BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÁT TRIỂN THỬ ĐỘC KHÓI THUỐC LÁ TRÊN PHÔI CÁ NGỰA VẰN I Mục đích Quan sát sự biến đối và phát triển của phôi cá ngựa vằn Khảo sát mức độ độc của thuốc lá với sự phát triển của phôi cá ngựa vằn.
Trang 1BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÁT TRIỂN THỬ ĐỘC KHÓI THUỐC LÁ TRÊN PHÔI CÁ NGỰA VẰN
I.Mục đích
- Quan sát sự biến đối và phát triển của phôi cá ngựa vằn
- Khảo sát mức độ độc của thuốc lá với sự phát triển của phôi cá ngựa vằn
II Giới thiệu:
Thuốc lá có nhiều thành phần độc hại:
1 Nicotine
Nicotine là một chất không màu, chuyển thành màu nâu khi cháy Nicotine được hấp thụ qua da, miệng và niêm mạc mũi hoặc hít vào phổi Nicotine tác động đến hệ thần kinh bằng cách đưa dopamine vào hệ thần kinh kích thích sự sinh ra của adrenaline
Bộ Y tế ban hành Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với thuốc lá điếu quy định hàm lượng tối đa Nicotin trong khói 01 điếu thuốc lá là 1,4mg
2 Monoxit carbon (khí CO)
Khí CO có nồng độ cao trong khói thuốc lá và sẽ được hấp thụ vào máu, gắn với hemoglobin với ái lực mạnh hơn 20 lần oxy, dẫn đến giảm lượng oxy chuyển đến tổ chức gây thiếu máu tổ chức và có lẽ góp phần hình thành các mảng xơ vữa động mạch
3 Các phân tử nhỏ trong khói thuốc lá
Khói thuốc lá chứa nhiều chất kích thích dạng khí hoặc dạng hạt nhỏ Các chất kích thích này gây nên các thay đổi cấu trúc của niêm mạc phế quản dẫn đến tăng sinh các tuyến phế quản, các tế bào tiết nhầy và làm mất các tế bào có lông chuyển
Dự đoán kết quả: Tại nồng độ cao phôi của cá ngựa vằn yếu đi, chậm chạp,
giảm sức sống, có thể chết, xuất hiện biến dạng liên quan đến hô hấp – tim, vận động bị ảnh hưởng do tác động của thuốc lá đến hệ thần kinh
(Bài báo tham khảo về tác động của nicotine đến phôi cá ngựa vằn
https://www.researchgate.net/publication/5805785_Effects_of_Nicotine_on_Growt h_And_Development_in_Larval_Zebrafish )
III Dụng cụ thí nghiệm:
- Thuốc lá Vinataba và Thăng Long
- Ống Falcon 50ml
- Đĩa petri
- Khay nhựa 24 giếng
Trang 2- Pipet nhựa
- Cân
- Máy bơm tự chế
- Cá ngựa vằn
- Kính hiển vi
- Nước
IV Thực hành ( kéo dài 6 ngày: từ 28/11/2017 đến 3/12/2017)
Tiến trình thí nghiệm:
Ngày 1: Chuẩn bị hóa chất và ghép cá ngựa vằn
- Chuẩn bị môi trường:
+ Dùng thiết bị bơm tự chế để thu lấy khói thuốc lá đã được lọc bằng giấy lọc
+ Mang giấy lọc đi cân (m1)rồi ngâm vào 100ml nước
+ Mang giấy lọc sau khi ngâm đi sấy khô rồi cân lại(m2) để xác định nồng
độ thuốc lá
Trang 3+ Thu 100ml nước đã ngâm ở trên rồi pha để nồng độ thuốc lá trong mẫu là 100mg/l Pha thêm nước để về nồng độ chẵn thuận tiện cho việc pha loãng tiếp theo
+ Chia dung dịch ra các ông Falcon và pha để đạt được gradient nồng độ mong muốn (ghi rõ nồng độ và loại thuốc ở nắp và cạnh ống)
V dd thuốc
lá(ml)
lá(ml)
V nước(ml)
- Ghép cặp cá ngựa vằn:
+ Chuẩn bị 5 âu nhựa có lót rổ ở trong (để thu được phôi lắng xuống dưới, không bị cá trưởng thành ăn mất)
