tính và lan rộng hoặc nếu sự tăng sinh tế bào gan bị ức chế; và (iii) các tế bào gốc tủy xương, như là các “tế bào gốc đa năng” của gan, có tiềm năng tăng sinh kéo dài Có hai giả thuyết về nguồn gốc tế bào ung thư của gan còn đang tranh luận: hoặc từ sự trưởng thành tế bào gốc của gan bị kìm hãm hoặc từ sự hồi biệt hóa của tế bào gan trưởng thành (hình 1.6) Nghiên cứu về tế bào gốc của gan trong sự sinh ung thư gan đã bước vào một kỷ nguyên mới của sự tranh luận, sôi nổi và kỳ vọng hơn [22],[31],[71],[74],[83],[86]

1.2 Dấu ấn tế bào gốc ung thư của gan

1.2.1 Cách phát hiện và phân lập tế bào gốc ung thư

Nhiều kỹ thuật và phương pháp phân tích khác nhau thường được dùng để phát hiện và phân lập TBGUT, những phương pháp này được phát triển dựa vào những đặc tính độc đáo của TBGUT Ví dụ, bộc lộ dấu ấn bề mặt TBGUT, định kiểu hình bằng loại trừ Hoechst 33342, những thử nghiệm tạo dòng, khảo sát khả năng tạo khối cầu trôi nổi trên đĩa cấy, hiệu giá hoạt động men aldehyde dehydrogenase (ALDH), phân tích dân số phụ và thử nghiệm kháng trị liệu thường quy để phân biệt TBGUT với tế bào gốc không ung thư dựa vào đặc tính chức năng của chúng [23]

Phương pháp chọn lọc tế bào như tế bào dòng chảy và chọn lọc tế bào hoạt hóa

từ trường phân biệt TBGUT và tế bào gốc không ung thư dựa vào sự khác nhau bề mặt tế bào và phân tử trong tế bào với độ tin cậy cao Tương tự, RT-PCR ghép và RT-PCR ghép định lượng độ nhạy cao là phương pháp phân tử được dùng để phát hiện TBGUT ở bệnh nhân ung thư có độ đặc hiệu mục tiêu cao Ngoài ra, các kỹ thuật như hóa tế bào miễn dịch, miễn dịch huỳnh quang và HMMD được dùng để xác định TBGUT dựa vào mức độ và vị trí biểu hiện của dấu ấn protein Thử nghiệm chức năng tiêu chuẩn vàng để phát hiện và phân lập TBGUT là dị ghép vào động vật giảm miễn dịch

Những phương pháp này có ưu điểm và nhược điểm phụ thuộc vào quy trình của thử nghiệm Tuy nhiên không có phương pháp nào có độ nhạy và độ đặc hiệu nổi trội hơn, vì thế sự kết hợp các phương pháp này giúp cho việc phát hiện và phân lập TBGUT có độ tin cậy cao hơn [103]

Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp nhuộm HMMD bộc lộ các dấu ấn bề mặt TBGUT, như: EpCAM, CD113, CD90, CD44, CD24, CD13, CK19 và OV6, để xác định TBGUT của gan và tăng khả năng phát hiện TBGUT trong UTBMTBG đã có nhiều tác giả tiến hành nghiên cứu kết hợp các dấu ấn bề mặt TBGUT của gan [21],[34]

1.2.2 Một số dấu ấn tế bào gốc ung thư của gan

* Dấu ấn EpCAM

EpCAM là kháng nguyên đầu tiên được xác định bằng kháng thể đơn dòng liên quan đến khối u ở người và cũng là kháng thể đầu tiên được sản xuất để trị ung thư ở người nhắm vào EpCAM là murine mAB-17-1A Cấu trúc của EpCAM là một protein màng loại I gồm khoảng 314 axít amin, chứa hai miền giống như yếu tố tăng trưởng

biểu bì ở miền ngoại bào và 26 axít amin ở miền nội bào (hình 1.7) [100]

Hình 1.7: Cấu trúc phân tử dấu ấn EpCAM

được kích hoạt, trong khi UTBMTBG âm tính với EpCAM sẽ hiển thị các gen có đặc điểm của tế bào gan trưởng thành [18],[21],[88]

Hình 1.8: Biểu hiện EpCAM và mối liên quan với quá trình biệt hoá tế bào gan

“Nguồn: Dollé L., 2015” [18]

Hệ thống phân loại UTBMTBG mới dựa vào kiểu biểu hiện của dấu ấn EpCAM và AFP, gồm 4 nhóm có liên quan đến tiên lượng, trong đó nhóm UTBMTBG dương tính cả hai dấu ấn EpCAM và AFP có tiên lượng xấu nhất UTBMTBG với EpCAM+/AFP+ liên quan đến mức độ biệt hóa của tế bào tiền thân/

tế bào gốc của gan, có kết quả xấu, xâm lấn tĩnh mạch cửa, khả năng di căn cao và biểu hiện gen liên quan đến tế bào gốc, liên quan đến hoạt động của đường dẫn truyền tín hiệu Ngược lại, UTBMTBG với EpCAM-/AFP- hiển thị những đặc điểm của tế bào gan trưởng thành có tiên lượng tốt và biểu hiện gen đi kèm với chức năng của tế bào gan trưởng thành Những tế bào UTBMTBG biểu hiện EpCAM+/AFP+ có đặc điểm TBGUT của gan: khả năng tự làm mới, biệt hóa và tăng khả năng kháng hóa trị đối với doxorubicin và 5-fluorouracil [88],[95],[112],[113]

Đa số những tế bào UTBMTBG dương tính với dấu ấn EpCAM thì cũng dương tính với dấu ấn CD133 Các tế bào có đồng biểu hiện dấu ấn CD133+/EpCAM+ sở hữu nhiều tế bào khởi phát u hơn trong tế bào gan dòng UTBMTBG Huh7, khả năng biệt hóa cao hơn, kháng hóa trị hơn, biểu hiện nổi bật các gen liên quan đến tế bào gốc và tính sinh u mạnh so với các tế bào có kiểu biểu hiện CD133+/EpCAM−, CD133−/EpCAM+ và CD133−/EpCAM− Sự kháng hóa trị cũng như tính gốc của TBGUT của gan dương tính với EpCAM được điều biến bởi biểu hiện bất thường của CHD4, OSM, ATRA, EZH2 Một nhóm các microRNA bao gồm miR-181, miR-155, miR-216a/217 liên quan đến tính gốc của các tế bào UTBMTBG dương tính với EpCAM [16],[21],[115]

Tế bào u dương tính với EpCAM giữ vai trò quan trọng trong sự khởi phát của UTBMTBG và EpCAM có thể là mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn của UTBMTBG Hiện nay, trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng đã có các kháng thể EpCAM để điều trị UTBMTBG dương tính với EpCAM gồm: edrecolomab, adecatumumab, MT110, catumaxomab [44],[70],[91],[100]

* Dấu ấn CK19:

Cytokeratin là dấu ấn tế bào biểu mô điển hình hiện diện trong nhiều tế bào biểu mô ác tính, thể hiện khả năng di căn và tăng mức độ ác tính Cytokeratin 19 (CK19) là dấu ấn thuộc họ cytokeratin, có trong UTBMTBG liên quan đến đường dẫn truyền tín hiệu chuyển dạng biểu mô-trung mô (EMT) và TGFb/Smad CK19 là một dấu ấn của tế bào đường mật, tế bào tiền thân của gan, và nguyên bào gan giai đoạn sớm; biểu hiện trong các tế bào ống mật ở gan bình thường và rải rác ở nhu mô gan trong bệnh lý xơ gan và UTBMTBG [25],[37]

CK19 là một dấu ấn tế bào gốc có mối liên quan chặt chẽ với sự xâm lấn, sự gia tăng kích thước u, giảm khả năng biệt hóa, sự di căn và xâm nhập mạch máu vi thể của UTBMTBG; CK19 là một yếu tố dự báo quan trọng đối với tiên lượng bệnh, khả năng sống còn của bệnh nhân, và sự tái phát u [15],[25],[26],[55] Những tế bào UTBMTBG dương tính với CK19 có biểu hiện protein liên quan đến EMT tăng lên, giữ vai trò chính trong quá trình xâm nhiễm của tế bào u [38],[45] Hơn 90% các tế bào UTBMTBG dương tính với CK19 có đồng biểu hiện ít nhất 1 dấu ấn khác có liên quan tế bào gốc, trong khi các dấu ấn EpCAM, c-kit, và CD133 thường dương tính đơn lẻ [53]

