Đánh giá độc tính của chất bảo quản thực phẩm trên phôi cá ngựa vằn

Hiện nay, vấn đề sử dụng hóa chất nói chung và chất bảo quản nói riêng trong sản xuất hàng hóa, đặc biệt trong thực phẩm, rất phổ biến mà không được hoặc được kiểm soát rất lỏng lẻo. Cần có các kiểm chứng những độc hại của chúng có thể gây nên đối với sức khỏe người tiêu dùng và cả đối với môi trường.Sodium Benzoate và Propyl Gallate là 2 chất thường xuyên được sử dụng trong đời sống tuy nhiên 1 số nghiên cứu cho thấy độc tính của chúng không hề thấp, cần nghiên cứu là xác định giới hạn cho phép sử dụng hàng ngày

1

BÁO CÁO ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CHẤT BẢO QUẢN THỰC PHẨM (PROPYL

GALLTE & SODIUM BENZOAT)

TRÊN PHÔI CÁ NGỰA VẰN

I Mở đầu

1 Lí do chọn đề tài

- Hiện nay, vấn đề sử dụng hóa chất nói chung và chất bảo quản nói riêng trong sản xuất hàng hóa, đặc biệt trong thực phẩm, rất phổ biến mà không được hoặc được kiểm soát rất lỏng lẻo Cần có các kiểm chứng những độc hại của chúng có thể gây nên đối với sức khỏe người tiêu dùng và cả đối với môi trường

- Sodium Benzoate và Propyl Gallate là 2 chất thường xuyên được sử dụng trong đời sống tuy nhiên 1 số nghiên cứu cho thấy độc tính của chúng không

hề thấp, cần nghiên cứu là xác định giới hạn cho phép sử dụng hàng ngày

2 Đặc điểm cơ bản về Sodium Benzoate và Propyl Gallate

Công thức hóa học

𝐶6𝐻5𝐶𝑂𝑂𝑁𝑎 𝐶12𝐻1205

Khối lượng phân

Bản chất

Muối từ Natri hydroxit + Axit Benzoic

Ester n-propyl của 3,4,5- trihydroxylbenzoic hay axit galic

Tính chất vật lý

- Tinh thể bột trắng

- Không mùi

- Tan tốt trong nước

- Chất bột màu trắng hoặc xám

- Chịu nhiệt kém

- Tan kém trong chất béo, tan trong nước

Nhóm chất, công dụng

Chất kháng sinh, kìm hãm sự phát triển của

vi khuẩn, nấm trong môi trường axit, bảo quản thực phẩm

Chất chống oxi hóa trong thực phẩm có hàm lượng chất béo cao, dược phẩm, mỹ phẩm ADI

(Aceptable Daily Intake)

3 Ý nghĩa đề tài

3

- Khoa học: cung cấp những tư liệu thực nghiệm về độc tính của Sodium Benzoate và Propyl Gallate

- Thực tiễn: Khuyến cáo sử dụng chất bảo quản hợp lí để không gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người

II Nội dung nghiên cứu

1 Đối tượng

- Thí nghiệm tiến hành trên phôi cá ngựa vằn, ở giai đoạn càng sớm càng tốt sau thụ tinh

Phôi/ấu thể Cá trưởng thành

(Nguồn ảnh: Internet)

- Phân loại cá ngựa vằn:

 Danh pháp 2 phần: Hippocampus comes (Cantor, 1850)

 Loài: H comes

 Chi: Hippocampus

 Họ: Syngnathidae

 Bộ: Gasterosteiformes

 Lớp: Actinopterygii

 Ngành: Chrodata

 Giới: Amimalia

- Đặc điểm: Cá trưởng thành dài khoảng 3-4 cm, có các sọc vằn song song chạy dọc cơ thể, có các màu sắc khác nhau (xanh, đen, đỏ…) Trứng cá ngựa vằn đường kích trung bình 1 mm Phôi và ấu thể trong suốt

- Cá ngựa vằn là sinh vật mô hình phổ biến được sử dụng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới với nhiều đặc điểm thuận lợi cho nghiên cứu.Số lượng phôi lớn nhờ cá trưởng thành sinh sản nhiều và thường xuyên Phôi được bao bọc bởi 1 lớp vỏ trong suốt, giúp dễ dàng quan sát những thay đổi trong hình thái của ấu thể cá Trình tự hệ gen cá ngựa vằn đã được giải mã đầy đủ, trong

đó có trên 12 nghìn gen tương đồng với hệ gen người và khoảng 70% gen của người có ít nhất một gen tương đồng trên cá ngựa vằn

- Phôi cá ngựa vằn 4-5 ngày sau thụ tinh vẫn chưa được coi là động vật do đó không gặp phải vấn đề đạo đức và các ràng buộc trong quy định với động vật thí nghiệm