+ Vớt cá ngựa vằn ra âu nhựa (mỗi âu có một cá đực và một cá cái)
+ Đậy nắp để qua đêm, sáng hôm sau đến thu phôi
Ngày thứ 2:
- Chuẩn bị các giếng môi trường:
+ Chuẩn bị các khay chứa giếng, mỗi khay ghi nồng độ và tên thuốc lá ở cạnh khay
+ Tra nước vào cột giếng đầu tiên để làm đối chứng, tra các giếng còn lại với dung dịch thuốc lá (mỗi giếng 1ml, lưu ý tra từ nồng độ từ thấp đến cao)
- Chuẩn bị phôi cá ngựa vằn:
+ Vớt cá ra, rửa đi rửa lại phôi nhiều lần để không bị vi khuẩn bám vào + Hút phôi ra đĩa petri và đưa lên kính soi
+ Quan sát và chọn những phôi đã phân chia ít nhấy 2-3 lần(4-8 tế bào) sang một đĩa petri khác
Trang 4+ Hút các phôi và chấm nhẹ vào từng giếng, mỗi giếng một phôi
Ngày thứ 3:
- Quan sát sự biểu hiện của phôi:
+ Quan sát và ghi lại sự phát triển của phôi, tỉ lệ sống của phôi trên kính hiển vi
Phôi chết sẽ có màu đen( hình ảnh ở phần kết quả)
- Thay môi trường: Hút 0.5ml dung dịch cũ từ các giếng và thay bằng 0.5ml dung dịch mới, làm cẩn thận để không hút phôi lên
Ngày thứ 4:
- Quan sát sự biểu hiện của phôi:
+ Quan sát và ghi lại sự phát triển của phôi và tỉ lệ sống của phôi trên kính hiển vi
+ Vẫn chưa gọi là bơi vì các cá thể này chưa nổi trong nước, quan sát sự sống chết bằng cách nhìn tim
- Thay môi trường
Ngày thứ 5:
- Quan sát sự biểu hiện của phôi:
+ Quan sát và ghi lại sự phát triển của phôi đã phá vỡ màng phôi và tỉ lệ sống của phôi trên kính hiển vi
+ Quan sát sự sống chết bằng cách nhìn tim hoặc chạm nhẹ đầu pipet vào cá
để xem có di chuyển không
- Thay môi trường
Ngày thứ 6:
- Quan sát sự biểu hiện của phôi:
+ Quan sát và ghi lại hình dạng và sự vận động của cá và tỉ lệ sống của chúng trên kính hiển vi
+ Cá đã có khả năng bơi nên khi quan sát chỉ thấy mặt lưng, do đó dung đầu pipet đẩy nhẹ cá để quan sát (đã có thể quan sát sự biến dạng của cá)
V Kết quả
1.Quy ước:
Toàn bộ cột 1 là đối chứng (màu xanh)
C-chữ số: Chết ngày thứ mấy (ví dụ: C3: chết ngày 3)
Đánh dấu x: dị dạng (các dị dạng khác sẽ được ghi chú trong cột chú thích)
2 Kết quả quan sát
Ngày 3: (ngày quan sát thứ nhất- sau 24h)
Dấu hiệu: phôi chết sẽ đông tụ (có màu đen khi soi trên kính hiển vi, màu trắng khi nhìn bằng mắt thường)
Trang 5Ngày 4:(sau 48h)
Dấu hiệu giống như ngày 3 Một số phôi đã nở sau 48h
Xuất hiện một số biến dạng phôi như đuôi ngắn ( Thuốc lá Thăng Long, nồng độ 50,60)
Ngày 5:(sau 72h)
Dấu hiệu: quan sát tim đập, trứng tiếp tục nở nhưng cá hoạt động yếu, không bơi
Ngày 6:(Sau 96h)
Trang 6Dấu hiệu nhận biết phôi chết: tim ngừng đập Quan sát và ghi lại dị dạng của cá ở các nồng độ ở các giếng thuốc lá Thăng Long Thuốc lá Vinataba không ghi nhận
dị dạng Không quan sát được ảnh hưởng của thuốc lá với cá di giếng nhỏ
3 Bảng tổng hợp
a Thăng Long
Nồng
độ
A
B
C
-Chết 1 phôi sau24h -4 Phôi nở sau 48h -11 phôi nở sau72h, còn lại nở sau 96h
- Trừ phôi chết sau 24h, các cá thể khác phát triển bình thường
=> Nồng độ thấp nên ảnh hưởng ít, phôi chết có thể do phôi yếu hoặc quá trình thao tác
A
B
C
D