Tế bào ung thư gan dương tính với CK19 có khả năng tăng sinh cao, kháng doxorubicin, 5-fluorouracil và sorafenib trong thực nghiệm [79],[91] Khi nhuộm hóa

mô miễn dịch, UTTBG dương tính với CK19 có thời gian sống còn và thời gian tái phát ngắn hơn đáng kể so với UTTBG âm tính với CK19 [119]

* Dấu ấn CD44

Dấu ấn CD44, là một thụ thể tế bào lymphô, được phát hiện trong nhiều mô bao gồm phôi thai, hệ tạo máu, trung mô và TBGUT Ở người, gen CD44 bao gồm 20

exon và 19 intron, trải qua quá trình ghép, thay thế phức tạp để tạo ra dạng CD44 chuẩn (CD44s) và những CD44 đồng dạng biến thể; có liên quan đến sự tương tác giữa các tế bào và chất ngoại bào (hình 1.9) CD44 là glycoprotein bề mặt tế bào, hoạt động chủ yếu như là một thụ thể đối với axít hyaluronic, là dấu ấn TBGUT của vú, tụy, đại trực tràng và dạ dày CD44 liên quan đến sự kết dính tế bào và biểu hiện của

CD44 có liên quan đến sự xâm nhập và sự di căn của UTBMTBG [58],[94]

Hình 1.9: (A) Sơ đồ cấu trúc gen CD44, (B) cấu trúc protein CD44

“Nguồn: Kim R., 2015” [42]

Biểu hiện của CD44 liên quan đến sự điều biến kiểu hình trung mô qua trung gian bởi TGF-β và mức độ biểu hiện của CD44 là một yếu tố tiên lượng xấu của UTBMTBG CD44 là dấu ấn quan trọng được dùng để kết hợp với những dấu ấn TBGUT khác làm tăng khả năng hiện diện của TBGUT của gan, bằng phương pháp nhuộm với hóa mô miễn dịch có thể xác định dấu ấn này Khi tế bào u dương tính với dấu ấn CD44 kết hợp dương tính với dấu ấn CD133 hoặc dương tính với dấu ấn CD90 thì kiểu hình biểu hiện ác tính nhiều hơn những tế bào u chỉ dương tính hoặc là dấu ấn CD133 hoặc là dấu ấn CD90 [80],[87],[117]

CD44 giữ vai trò không thể thiếu để kích hoạt các con đường sống còn bảo vệ các tế bào ung thư khỏi quá trình chết theo chương trình Vì thế, sử dụng kháng thể kháng CD44 có thể gây ra chết tế bào theo chương trình đối với các tế bào u dương tính với CD44 và âm tính với CD90 tùy vào liều sử dụng, đồng thời ngăn chặn TBGUT có đồng biểu hiện CD90+/CD44 + tạo ra khối u tại chỗ và di căn xa [17],[56] CD44 biểu hiện trội ở tế bào dương tính với CD133 trong 4 dòng tế bào của UTBMTBG, bao gồm: Huh7, SMMC7721, MHCC-LM3 và MHCC97L Trong

UTBMTBG, những tế bào u đồng biểu hiện dấu ấn CD44+/CD133+ có khả năng sinh

u và kháng hóa trị cao hơn những tế bào có kiểu biểu hiện dấu ấn CD44−/CD133+, và biểu hiện những gen kèm “yếu tố gốc” cũng ở mức độ cao hơn Vì vậy, tế bào UTBMTBG dương tính với CD44 có tiên lượng xấu và kháng hóa trị cao hơn tế bào

âm tính với CD44 [7],[21],[80],[89]

* Dấu ấn CD133 (Prominin-1)

CD133, còn được gọi là PROM1, là thành viên của họ prominin, có cấu trúc gồm 5 glycoprotein chuỗi đơn xuyên màng, với trọng lượng phân tử 115-120 kDa, bao gồm một đầu NH3 ở ngoại bào, hai vòng lớn ở ngoại bào, hai vòng nhỏ ở nội bào

và một đầu COOH ở nội bào (hình 1.10)

Hình 1.10: Cấu trúc phân tử dấu ấn CD133

“Nguồn: Behrooz AB., 2019” [12]

Dấu ấn CD133 biểu hiện dương tính chiếm 65% các tế bào ung thư gan dòng Huh7 và tăng sinh, khởi phát u, di căn mạnh hơn nhóm tế bào CD133 âm tính CD133

là dấu ấn của tế bào tiền thân/ TBGUT của gan, biểu hiện dấu ấn CD133 có liên quan chặt chẽ với các đặc điểm giải phẫu bệnh của UTBMTBG, như: mức độ biệt hóa u, giai đoạn tiến triển u, sự xâm lấn mạch máu, huyết khối tĩnh mạch và tỉ lệ sống còn kém [12],[16],[24],[38]

Tỉ lệ kháng hóa trị thông thường (bao gồm doxorubicin và 5-fluorouracil), sự tăng sinh, tính sinh u, sự xâm lấn, sự di cư và sự sinh mạch trong các TBGUT của gan dương tính với CD133 cao hơn âm tính [12],[24],[51]

Chiến lược trị liệu UTBMTBG nhắm mục tiêu các TBGUT dương tính với CD133, bằng nhiều cách khác nhau, như: ức chế đặc hiệu đường dẫn truyền JNK; tạo hiệu ứng chống ung thư thông qua một phức hợp ức chế phiên mã liên kết trực tiếp với chất kích thích CD133 P1 làm hạn chế đặc tính TBGUT của các tế bào UTBMTBG; dùng Axit ursolic chalcone (UAC) làm giảm khả năng tự làm mới và tăng độ nhạy doxorubicin và vincristine để ức chế biểu hiện dấu ấn CD133 dương tính; dùng dẫn xuất của isocorydine (d-ICD) ức chế sự tăng trưởng tế bào UTBMTBG, đặc biệt tế bào dương tính với CD133 [107],[117]

* Dấu ấn CD90 (Thy-1)

CD90 là một glycoprotein 25-37 kDa gắn glycosylphosphatidylinositol- (GPI-)

ở bề mặt tế bào, biểu hiện trên nhiều loại tế bào, bao gồm tế bào T, tế bào tuyến ức, tế bào thần kinh, tế bào nội mô, và các nguyên bào sợi CD90 đóng vai trò quan trọng

trong sự di căn, viêm và xơ hóa [49]

CD90 là một dấu ấn TBGUT trong UTBMTBG; bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy ghi nhận các tế bào u biểu hiện dấu ấn CD45-/CD90+ trong tất cả mẫu khối

u và 90% số mẫu máu từ các bệnh nhân UTBMTBG, ngược lại có biểu hiện rất ít (0%

- 0,05%) trong mô gan bình thường, xơ gan và mô gan không ung thư Biểu hiện dấu

ấn CD90 tăng lên trong quá trình sinh u và tạo các nốt tế bào u, khả năng sinh ung thư

ở tế bào dương tính với CD90 cao hơn tế bào CD90 âm tính, cho nên CD90 có thể được xem là dấu ấn TBGUT của gan [21],[43]

Dấu ấn CD90 có vai trò quan trọng trong sự tiên đoán mức độ biệt hóa, sự tăng sinh, xâm lấn, di cư, di căn và là mục tiêu điều trị tiềm năng đầy hứa hẹn đối với bệnh nhân UTBMTBG [84],[104] Kết quả của các nghiên cứu hiện nay đã xác định CD90

là một dấu ấn sinh học tiềm năng cho chẩn đoán và điều trị trúng đích của UTBMTBG [71],[87],[107]

* Dấu ấn CD24

Dấu ấn CD24 là một glycosylated glycoprotein bề mặt tế bào giống mucin; cấu trúc CD24 gồm một lõi protein nhỏ có 27 axit amin được gắn vào màng tế bào thông qua neo GPI Lõi protein có nhiều vị trí glycosyl hóa để cho các carbohydrate liên kết

O và N gắn vào, tạo ra phân tử có cấu trúc tương tự mucin CD24 có trọng lượng phân

tử thay đổi từ 30-70 kDa, sự thay đổi trọng lượng là do glycosyl hóa liên kết N và O biến đổi trong các mô và tế bào khác nhau [81] CD24 giữ vai trò là một phân tử tín hiệu và làm trung gian truyền tín hiệu bằng cách sử dụng các protein tyrosine kinase (PTKs) của họ Src (hình 1.11)