2 Dụng cụ và hóa chất

1

Hóa chất

Soium Benzoat

hóa chất

4

Dụng

cụ

Kính hiển vi soi nổi

1 cái Kiểm tra

mẫu

quả

cái/loại

Hút môi trường

chất đã pha

3 Phương pháp tiến hành và quy trình thí nghiệm

Gồm các giai đoạn:

- Ghép cá bố mẹ : (Chiều ngày 25/11/2017) Ghép cặp cá bố mẹ: Chọn cặp cá đực cái khỏe mạnh, có khả năng sinh sản bình thường (qua quá trình theo dõi) Chúng tôi chọn 2 cặp cá bố mẹ để đảm bảo đủ số lượng trứng cho thí nghiệm trên 2 chất Các cặp cá được để riêng trong 1 bể nhỏ, có 1 lưới/rổ thưa, ngăn cá bố mẹ ăn trứng

- Thu phôi: (Sáng 26/11/2017) Đưa cá bố mẹ quay về bể nuôi cũ, thu phôi

Rửa sạch phôi 3-5 lần bằng nước sạch

- Chọn lọc các phôi sạch, khỏe mạnh, ở giai đoạn 8 tế bào

- Phơi nhiễm hóa chất: Chọn 1 phôi/1 giếng/1 nồng độ/1 đĩa với mỗi giếng 1ml môi trường đã pha trước Đây được xem là giai đoạn 0h sau thụ tinh Theo bảng sau:

Đĩa 24 giếng Với ĐC: đối chứng; H: Hóa chất

- Kiểm tra mẫu và thay môi trường: (sau mỗi 24h) Qua các giai đoạn sau 24h -48h-72h-96h, kiểm tra sự phát triển của phôi dưới kính hiển vi soi nổi, gồm

5

khả năng sống chết và các dị dạng xuất hiện Sau đó thay môi trường cho các giếng, hút bỏ ~ 0,5 ml môi trường cũ, bổ sung ~0,5ml môi trường mới

Tiêu chí kiểm tra:

Mẫu Thời gian sau thụ

Bình thường

0h Phôi sạch, giai đoạn 8 tế bào 24h Đuôi tách khỏi noãn hoàng 48h Sắc tố hình thành, tập trung

nhiều ở mắt 72h Ấu thể nở, bơi tự do, quan sát

thấy tim đập 96h Tim đập, quan sát rõ hình dạng

bình thường của các cơ quan

Phôi đông tụ, màu trắng đục hoặc đen, không rõ cấu trúc 72h-96h Tim không đập

- Hoại tử noãn hoàng

- Hoại tử đầu

- Phù màng bao tim

- Tụ máu

- Cong cột sống

- Dị tật đuôi

- Đánh giá, phân tích kết quả

III Kết quả và thảo luận

1 Mẫu đối chứng:

1,5 cm

1-2 mm

1 cm

1 cm

1-2mm

24h 0h

72h 48h

2 Các mẫu phơi nhiễm hóa chất chết qua các thời gian:

3 Sodium Benzoat

- Thí nghiệm phơi nhiễm với Sodium Benzoat thực hiện tại các nồng độ: 100 mg/l, 500 mg/l, 1000 mg/l, 1500 mg/l, 2500 mg/l (mỗi đĩa 24 giếng 1 nồng độ)

- Sau mỗi 24h sau thụ tinh, soi kính, kiểm tra và ghi lại số lượng ấu thể chết, đặc điểm dị dạng (24h, 48h, 72h, 96h)

Bảng thể hiện số lượng ấu thể chết khi phơi nhiễm với

Sodium Benzoat

100 mg/l

500 mg/l

1000 mg/l

1500 mg/l

2500 mg/l

96h

1-2 mm

1-2 mm 1-2 mm

1-2 mm

96h 72h

48h 24h

7

Bảng thể hiện số lượng ấu thể dị dạng khi phơi nhiễm với

Sodium Benzoat

Nồng

100 mg/l

Dị dạng

500 mg/l

Dị dạng

1000 mg/l

Dị dạng

1500 mg/l

Dị dạng

2500 mg/l

Dị dạng

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

Thời gian

Biểu đồ thể hiện % ấu thể cá chết theo thời gian phơi nhiễm Sodium Benoat tại các nồng độ

100 mg/l 500 mg/l 1000 mg/l

1500 mg/l 2500 mg/l

50%

- Các dạng dị dạng phổ biến:

 48h sau thụ tinh: Hoại tử noãn hoàng, hoại tử đầu:

0 5 10 15 20 25

Nồng độ

Biểu đồ thể hiện tỷ lệ dị dạng/sống của ấu thể khi phơi

nhiễm Sodium Benzoat

1 cm

1 cm

1 cm

Hoại tử noãn hoàng

100 mg/l

1500 mg/l

1000 mg/l

2500 mg/l

1000 mg/l

9

 72h: Hoại tử noãn hoàng:

 96h: Cong đuôi, cong cột sống, phù mang bao tim, tụ máu, hoại tử noãn hoàng:

1 cm

1 cm

Phù màng tim

1 cm

Phù màng tim + tụ máu

1000 mg/l

1 cm

1 cm

Cong đuôi Cong cột sống + hoại tử noãn hoàng

Hoại tử noãn hoàng

1500 mg/l

- Nhận xét: Tác động của Sodium Bezoat:

o Gây chết : 24h sau phơi nhiễm đã ảnh hưởng đến khả năng sống sót của phôi Tỷ lệ chết càng cao ở càng nồng độ cao và thời gian theo dõi kéo dài Sau 72h, ở nồng độ 2500 mg/l tỷ lệ chết là 100%

o Gây dị dạng: Dị dạng xuất hiện rõ từ sau 48h phơi nhiễm ở tất cả các nồng độ, gồm hoại tử noãn hoàng, hoại tử đầu → Phù màng tim, cong đuôi → Tụ máu Tỷ lệ dị dạng cao khi nồng độ càng cao và thời gian theo dõi càng dài

o Ở nồng độ càng cao, liều lượng gây chết 1 nửa tác động tại thời gian phơi nhiễm càng ngắn

4 Propyl gallate

- Quá trình thí nghiệm được tiến hành 2 lần : lần 1 có 4 nồng độ lần lượt là 100mg/l 500mg/l 1000mg/l 2000mg/l Sau mỗi 24h kiểm tra và ghi lại kết quả, ngay trong 24h đầu các phôi ở nồng độ từ 500mg/l trở lên đã đều chết hết thể hiện ở bảng sau:

IV

V

Nồng độ

Đối chứng Hóa chất Sống Chết Sống Chết

11

Phôi chết sau 24h các nồng độ >=500mg/l

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Thời gian

Biểu đồ thể hiện tỷ lệ chết khi phơi nhiễm với Propyl Gallte

(lần 1)

100 mg/l 500 mg/l 1000 mg/l 2000 mg/l

Phôi phát triển tốt ở nồng độ 100mg/l

- Tiếp tục theo dõi đến 48h 72h và 96h thì nồng độ 100mg/l phôi phát triển bình thường không có dị dạng xảy ra

Đối chứng sau 96h

13

Nồng độ 100mg/l sau 96h

- Từ kết quả phía trên ta có thể nhận thấy cần tiếp tục tiến hành thí nghiệm lần

2 để xác định được chính xác hơn khoảng nồng độ bắt đồ gây chết hết phôi

Lần 2 các nồng độ thử nghiệm là 100mg/l 200mg/l 400mg/l và 500mg/l và kết quả thu được sau 24h đầu là:

Nồng

độ

Đối chứng Hóa chất Sống Chết Sống Chết

Phôi chết ở nồng độ >=200mg/l

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Thời gian

Biểu đồ thể hiện tỷ lệ chết khi phơi nhiễm với Propyl Gallate

(lần 2)

100 mg/l 200 mg/l 400 mg/l 500 mg/l

15

Nồng độ 100mg/l sau 24h

Nồng độ 200mg/l phôi sống duy nhất

- Tiếp tục quan sát sau 48h thì phôi còn lại của nồng độ 200mg/l cũng chết nốt còn các phôi của nồng độ 100mg/l vẫn sống tốt và phát triển bình thường không thấy xuất hiện dị dạng

- Nhận xét: propyl gallate có khả năng gây độc lớn cho phôi cá dù nồng độ

thấp, chưa xác định được chính xác nồng độ thấp nhất bắt đầu gây chết hết chỉ biết nằm trong khoảng 100 đến 200 mg/l và không gây xuất hiện dị dạng

VI Kiến nghị và lời cảm ơn

1 Kiến nghị

- Thiết kế các thí nghiệm chuyên sâu hơn với số lượng mẫu lớn và lặp lại trên các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi/ấu thể cá ngựa vằn để đánh giá chi tiết hơn về tác động của các chất phụ gia thực phẩm

- Có quy định chặt chẽ hơn trong việc sử dụng Sodium Benzoat và Propyl

Gallate, đặc biệt là Propyl Gallte với mức độ tác động rất nghiêm trọng

2 Lời cảm ơn

- Chúng em xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Lai Thành – Trưởng bộ môn Tế bào học, khoa Sinh học, trường Đại học KHTN – Giảng viên môn Sinh học Phát triển Cảm

ơn thầy đã dạy cho chúng em những kiến thức bổ ích trong môn học, và đã tạo điều kiện để chúng em được làm quen với cách thiết kế một thí nghiệm từ đầu đến cuối

- Chúng em cảm ơn anh Kiều Trung Kiên và các anh chị trong nhóm Công nghệ Tế bào Động vật đã hướng dẫn chúng em các thao tác, trực tiếp giải đáp các thắc mắc trong quá trình làm thí nghiệm

- Xin cảm ơn các bạn lớp K60TNSH đã cùng hỗ trợ nhau để nhóm có thể sắp xếp được lịch thí nghiệm phù hợp