-3 Phôi nở sau 48h, 5 phôi nở sau 72h, còn lại
nở sau 96h -Tất cả các phôi phát triển bình thường
Trang 720 1 2 3 4 5 6
A C3 x C3
C
-6 phôi chết trong ngày đầu
-A3: hoại tử và chưa nở sau 96h
=> số phôi chết nhiều bất thường có thể do thao tác hoặc do phôi rất yếu
A
-2 phôi chết sau24h, 1 phôi chết sau 96h
- B4: Phù màng tim -Các ô còn lại phát triển bình thường
A
-2 phôi chết sau 24h -C3: phù màng tim -Các ô còn lại phát triển bình thường, sau 72h
đã nở hết
50
1 2 3 4 5 6
-C2: sau 48h phát hiện dị dạng, sau 72h chết
-Các ô còn lại nở hết sau 72h -D2: Phù tim, mất sắc tố lưng -A3: Phù tim
-D4, B5, C5: Phù màng tim
Trang 8-A6: Đuôi biến dạng gãy cong một bên, hoại tử -B6: Phù màng bao tim, hoại tử nhẹ
-A3: dị dạng ngày 4; phù màng bao tim, phù noãn hoàng, chưa nở hết vào sau 96h
-A2: Phù màng tim, hoại tử nhẹ -C3: chưa nở hết, phù màng tim, hoại tử -D5: Phù màng tim, hoại tử nặng
-Các ô đánh dấu x còn lại: phù màng tim, hoại
tử
Trang 970 1 2 3 4 5 6
A C3 C3
C C3
-7 phôi chết sau 24h -Không có thống kê dị dạng do lỗi thao tác làm mất mẫu vào ngày 5
b Vinataba
Nồng
độ
B
C
-Số cá thể chết 2/20 con sau 24h -Đối chứng ở ngày thứ 4 đã phá vỡ màng phôi, còn giếng chứa độc thuốc lá sau 72h mới nở -Sau 96h cá khoẻ và quẫy mạnh
C
D
-Số cá thể chết 2/20 con ở sau 24h -Một mẫu đối chứng sau 72h mới nở -Cá vẫn khoẻ và quẫy mạnh
A
B C3
C
D
-1 mẫu đối chứng bị chết, có thể do phôi yếu hoặc dùng độc thuốc lá nên có sự ảnh hưởng của hơi thuốc
-Tất cả các mẫu đều đều sau 72h mới nở, kể cả mẫu đối chứng ( ảnh hưởng của hơi thuốc lá)
Trang 1040 1 2 3 4 5 6
A C3
B
D
-C3: thao tác sai làm vỡ màng phôi -C5: thao tác quá mạnh (dùng pipet kiểm tra) làm đứt lìa cơ thể cá
-Phôi sau 72h mới bắt đầu nở
-Phôi bắt đầu yếu dần, quẫy yếu và có khi không quẫy khi tác động bằng đầu pipet
-Có 4 mẫu chết sau 24h, 1 mẫu chết sau 72h
4.Đồ thị:
Trang 115.Nhận xét
-Không xác định được mối quan hệ tuyến tính giữa số lượng phôi cá chết và nồng
độ thuốc lá.:
+ Số lượng phôi chết sau 24 thay đổi không có quy tắc ở các nồng độ( tăng đột biết ở nồng độ 20 Thăng Long và giảm ở 30-40 với Vinataba) Có thể do chất lượng phôi cá không đồng đều
+Từ sau 24h, số lượng phôi chết rất ít hoặc không chết thêm
-Có thể kết luận số lượng cá thể dị dạng tỉ lệ thuận với nồng độ thuốc lá Thăng Long Đặc biệt, các dị dạng phù màng tim, hoại tử noãn hoàng rất phổ biến với phôi trong môi trường thuốc lá Thăng Long nồng độ cao (50-60)
- Thuốc lá Vinataba không gây dị dạng kể cả với nồng độ cao (60)
-Không khảo sát được ảnh hưởng của thuốc lá Vinataba đến sự vận động của cá ngựa vằn do kích thước giếng nhỏ, khó quan sát
IV Kết luận
-Thuốc lá Thăng long (đến nồng độ 60 mg/l) có chứa lượng độc tố ảnh hưởng đến phôi cá ngựa vằn
+ Vấn đề trong trao đổi chất (gây hoại tử),
+ Khuyết tật chức năng tim (dẫn đến phù màng tim)
+Làm hệ cơ xương phát triển không đồng đều (dẫn đến bị cong đuôi)
-Thuốc lá Vinataba (đến nồng độ 60mg/l) ít gây ảnh hưởng đến sự phát triển hình thái của ấu thể cá ngựa vằn