CD24 là một dấu ấn bề mặt TBGUT của gan; các tế bào UTBMTBG biểu hiện dấu ấn CD24+ có liên quan đến tiên lượng của bệnh nhân và giữ vai trò rất quan trọng trong biệt hóa, tự làm mới, duy trì và di căn của khối u Đa số các tế bào UTBMTBG

có biểu hiện dấu ấn CD24+ thì cũng dương tính với dấu ấn CD133 và dấu ấn EpCAM [21],[73]

Hình 1.11: Cấu trúc phân tử dấu ấn CD24

“Nguồn: Sajid S., 2018” [81]

CD24 là một dấu ấn tế bào khởi phát u (TIC) trong UTBMTBG, có nguồn gốc gen TIC được điều hòa bởi đường truyền tín hiệu NANOG qua trung gian STAT3; đường dẫn truyền tín hiệu Twist2-CD24-STAT3-NANOG rất quan trọng đối với sự điều hòa đặc tính tự làm mới TBGUT của gan dương tính với CD24 và tăng điều hòa CD24 làm cho tế bào UTBMTBG kháng với Cisplastin [65],[107]

* Dấu ấn CD13

Dấu ấn CD13, còn được gọi là aminopeptidase N, là một glycoprotein màng đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của ung thư bao gồm sự tăng sinh tế bào, sự

xâm lấn và sự sinh mạch CD13 là dấu ấn TBGUT bán im lặng trong các dòng tế bào ung thư gan ở người và điều trị nhắm mục tiêu vào các tế bào này có thể thêm một phương pháp điều trị bệnh này [21]

CD13 làm giảm tổn thương DNA do tình trạng thiếu oxy gây ra sau khi điều trị bằng hóa trị/ xạ trị và các tế bào được bảo vệ không bị chết theo chương trình Các nghiên cứu đã chứng minh ubenimex, một chất ức chế CD13, làm giảm khả năng sinh ung và tự tái tạo của TBGUT, ức chế sự phát triển tế bào u dương tính với CD13, có liên quan với tình trạng thiếu oxy trong UTBMTBG TBGUT biểu hiện dương tính dấu ấn CD13 có vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng khối u và sự kháng trị liệu chống ung thư trong UTBMTBG [21],[30],[107]

* Các tế bào dân số phụ (tế bào SP)

Tế bào SP lần đầu tiên được phân lập từ tế bào gốc tạo máu vào năm 1996, sau

đó các tế bào SP được xác định trong các dòng tế bào ung thư khác nhau như: Huh-7, PLC/PRF/5 của UTBMTBG So với các tế bào không phải SP, các tế bào SP thể hiện khả năng tăng sinh cao và ngăn chăn sự chết theo chương trình Các tế bào SP có tiềm năng khởi phát u, tăng điều hòa “gen có tính gốc” Kiểu hình SP được xác định bằng biểu hiện gen BCRP1/ABCG2; ở các tế bào hình bầu dục của gan mang một số đặc điểm của tế bào gốc, có kiểu hình SP Kiểu biểu hiện của mức độ mRNA ABCG2/BCRP1 tương quan rõ với số lượng tế bào hình bầu dục Do đó, các tế bào

SP được xem như một dấu ấn TBGUT [21],[63],[91]

* ADLH

ALDH là một dấu ấn chức năng khác của TBGUT Trước khi ALDH được sử dụng như một dấu ấn xác định các TBGUT thì ALDH đã xác định vai trò kháng hóa trị Có 17 đồng phân của ALDH trong cơ thể con người được phân tích trong các TBGUT Khi phân tích biểu hiện của một số đồng phân ALDH khác nhau và hoạt tính enzyme ALDH trong các dòng tế bào gan đã ghi nhận ALDH có tương quan thuận với biểu hiện dấu ấn CD133 bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy màu-kép, đa số tế bào UTBMTBG dương tính với ALDH thì dương tính dấu ấn CD133, nhưng ngược lại không phải tất cả tế bào UTBMTBG có dấu ấn CD133 dương tính thì ALDH dương tính Tế bào đồng biểu hiện CD133+/ALDH+ có tính sinh u cao hơn nhiều so

với các tế bào biểu hiện CD133−/ALDH+ hoặc đồng biểu hiện CD133−/ALDH− Vì thế, khi nhuộm kết hợp 2 dấu ấn ALDH và CD133 có thể bộc lộ rõ hơn tính sinh u của dân số TBGUT của gan [21],[65],[107]

* OV6

Dấu ấn OV6 là dấu ấn của các tế bào hình bầu dục và là dấu ấn TBGUT của gan Tế bào UTBMTBG biểu hiện dấu ấn OV6 dương tính có khả năng sinh u và kháng với hóa trị liệu chuẩn cao hơn các tế bào biểu hiện dấu ấn OV6 âm tính Khi kích hoạt đường dẫn truyền tín hiệu Wnt có thể làm tăng các tế bào biểu hiện dấu ấn OV6+, và ức chế đường dẫn truyền tín hiệu β-catenin làm giảm theo tỉ lệ của các tế bào OV6 Tế bào UTBMTBG dương tính với OV6 không chỉ có khả năng sinh u mà còn thể hiện tiềm năng xâm lấn và di căn Đường dẫn truyền tín hiệu Wnt/β-catenin đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt và tăng sinh quần thể tế bào biểu hiện dấu

ấn OV6+ trong các khối u [21],[104]

* DLK1 (Delta-like 1 homolog)

DLK1 biểu hiện trong gan của thai nhi, không biểu hiện ở gan sơ sinh và trưởng thành Trong tất cả 17 dòng tế bào UTBMTBG đều có các tế bào biểu hiện DLK1 dương tính và làm tăng khả năng sinh u Các tế bào UTBMTBG biểu hiện DLK1+ tăng tính kháng hóa trị liệu thông thường, như doxorubicin, cisplatin, epirubicin và 5-FU Sự can thiệp RNA qua trung gian Adenovirus chống lại DLK1 làm giảm khả năng gây ung thư Các tính năng này của các tế bào UTBMTBG biểu hiện DLK1+ phù hợp với các đặc điểm đã biết của TBGUT và biểu hiện DLK1+ có thể sử dụng để xác định các TBGUT của gan [21],[65],[107]

1.2.3 Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc ung thư

Ứng dụng đầu tiên của TBGUT là chẩn đoán ung thư giai đoạn sớm thông qua một số phương pháp phát hiện và phân lập TBGUT như: bộc lộ dấu ấn bề mặt tế bào gốc ung thư, định kiểu hình bằng loại trừ Hoechst 33342, những thử nghiệm tạo dòng, khảo sát khả năng tạo khối cầu trôi nổi trên đĩa cấy, hiệu giá hoạt động men aldehyde dehydrogenase (ALDH), phân tích dân số phụ, xây dựng mô hình động vật mang khối

u dị ghép phục vụ nghiên cứu các liệu pháp kháng ung thư Các nhà khoa học tin rằng,

việc khám phá ra TBGUT sẽ mang lại hy vọng cho các bệnh nhân ung thư [93],[103],[116]

Dựa vào đặc tính kháng trị liệu với phác đồ thông thường của TBGUT, giúp cho các nhà lâm sàng có thể tiên đoán được tình trạng kháng hóa/ xạ trị và lựa chọn phương pháp trị liệu thích hợp [38],[89],[111]

Xây dựng chiến lược điều trị trúng đích TBGUT thông qua các protein có liên quan đến chuyển hóa và truyền tín hiệu của TBGUT; ngăn chặn hoạt động của các protein có liên quan đến những con đường truyền tín hiệu của TBGUT Ngoài ra, người ta còn sử dụng các kháng thể đơn dòng, liên kết hoá học để tiêu diệt các TBGUT, phương pháp này là cách trị liệu “trúng đích” của khối u [72],[79],[110]

TBGUT còn giữ vai trò quan trọng trong việc sản xuất các vaccine chống ung thư Nguyên tắc cơ bản dựa trên tế bào gốc là tạo ra một vector adenoviral có chứa kháng nguyên của các TBGUT mục tiêu, chuyển vector này vào động vật nghiên cứu

sẽ thu được vaccine chống ung thư [34],[113]

1.3 Tình hình nghiên cứu về các dấu ấn EpCAM, CK19, CD44

Trên thế giới, có khá nhiều nghiên cứu đánh giá sự biểu hiện của EpCAM, CK19, CD44 bằng phương pháp HMMD trên mẫu mô UTBMTBG được công bố

Tỉ lệ biểu hiện EpCAM trong UTBMTBG có sự khác nhau khá lớn giữa các nghiên cứu Năm 2011, tác giả Kim đã nghiên cứu trên 137 mẫu UTBMTBG ghi nhận

tỉ lệ biểu hiện EpCAM là 35% [40]; Govaere nghiên cứu vào năm 2013, trên 167 mẫu UTBMTBG có tỉ lệ biểu hiện là 14,97% [26]; nghiên cứu của Matthai năm 2015 cho kết quả tỉ lệ biểu hiện EpCAM trên 49 mẫu u UTBMTBG được phẫu thuật là 32,7% [63], trong khi kết quả báo cáo của Sung và các cộng sự năm 2015 trên 82 mẫu UTBMTBG có tỉ lệ biểu hiện EpCAM đến 56% [93]; năm 2016, Kumagai và các cộng sự nghiên cứu trên 94 mẫu UTBMTBG cho thấy tỉ lệ biểu hiện của EpCAM chỉ

là 8,5% [45]; năm 2018, Noh và cộng sự nghiên cứu xác định EpCAM là dấu ấn tiên lượng của 262 trường hợp UTBMTBG đã phẫu thuật ghi nhận tỉ lệ biểu hiện của EpCAM là 46,9% [70]

Biểu hiện của CK19 trong UTBMTBG cũng có sự khác nhau đáng kể giữa các nghiên cứu Năm 2013, Govaere xác định tỉ lệ biểu hiện CK19 trên 167 bệnh nhân UTBMTBG là 11,38%, đồng biểu hiện với EpCAM là 6,58% [26] Nghiên cứu của Matthai vào năm 2015 cho kết quả tỉ lệ biểu hiện CK19 trên 49 mẫu u UTBMTBG được phẫu thuật là 24,5% [63]; trong khi đó, kết quả nghiên cứu của Sung năm 2015 trên 82 mẫu UTBMTBG là khá thấp, chỉ là 6% [93] Kumagai và các cộng sự báo cáo vào năm 2016 tỉ lệ biểu hiện của CK19 là 19,1% [45] Masato và cộng sự đã công bố nghiên cứu trên 136 mẫu UTBMTBG có tỉ lệ biểu hiện của CK19 chỉ là 8,8% cũng vào năm 2016 [62]

Đã có nhiều nghiên cứu về mối liên quan của biểu hiện dấu ấn CD44 dạng tiêu chuẩn (CD44s) và các đồng dạng biến thể (CD44v) với độ mô học, đặc điểm giải phẫu bệnh-lâm sàng và thời gian sống còn trong UTBMTBG Năm 2012, tác giả Mima ghi nhận mức độ biểu hiện của CD44v6 có liên quan đến sự xâm nhập của UTBMTBG trong thí nghiệm nhưng không xuất hiện trên lâm sàng [66] Nghiên cứu của Kim và các cộng sự vào năm 2015 trên 13 mẫu UTBMTBG so sánh với 13 mẫu ung thư tế bào gan-ống mật cho thấy CD44 không biểu hiện trên UTBMTBG [42] Về tỉ lệ biểu hiện của CD44, năm 2010 nghiên cứu của Lingala và các cộng sự trên 25 mẫu UTBMTBG cho thấy tỉ lệ biểu hiện của CD44 là 60% [53] Trong nghiên cứu phân tích meta của Luo và cộng sự đã ghi nhận tỉ lệ biểu hiện của CD44 dao động 30-70% [58] Năm 2016, Thapa đã xác định vai trò quan trọng của CD44 như là dấu ấn tế bào gốc và là mục tiêu điều trị trúng đích trong UTBMTBG [94]; Tác giả Luo khẳng định giá trị tiên lượng của biểu hiện CD44 [58]; tác giả Kakehashi ghi nhận CD44v9 là dấu

ấn tiềm năng của tế bào khởi phát u dự đoán kết quả điều trị phẫu thuật của bệnh nhân UTBMTBG kèm viêm gan siêu vi C [36]

1.4 Tình hình ung thư gan

Theo GLOBOCAN năm 2020, ung thư gan là loại ung thư được chẩn đoán phổ biến đứng hàng thứ 6 và là nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ 4 do ung thư trên thế giới; có khoảng 841.000 trường hợp mắc mới và 782.000 trường hợp tử vong; chủ yếu

ở các nước kém phát triển Tỉ lệ mắc mới và tử vong do ung thư gan ở nam giới cao gấp 2 đến 3 lần so với nữ giới, đứng thứ năm về tỉ lệ mắc mới và thứ hai về tử vong ở

13 quốc gia khu vực Bắc Phi, Tây Phi (Ai Cập, Gambia, Guinea), khu vực Đông Á và Đông Nam Á (Mông Cổ, Campuchia và Việt Nam) [9][14],[64],[92],[118]

Ở Việt Nam, tần suất mắc mới ung thư gan đứng hàng thứ 1, có 25.335 trường hợp mắc mới, chiếm 15,4%; và ung thư gan cũng là nguyên nhân đứng hàng đầu gây

tử vong do ung thư, có 25.404 trường hợp, chiếm 22,1% Ở nam giới, ung thư gan đứng hàng thứ 1 (19.568 trường hợp, chiếm 21,5% tất cả các trường hợp ung thư ở nam giới); ở nữ giới, ung thư gan đứng hàng thứ 5 (5.767 trường hợp, chiếm 7,8% tất

cả các trường hợp ung thư ở nữ giới) [14],[85]

Trong ung thư gan nguyên phát có hai loại chính là UTBMTBG (90%) và ung thư biểu mô tế bào đường mật (10%), ngoài ra cũng có loại ung thư biểu mô kết hợp

tế bào gan và tế bào đường mật Khoảng 70-90% UTBMTBG phát triển từ bệnh lý gan mạn tính hoặc viêm gan mạn tính và xơ gan Xơ gan được xem là nguyên nhân dẫn đến UTBMTBG và yếu tố nguy cơ phát triển thành UTBMTBG của xơ gan đã được báo cáo, có từ 3-8% trường hợp xơ gan có liên quan đến viêm gan siêu vi B và 1-7% có liên quan đến viêm gan siêu vi C Ngoài ra các yếu tố nguy cơ khác có liên quan đến ung thư tế bào gan là tình trạng uống nhiều rượu, béo phì, đái tháo đường týp 2, hút thuốc lá, nhiễm nấm… [2],[5],[61],[99] Một ghi nhận đáng lưu ý của Marilena và cộng sự là có bằng chứng cà phê không chỉ làm giảm tần suất mắc bệnh ung thư gan mà còn giảm tỉ lệ tử vong đi kèm bệnh lý gan mạn tính (mặc dù liều dùng chưa được xác định rõ) [60]

UTBMTBG cũng không thống nhất trong thuật ngữ biểu hiện sinh học và sự đáp ứng với điều trị của chúng, ví dụ: khi so sánh mô UTBMTBG không có tái phát với mô UTBMTBG có khả năng di căn hoặc tái phát ghi nhận kiểu biểu hiện gen khác nhau một cách đặc hiệu Kết hợp phân tích gen và sự chuyển dạng đã xác định 6 phân nhóm chính của UTBMTBG có sự khác biệt về sinh học và ý nghĩa điều trị [1],[6],[19],[33],[113] Những nghiên cứu gần đây dựa vào kiểu gen và đường dẫn truyền tín hiệu đã chứng minh có sự khác nhau về mặt sinh học giữa UTBMTBG biểu hiện microRNA-26 ở mức độ thấp với UTBMTBG biểu hiện microRNA-26 ở mức độ cao Hơn nữa, bệnh nhân UTBMTBG có biểu hiện của microRNA-26 ở mức độ thấp thì đáp ứng tốt với trị liệu hỗ trợ bằng interferon alpha (IFNα) Các tác giả cũng tìm

thấy một phân nhóm của UTBMTBG có kiểu gen liên quan tế bào gốc và biểu hiện của những đặc tính của tế bào gốc ung thư [50],[67],[90],[102]

1.5 Bệnh học ung thư biểu mô tế bào gan

Hầu hết các trường hợp UTBMTBG tiến triển thường làm gan to (3000 gam),

có mật độ mềm hơn mô gan xung quanh, ngoại trừ loại UTBMTBG dạng sợi mảnh hay loại xơ hóa có mật độ chắc hoặc có thể cứng; u thường có những vùng hoại tử; màu sắc thay đổi từ xanh lá đến vàng hoặc nâu nhạt tùy thuộc vào tình trạng nhiễm

mỡ và tiết mật của u (hình 1.12-A) [2],[5]

(A) Đại thể dạng nốt lan rộng,

mặt cắt phồng, màu mật nhạt,

rải rác nốt xuất huyết

(B) Vi thể dạng tế bào gan kinh điển, bào tương ái toan, biến đổi nhân ít, cấu trúc dạng bè

Hình 1.12: UTBMTBG kinh điển

“Nguồn: Kim H., 2020” [41]

UTBMTBG kinh điển gồm tế bào u biệt hóa tương tự tế bào gan kinh điển, nhưng tế bào tăng sinh và không điển hình từ ít đến rõ ràng; u mất cấu trúc khoảng cửa và giảm khung sợi reticulin; tăng sinh tiểu động mạch bất thường trong nhu mô và mao mạch dạng xoang (hình 1.12-B)

UTBMTBG trên nền gan bị xơ thường có vỏ bao (giả) là mô sợi viêm xơ, các khối u trên nền gan không bị xơ gan thường không có vỏ bao U không có hiện tượng

xơ hóa (ngoại trừ loại sợi mảnh) thường hiện diện những vách sợi như trong u tăng sản nốt khu trú Kích thước u và tình trạng khối u có bị vỡ hay có liên quan đến giai đoạn bệnh và tiên lượng của UTBMTBG Bệnh nhân UTBMTBG có một khối u ít tái

phát và có tiên lượng tốt hơn các bệnh nhân có nhiều khối u vì có khả năng cắt bỏ u triệt để [35],[60],[98]

Hiện nay với sự tiến bộ của các phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử đã được ứng dụng vào phân tích sâu hơn nguồn gốc tế bào, phân tử của UTTBMTBG vì thế việc phân chia các cấu trúc đại thể, vi thể cũng có nhiểu điểm mới [102], ngay cả các biến thể của UTBMTBG cũng được nghiên cứu sâu hơn về RNA, gen như nghiên cứu của Faber năm 2017 phân tích RNA không mã hóa trong UTBMTBG dạng sợi mảnh [20] Tuy nhiên, để thống nhất trong việc thu thập dữ liệu, số liệu theo mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi tham khảo bảng phân loại về ung thư gan nguyên phát của Hiệp hội ung thư gan Hàn Quốc năm 2017 và phân loại UTBMTBG theo phân loại u đường

tiêu hóa của TCYTTG năm 2019

1.5.1 Đại thể UTBMTBG

Trước đây hai thập kỷ, sự hình thành và tiến triển từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối của UTBMTBG chưa rõ xảy ra như thế nào, chính những tiến bộ gần đây của kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh đã chẩn đoán UTBMTBG ở giai đoạn sớm, kích thước u còn nhỏ; đặc biệt là số lượng mẫu sinh thiết u gan tăng lên đã ghi nhận nhiều dạng UTBMTBG phát sinh từ các tổn thương dạng nốt có giới hạn không rõ ràng, như: các nốt loạn sản ở gan bị xơ gan và biệt hóa cao ở giai đoạn sớm, đồng thời cũng ghi nhận những trường hợp UTBMTBG biệt hóa tốt ở giai đoạn đầu tiến triển thành những u phát triển và hồi biệt hóa [82]

Hiện nay, có nhiểu cách phân loại đại thể khác nhau tùy theo mục đích nghiên cứu hay giảng dạy Theo bảng phân loại về ung thư gan nguyên phát của Hiệp hội ung thư gan Hàn Quốc năm 2017 [48] và tham khảo bổ sung thêm một số chi tiết theo phân loại u đường tiêu hóa của TCYTTG năm 2019 [98], đại thể của UTBMTBG gồm những cấu trúc đại thể, như:

- Dạng “nốt mơ hồ” là một nốt sần giới hạn không rõ ràng, thường gặp trong UTBMTBG giai đoạn đầu (hình 1.15-A)

- Dạng “nốt lan rộng” là một nốt hình tròn có giới hạn rõ, xu hướng xâm lấn vỏ bao ra mô lân cận (hình 1.15-B)

- Dạng “nhiều nốt” gồm tập hợp các nốt nhỏ Dạng này, các nốt u tách biệt rõ ràng với nhau, khác với dạng một nốt kèm nhiều nốt u vệ tinh hoặc dạng lan tỏa (hình 1.15-C)

- Dạng “nốt kèm nhiều nốt vệ tinh” gồm một nốt tương tự như dạng nốt lan rộng kèm thêm các nốt vệ tinh, chiếm dưới 50% chu vi khối u (hình 1.15-D)

- Dạng “lan tỏa” là dạng thâm nhiễm nhiều nốt nhỏ, (từ hàng chục đến hàng trăm) kích thước và hình dạng gần giống như các nốt tái tạo xơ gan, rải rác ở một thùy gan hoặc khắp toàn bộ gan (hình 1.15-E)

Hình 1.13: Dạng đại thể của UTBMTBG

(A) Dạng nốt mơ hồ (B) Dạng nốt lan rộng (C) Dạng nhiều nốt

(D) Dạng nốt kèm nhiều nốt vệ tinh (E) Dạng lan tỏa

“Nguồn: Lee Y., 2018” [48]

Trong một số trường hợp UTBMTBG có thể từ một nốt lan rộng hoặc dạng nốt trong nốt với một nốt UTBMTBG biệt hóa tốt ở bên ngoài [98]

Ngoài ra, TCYTTG và nhóm đồng thuận quốc tế về UTBMTBG chia

UTBMTBG giai đoạn sớm thành 2 nhóm: (1) UTBMTBG sớm (biệt hóa tốt, kích

thước <2 cm và dạng nốt giới hạn không rõ ràng – ranh giới khó xác định với mô gan

xung quanh) và (2) UTBMTBG nhỏ tiến triển (kích thước <2 cm, nhưng biệt hóa vừa,

dạng nốt rõ ràng – có vỏ bao rõ) [13],[60],[82]

Một dạng hiếm gặp khác là UTBMTBG phát triển có cuống hoặc lồi ra ngoài

bề mặt gan, nếu phát triển ra ngoài bề mặt gan có cuống thì gọi là UTBMTBG có cuống, nếu không có cuống thì dùng thuật ngữ UTBMTBG “lồi ra” (hình 1.15-D),

UTBMTBG dạng này hầu hết có tiên lượng tốt, nhưng cũng có một số ít có tiên lượng xấu hơn [48],[60],[82]

Một số tác giả khác phân loại UTBMTBG theo 2 loại chính: UTBMTBG

“trong vỏ bao” (giai đoạn ung thư sớm) và UTBMTBG giai đoạn tiến xa (đã phá vỡ

vỏ bao) UTBMTBG “trong vỏ bao” là một dấu hiệu tiên lượng tốt, thường hình thành trên nền xơ gan, đơn độc, hầu hết được phát hiện qua tầm soát và phát triển chậm; dạng này thường ở giai đoạn đầu của ung thư và có thể cắt bỏ hoàn toàn khối u [3],[19]

1.5.2 Vi thể UTBMTBG

Theo phân loại u đường tiêu hóa của TCYTTG phiên bản thứ năm, xuất bản năm 2019 [98], UTBMTBG có 04 cấu trúc mô học chủ yếu: dạng bè (hình 1.14-A), dạng đặc (hình 1.14B), dạng giả tuyến (hình 1.14-C) và dạng bè to, >10 lớp tế bào (hình 1.4-D)

Khoảng 50% UTBMTBG có cấu trúc hỗn hợp, thường gồm cấu trúc dạng bè

và 1 hoặc 2 cấu trúc khác Cấu trúc dạng bè to có tiên lượng xấu, tuy nhiên không có mối liên quan giữa các yếu tố lâm sàng với cấu trúc mô học Bất kỳ cấu trúc mô học nào trong 04 cấu trúc này đều có thể hiện diện trong các UTBMTBG biến thể đặc hiệu

Ngoài 04 dạng cấu trúc mô học thường gặp của UTBMTBG nêu trên, theo phân loại của TCYTTG năm 2019 [98] còn ghi nhận các dạng cấu trúc biến thể sau:

(1) Dạng viêm gan nhiễm mỡ (hình 1.15-A), chiếm 5-20% UTBMTBG, có tình

trạng viêm gan nhiễm mỡ chiếm hơn 5% khối u, gồm: các thể Mallory-Denk, viêm và

xơ hóa quanh tế bào, tế bào gan dạng bong bóng, có liên quan đến hội chứng chuyển hóa hoặc bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD), ngay cả ở gan không bị xơ

gan Tiên lượng của UTBMTBG dạng viêm gan nhiễm mỡ tương tự như UTBMTBG dạng kinh điển

(A) Cấu trúc dạng bè (B) Cấu trúc dạng đặc

(C) Cấu trúc dạng giả tuyến (D) Cấu trúc dạng bè to

Hình 1.14: Cấu trúc của UTBMTBG

“Nguồn: Rastogi A.,2018” [75]

(2) Dạng sợi mảnh (phiến sợi) chiếm 1% UTBMTBG, thường gặp ở tuổi trẻ,

nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ chưa rõ, tiên lượng như các UTBMTBG khác ở người không xơ gan, tốt hơn UTBMTBG kinh điển (hình 1.15-B) U gồm sự hóa sợi từng mảnh, các tế bào đa giác lớn nhiều bào tương, ái toan (giàu ty thể và dạng phồng bào), nhân bọng lớn và hạt nhân to Ngoài ra, có canxi hóa ở mô đệm hoặc ở các chất tiết trong lòng cấu trúc giả tuyến; có thể có các thể mờ và/ hoặc thể hyaline như trong UTBMTBG dạng kinh điển

(3) Dạng xơ hóa chiếm 4% UTBMTBG, điển hình là sự hóa sợi theo các

khoảng mạch dạng xoang, chiếm hơn một nửa khối u kèm các ổ nhỏ tế bào u (hình 1.15-C), có thể sau nút mạch bằng hóa chất (TACE), hóa trị hoặc xạ trị Nhuộm kết

hợp Glypican-3 (GPC-3) và Arginase-1 (độ nhạy 100%) chẩn đoán phân biệt với ung thư biểu mô đường mật UTBMTBG dạng xơ hóa có tiên lượng tốt, cho dù có một số tác giả chưa đồng thuận

(A) dạng viêm gan nhiễm mỡ: tế bào gan dạng

bong bóng trên mô gan nhiễm mỡ

(B) dạng sợi mảnh: tế bào u đa giác (),

bào tương ái toan, nhân tròn, hạt nhân rõ (dạng phồng bào), xếp song song bởi vách sợi dày (►)

(C) dạng xơ hóa: đám tế bào u (T) bị ngăn

cách bởi mô đệm sợi xơ hóa dày đặc

(D) dạng giàu tế bào lymphô: đám tế bào u (T) rải rác do thấm nhập nhiều tế bào lympho ()

Hình 1.15: Biến thể cấu trúc của UTBMTBG

“Nguồn: Schlanger M., 2014, Kim H., 2020” [41],[82]

(4) Dạng giàu tế bào lymphô là loại UTBMTBG ít gặp (<1%), đặc trưng là sự

thâm nhiễm đa số là tế bào lympho (dương tính với CD3, CD4), có một ít tế bào u

kích thước nhỏ, đa dạng với sự tăng trưởng hợp bào khu trú, do hiếm gặp nên có rất ít thông tin về đặc điểm lâm sàng, mô học và tiên lượng (hình 1.15-D)

(5) Dạng giàu bạch cầu trung tính là loại UTBMTBG ít gặp (<1%), nhiều bạch

cầu đa nhân trung tính tràn lan trong mô u, có thể có những vùng dạng sarcôm

(6) Dạng kỵ sắc, tế bào u hầu hết có bào tương sáng (kỵ sắc), chủ yếu nhân mịn

nhưng cũng có những vùng với nhân biến đổi nổi bật, chiếm 3% UTBMTBG

Biến thể của UTBMTBG với những biến thể tế bào đặc trưng bao gồm tiết mật (hình 1.16-E), ứ đọng lipofuscin, tích tụ glycogen làm tế bào sáng (hình 1.16-A), tế bào biến đổi mỡ (hình 1.16-B) Tế bào u có thể chứa thể vùi: thể hyaline, thể Malorry- Denk (hình 1.16-C), thể mờ (hình 1.16-D) Thể mờ thường thấy (nhưng không phải là đặc hiệu) trong UTBMTBG dạng sợi mảnh Những thay đổi của xoang mạch trong u gồm những vùng như những nốt mụn và tụ nhóm nhỏ các đại thực bào Ngoài ra còn

có UTBMTBG đa dạng tế bào với nhiều tế bào khổng lồ nổi bật (hình 1.16-F) Đôi khi UTBMTBG có 02 hoặc nhiều dạng khác nhau về cấu trúc, biến thể hình thái, và/ hoặc độ biệt hóa Hầu hết các dạng này hiện diện trong UTBMTBG tiến triển với nốt

tế bào u biệt hóa kém hơn tồn tại trong UTBMTBG – cấu trúc này được gọi là

UTBMTBG dạng nốt trong nốt [98]

Có khoảng 35% được phân chia thành phân nhóm khác nhau tương ứng với các thực thể giải phẫu bệnh lâm sàng và phân tử khác nhau [102] Tất cả các phân nhóm này đều được mô tả trên mô gan xơ hoặc không xơ, trừ UTBMTBG dạng sợi mảnh trên mô gan không xơ

Cấu trúc mô học khác nhau và các biến thể tế bào thường thay đổi, xảy ra trên cùng một bệnh nhân tùy thuộc vào các giai đoạn biệt hóa khác nhau Nhuộm hóa mô miễn dịch, có khoảng 90% các UTBMTBG dương tính với HepPar1 (dương tính bào tương với các kháng thể đối với carbamoyl phosphate synthetase-1) [10],[60]

(A) Tế bào sáng (B) Tế bào biến đổi mỡ

(C) Thể hyaline Mallory-Denk () (D) Thể mờ ()

(E) Tế bào u tiết mật (►) (F) Đa dạng tế bào với tế bào khổng lồ (►)

Hình 1.16: UTBMTBG với biến thể tế bào

“Nguồn: Mounaijed T., 2015, Schlanger M., 2014” [68],[82]

* Độ biệt hóa:

Có nhiều hệ thống phân loại theo độ biệt hóa khác nhau dựa vào đặc điểm mô học của UTBMTBG nhằm xác định mối liên quan giữa lâm sàng và tình trạng sống còn của bệnh nhân Edmondson và Steiner đã chia UTBMTBG thành 4 độ biệt hoá dựa vào mức độ biệt hoá kém dần của tế bào u: tăng dần tỉ lệ nhân/bào tương, nhân tăng sắc, dị dạng và mất cấu trúc bè tế bào gan từ độ biệt hoá thấp đến cao [2],[5] Do trong cùng một u có thể gặp các vùng biệt hoá khác nhau cho nên không có sự tương quan rõ ràng với tiên lượng bệnh nhân Tuy nhiên hệ thống phân loại này vậy vẫn được một số Trung tâm y khoa tại Mỹ sử dụng có hiệu chỉnh so với ban đầu [68] Một

hệ thống phân loại khác chia thành 3 mức độ: biệt hoá tốt (kết hợp độ 1 và độ 2 của hệ thống phân độ Edmondson-Steiner), biệt hoá vừa (tương đương độ 3 của hệ thống phân độ Edmondson-Steiner), biệt hoá kém (tương đương độ 4 của hệ thống phân độ Edmondson-Steiner và tổn thương thoái sản) [61]

(C) Biệt hóa kém

Hình 1.17: Độ biệt hóa của UTBMTBG

“Nguồn: Mounaijed T., 2015” [68]

Tại Việt Nam chủ yếu sử dụng bảng phân loại u đường tiêu hóa của TCYTTG (2019) với các tiêu chuẩn và thuật ngữ thống nhất cho các mức độ biệt hóa của UTBMTBG [98] Trong đó xác định mức độ biệt hóa UTBMTBG dựa vào tiêu bản nhuộm H&E so sánh với hình thái tế bào gan trưởng thành lành tính, gồm 3 mức độ: biệt hóa tốt, biệt hóa vừa và biệt hóa kém

- Biệt hoá tốt: thường gặp ở giai đoạn sớm, kích thước u nhỏ hơn 2 cm Tế bào

u tương tự tế bào gan bình thường, kích thước tế bào và nhân ít thay đổi, tỉ lệ nhân/bào tương tăng, hạt nhân có thể không rõ (hình 1.17-A) Các tế bào u thường xếp thành dạng bè nhỏ, đôi khi dạng giả tuyến hay thoái hóa mỡ Đối với những khối u có kích thước lớn hơn 3 cm, tế bào u biệt hóa tốt chỉ nằm ở vùng ngoại vi của khối u

- Biệt hoá vừa: thường gặp u có kích thước lớn hơn 3 cm Tế bào u dị dạng hơn

loại biệt hoá tốt nhưng không quá dị dạng như loại biệt hoá kém, tế bào u có bào tương nhiều, bắt màu hồng, nhân tròn, hạt nhân rõ (hình 1.17-B) Cấu trúc dạng bè (>

3 lớp tế bào), đôi khi dạng giả tuyến chứa dịch mật hay dịch protein

- Biệt hoá kém: tế bào u đa dạng, nhân quái dị dạng rõ, tăng sắc, nhiều phân

bào bất thường, các tế bào u tăng sinh dạng đặc xen lẫn với những vùng mô hoại tử (hình 1.17-C) Loại này rất hiếm khi thấy ở các u nhỏ, giai đoạn đầu ung thư

Một số UTBMTBG có nhiều hơn 1 độ biệt hóa, trong trường hợp này sẽ ghi nhận độ biệt hóa kém nhất (nếu chiếm số lượng ít) hoặc độ biệt hóa chiếm ưu thế hơn

vì có liên quan đến tiên lượng

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu cắt ngang mô tả

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân đã được phẫu thuật với chẩn đoán UTBMTBG từ năm 2010 đến

2012, được lưu tiêu bản, khối vùi nến tại Bộ môn Mô phôi-Giải phẫu bệnh, Đại Học

Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu từ tháng 10/2014 đến tháng 10/2017

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Thu thập dữ liệu: giới tính, năm sinh, tình trạng nhiễm siêu vi B, C theo danh sách bệnh nhân được phẫu thuật và theo dõi tái khám tại Bệnh viện Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh

+ Thu thập dữ liệu: kích thước u, số lượng u, chẩn đoán giải phẫu bệnh,… từ

mô tả của bác sĩ giải phẫu bệnh ghi nhận khi cắt lọc được ghi trên phiếu xét nghiệm Giải phẫu bệnh và tiêu bản được lưu trữ tại Bộ môn Mô phôi-Giải phẫu bệnh, Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

+ Nhuộm HMMD các dấu ấn CK19, CD44 và EpCAM trong nghiên cứu này được thực hiện tại Bộ môn Mô phôi-Giải phẫu bệnh, Đại Học Y Dược Thành phố

Hồ Chí Minh

+ Đọc kiểm tra và đánh giá kết quả nhuộm HMMD cùng Giảng viên hướng dẫn tại Bộ môn Mô phôi-Giải phẫu bệnh, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh

2.4 Cỡ mẫu của nghiên cứu

Cỡ mẫu nghiên cứu được tính theo công thức tính dành cho nghiên cứu mô

tả cắt ngang:

Trong đó:

- Z1-α/2: phân vị của phân phối chuẩn bình thường

- Z1-α/2 = 1,96 tương ứng với mức độ tin cậy của ước lượng là 95% thì α = 0,05

- p: tỉ lệ ước đoán tham số chưa biết của quần thể nghiên cứu Ở đây p là tỉ lệ biểu hiện của các dấu ấn CK19, CD44 và EpCAM trên bệnh nhân UTBMTBG trong các nghiên cứu trước

Tỉ lệ biểu hiện của dấu ấn EpCAM thay đổi khác nhau tuỳ theo các nghiên cứu từ 14,97% đến 56% [26],[40],[70],[93]; tỉ lệ biểu hiện của dấu ấn CK19 cũng thay đổi tùy theo nghiên cứu từ 11-30% [11],[15],[26],[37],[45],[47],[105]; tỉ lệ biểu hiện của dấu ấn CD44 cũng thay đổi từ 30,7 đến 72,3% [36],[58],[66],[80] Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn tìm hiểu về biểu hiện của các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM bằng phương pháp hóa mô miễn dịch trên UTBMTBG, nên chúng tôi chọn tỉ lệ biểu hiện của dấu ấn EpCAM là p1= 56%; tỉ lệ biểu hiện của dấu ấn CK19 là p2=30%; và tỉ lệ biểu hiện của dấu ấn CD44 là p3=70%

- d: mức sai số tuyệt đối chấp nhận

Trong nghiên cứu này dựa theo các tiêu chuẩn chọn mẫu phải đạt yêu cầu của phương pháp nhuộm HMMD mới đưa vào lô nghiên cứu và dựa vào gợi ý cách tính d dựa trên giá trị p [4], như sau:

+ p< 0,1  d= p/2

+ p= 0,1-0,3d= 0,05

+ p= 0,3-0,7d= 0,1

+ p= 0,7-0,9d= 0,05 + p> 0.9 d= (1-p)/2

Chọn tỉ lệ p của các dấu ấn EpCAM, CK19, CD44 lần lượt là 56%, 30%, 70%; nằm trong khoảng p= 30-70% (0,3-0,7) nên nghiên cứu này có thể chọn mức sai số tuyệt đối chấp nhận, d=0,1

- Ước lượng cỡ mẫu theo dấu ấn EpCAM:

Theo công thức, kết quả cho cỡ mẫu tối thiểu đối với dấu ấn EpCAM cho nghiên cứu này là 95 trường hợp

- Ước lượng cỡ mẫu theo dấu ấn CK19:

Theo công thức, kết quả cho cỡ mẫu tối thiểu đối với dấu ấn CK19 cho nghiên cứu này là 81 trường hợp

- Ước lượng cỡ mẫu theo dấu ấn CD44:

Theo công thức, kết quả cho cỡ mẫu tối thiểu đối với dấu ấn CD44 cho nghiên cứu này là 81 trường hợp

Như vậy, nghiên cứu này được thực hiện trên 100 trường hợp, nhiều hơn số mẫu có ý nghĩa thống kê

2.5 Xác định các biến số độc lập và phụ thuộc

Các biến số chính trong nghiên cứu gồm có:

+ Tuổi: tính từ thời điểm bệnh nhân phẫu thuật trừ đi năm sinh, là biến độc lập, định lượng, thuộc thang đo tỉ lệ

+ Giới: biến độc lập, định tính, là biến số nhị giá (nam hoặc nữ), thuộc thang

đo phân loại

+ Kết cục: biến phụ thuộc, định tính, là biến số nhị giá (sống hoặc chết), thuộc thang đo phân loại

+ Tình trạng nhiễm, đồng nhiễm siêu vi B, C và không nhiễm siêu vi B, C dựa vào kết quả xét nghiệm HBsAg, HCV được ghi nhận trong hồ sơ bệnh án, là biến độc lập định tính, thuộc thang đo phân loại

+ Kích thước u: là biến độc lập, định lượng, thuộc thang đo tỉ lệ

+ Số lượng u: là biến độc lập, định tính, thuộc thang đo phân loại

+ Phân loại theo cấu trúc mô học, độ biệt hóa, phân loại theo tế bào u, mức

độ phân bào: đều là biến độc lập, định tính, thuộc thang đo phân loại

+ Xâm nhập mạch máu vi thể, tình trạng thấm nhập tế bào viêm, hoại tử u: là biến độc lập, định tính, thuộc thang đo phân loại

+ Biểu hiện dương tính hay âm tính của các dấu ấn CK19, CD44 và EpCAM: là biến phụ thuộc, định tính, thuộc thang đo phân loại

+ Mức độ biểu hiện của dấu ấn CK19, CD44 và EpCAM: là biến phụ thuộc, định tính, thuộc thang đo khoảng

2.6 Phương pháp, công cụ đo lường, thu thập số liệu

2.6.1 Phương pháp chọn mẫu:

Các đối tượng được chọn vào mẫu nghiên cứu theo phương pháp chọn mẫu

có chủ đích theo tiêu chuẩn chọn mẫu và tiêu chuẩn loại trừ như sau:

- Tiêu chuẩn chọn mẫu

+ Tất cả các mẫu bệnh phẩm phẫu thuật đã được xử lý và vùi nến, được chẩn đoán xác định UTBMTBG bằng phương pháp nhuộm HE thường quy

+ Khối vùi nến đạt yêu cầu để nhuộm hóa mô miễn dịch: còn nguyên vẹn, không bị nứt, vỡ và đủ mô cắt mỏng

- Tiêu chuẩn loại trừ

+ Bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư của cơ quan khác di căn đến gan hoặc ung thư gan đã có di căn đến cơ quan khác, di căn hạch

+ Bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư gan đã được điều trị bằng các phương pháp khác trước khi phẫu thuật

+ Khối mô vùi nến bị hư hỏng do bảo quản hoặc không còn u để đánh giá

2.6.2 Công cụ đo lường

- Hệ thống máy nhuộm HMMD tự động Ventana Benchmark XT và kính hiển vi quang học tại Bộ môn Mô phôi-Giải phẫu bệnh, Đại học Y dược Thành phố

Hồ Chí Minh

- Kháng thể

+ Kháng thể được sử dụng nhuộm HMMD xác định kiểu biểu hiện của dấu

ấn EpCAM là kháng thể đơn dòng Ber-EP4 [101]; của dấu ấn CK19 là kháng thể

đơn dòng A53-B/A2.26 [78]; của dấu ấn CD44 là kháng thể đơn dòng SP37 [77]

Bảng 2.1 Các loại kháng thể và điều kiện sử dụng trong nhuộm HMMD

Kháng

thể

Đơn dòng

Nhà cung cấp

Bộ phát hiện

EpCAM Ber-EP4 Ventana-

Roche

4,96 µg/ml

0,23 µg/ml

0,7 µg/ml

và CK19, riêng dấu ấn CD44 thì bộc lộ kháng nguyên bằng CC2 cũng ở 95ºC và

- Đọc lại tiêu bản nhuộm H&E và phân độ biệt hóa theo phân loại của TCYTTG năm 2019

- Đánh giá kết quả nhuộm HMMD các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM

2.7 Quy trình nghiên cứu

2.7.1 Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch

- Chuẩn bị tiêu bản: cắt mỏng mẫu mô 3 µm và đặt lên tiêu bản có mang điện tích dương

- Nhuộm HMMD bằng hệ thống máy tự động Ventana Benchmark XT như thường quy

- Tiêu bản chứng dương:

* Đối với EpCAM, CK19: mẫu carcinôm tuyến đại tràng

* Đối với CD44: mẫu amiđan bình thường

- Một tiêu bản chứng âm: không được phủ kháng thể thứ nhất mà thay bằng dung dịch đệm PBS

2.7.2 Quy trình nghiên cứu

- Sử dụng mẫu phiếu thu thập số liệu thống nhất ghi nhận các dữ liệu của bệnh nhân như: tên tuổi bệnh nhân, tình trạng nhiễm viêm gan vi rút, chẩn đoán lâm sàng, chẩn đoán giải phẫu bệnh UTBMTBG theo danh sách bệnh nhân được theo dõi sau phẫu thuật từ năm 2010 đến 2012

- Thu thập mẫu mô vùi nến, tiêu bản lưu trữ theo thông tin đã ghi nhận

- Kiểm tra mẫu mô vùi nến, loại bỏ những mẫu không đạt yêu cầu

- Đọc lại tiêu bản nhuộm HE và phân độ biệt hóa theo TCYTTG (2019)

- Chọn lại mẫu mô vùi nến đạt yêu cầu về mật độ tế bào u và phân độ biệt hóa để nhuộm HMMD

- Mẫu mô vùi nến được cắt mỏng làm tiêu bản với độ dày 3µm

- Chuẩn hóa quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM

- Tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM trên các tiêu bản nghiên cứu bằng máy nhuộm tự động

- Lập bảng danh sách bệnh nhân nghiên cứu có đầy đủ thông tin, dữ liệu

- Lập bảng số liệu nghiên cứu đã được mã hóa

- Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 22.0

- Ghi nhận kết quả nghiên cứu

2.8 Phương pháp phân tích dữ liệu

2.8.1 Đánh giá dữ liệu thu nhận

2.8.1.1 Đánh giá đặc điểm đại thể của khối u

Kích thước và số lượng u được ghi nhận khi khi xử lý cắt lọc trên phiếu xét nghiệm giải phẫu bệnh lưu trữ tại Bộ môn Mô phôi-Giải phẫu bệnh

- Kích thước u: chọn đường kính lớn nhất khi ghi nhận kích thước u được mô

tả trên phiếu phiếu xét nghiệm Giải phẫu bệnh

- Số lượng u: đánh giá số lượng u khi ghi nhận số lượng u được mô tả trên phiếu phiếu xét nghiệm Giải phẫu bệnh

+ Dạng một u: đối với dạng u đơn độc

+ Dạng nhiều u: đối với dạng một nốt to với nhiều nốt nhỏ hơn, dạng nhiều nốt độc lập

+ Dạng lan tỏa: dạng nhiều nốt u nhỏ khắp mô gan

2.8.1.2 Đánh giá đặc điểm vi thể của khối u

- Độ biệt hoá UTBMTBG được đánh giá theo bảng phân loại u đường tiêu hóa TCYTTG (2019):

+ Biệt hóa tốt: tế bào u giống với tế bào gan trưởng thành có biến đổi ít; bào

tương bắt màu eosin đậm, bắt màu kiềm trung bình; nhân ít biến đổi hoặc biến đổi nhẹ

+ Biệt hóa vừa: tế bào u biệt hóa, ác tính rõ; bào tương: bắt màu eosin đậm,

bắt màu kiềm trung bình; nhân biến đổi trung bình, đôi khi có tế bào u đa nhân

+ Biệt hóa kém: tế bào u đa hình thái, biệt hóa kém, ác tính rõ; bào tương:

trung bình đến ít, thường bắt màu kiềm; nhân: đa dạng rõ, có thể có tế bào khổng lồ bất sản

Nếu nhiều mức độ biệt hóa phối hợp trên cùng một khối u thì tính theo mức

độ biệt hóa chiếm ưu thế nhất, mức độ biệt hóa nào chiếm hơn 75% mô u thì tính cho mức độ biệt hóa đó, hoặc tính cho mức độ biệt hóa thấp nhất

- Phân loại theo cấu trúc mô học:

+ Dạng bè với những dải tế bào có độ dày khác nhau, các dải này được ngăn

cách bởi các khoảng mạch dạng xoang có thể giãn rộng hoặc bị ép dẹt bởi các tế bào u

+ Dạng giả tuyến hiện diện các cấu trúc giả tuyến hầu hết có 1 lớp tế bào u,

có chứa mật, đôi khi kết hợp với dạng bè

+ Dạng đặc tế bào u dày đặc, các khoảng mạch dạng xoang không rõ, có

+ Loại tế bào gan kinh điển: tương tự tế bào gan bình thường với hình dạng

tế bào và nhân ít biến đổi hoặc biến đổi nhẹ

+ Loại tế bào sáng: bào tương sáng hoặc chứa các nang nhỏ

+ Loại tế bào khổng lồ: hình dạng và kích thước tế bào khác nhau, thường có

tế bào khổng lồ một nhân hoặc nhiều nhân quái

+ Loại tế bào phồng bào: bào tương nhiều, ái toan, nhân tròn có hạt nhân rõ

Nếu nhiều loại phối hợp trên cùng một khối u thì tính theo loại chiếm ưu thế nhất, loại tế bào nào chiếm hơn 75% mô u thì tính cho loại tế bào đó, nếu có nhiều

hơn 2 loại chiếm hơn 25% và ít hơn 75% mô u thì xếp vào dạng tế bào hỗn hợp

- Phân bào: được tính trên 10 quang trường lớn, độ phóng đại 400 lần, quan

sát ở vùng nhiều tế bào ung thư nhất Mức độ phân bào cao với chỉ số phân bào lớn hơn 10 phân bào trên 10 quang trường độ phóng đại 400 lần, mức độ phân bào thấp

nếu chỉ số phân bào nhỏ hơn 10 phân bào trên 10 quang trường độ phóng đại 400 lần [28]

- Thấm nhập tế bào viêm: được đánh giá có hay không có thấm nhập tế bào viêm; và mức độ thấm nhập Được tính là thấm nhập tế bào viêm khi có sự thâm nhiễm tế bào viêm (lymho bào, tương bào,…) đa ổ hoặc lan tỏa dày đặc trong ít nhất hai quang trường độ phóng đại 400 lần

+ Đánh giá mức độ thấm nhập tế bào viêm dựa vào:

* Tình trạng viêm phản ứng và sự tập trung của lympho bào ở tiểu thùy, quanh tĩnh mạch cửa hoặc vỏ bao (vách) u để tính điểm, nếu có là 1 điểm, không có

là 0 điểm Điểm thấm nhập tế bào viêm được tính tổng điểm ở các vị trí tiểu thùy, quanh tĩnh mạch cửa, vỏ bao

* Mức độ thấm nhập viêm ít: <3 điểm, vừa: =3 điểm và nhiều: >3 điểm

(A) Thâm nhập lymphô-tương bào đa ổ (B) Thâm nhập lymphô-tương bào lan tỏa

Hình 1.18: Tình trạng thấm nhập tế bào viêm

“Nguồn: Hayashi A., 2016” [29]