Bài giảng Hóa sinh và thí nghiệm hóa sinh: Chương 2 - Protein

Bài giảng Hóa sinh và thí nghiệm hóa sinh: Chương 2 - Protein được biên soạn với các nội dung chính sau: Axit amin: thành phần cơ bản cấu tạo protein; Cấu trúc protein; Phân loại axit amin; Vai trò Axit amin; Tính chất Axit amin; Định luật Lambert Beer;... Mời các bạn cùng tham khảo bài giảng để nắm được nội dung chi tiết nhé!

Chương 2 Protein

Axit amin: thành phần cơ bản cấu tạo protein

“CORN“

Công thức tổng quát:

• Axit amin khác nhau do nhóm R

• Ở pH sinh lý, axit amin ở trạng thái ion hóa:

ion âm hoặc dương

• L- axit amin: cấu trúc protein

 Axit amin

pK1  2.2

pK2  9.4

20 L- axit amin cấu trúc protein

• 20 (22) L- axit amin tạo nên protein

- dipeptid (2 amino acids):

- Tripeptid (3 amino acids):

- Protein from 100aa:

1027

.1

20 = x

Phân loại axit amin

1 Theo mức độ cần thiết:

Histidin

Axit amin không thay thế

Không được tổng hợp trong cơ thể

Axit amin không thay thế

(essential)

Phải được cung cấp trong khẩu phần ăn

Axit amin

Được tổng hợp trong cơ thể

Axit amin thay thế

(non-essential)

Không buộc phải cung cấp trong khẩu phần ăn

-Không hoặc ít tan/H2O

-Tạo tương tác Val Der walls

-Cuộn bên trong mạch protein

Tạo liên kết giữa các gốc R -anion/cation, tạo lket cầu

muối, ổn định cấu hình protein

-Tạo cầu S-S (cộng hóa trị) ổn định cấu hình

protein

-Possible forming hydrogen bonds, stabilizes

protein conformation dissolves in water

2 Theo cấu trúc mạch bên R

Ion hóa:

20 L- axit amin tiêu chuẩn (cấu trúc protein)

Selenocysteine (Sec, U): axit amin thứ 21

• Axit amin hiếm gặp, giống cyctein trong đó thay thế S = Se

• Axit amin có trong một vài loài thuộc eukaryotic and

prokaryotic, phát hiện 1970s

• Có trong trung tâm hoạt động một số enzyme (formate

dehydrogenase của E coli và glutathione peroxidase động

vật có vú)

• Mã hóa bởi stop codon UGA

• Pka thấp và thế oxy hóa khử thấp ( thấp hơn cyyctein)

• Tính nucleophile mạnh

Tham gia cấu trúc protein, thể hiện tính chống oxy hóa

Pyrrolysin (Pyl, O): axit amin thứ 22

• Axit amin Lysin thay thế NH2 bằngNH-vòng pyrrole

• Mã hóa bởi stop codon: UAG

• Phát hiện năm 2002

• Có trong TTHĐ của enzym… trongmột số cổ khuẩn lên men methan(không có ở người)

✓ Nguồn năng lượng

✓ Phụ gia thực phẩm: gia vị, hương, chức năng (VD L-Theanin)

✓ Tạo protein cấu trúc thực phẩm

✓ Axit amin không thay thế

✓ Tạo Enzym

✓ Axit amin không thay thế đóng vai trò thuốc

✓ Axit amin không thay thế

Vai trò Axit amin

TT Axit amin không thay thế

ở người

Vai trò

1 Phenylalanine Tiền chất chất dẫn truyền thần kinh tyrosine, dopamine, epinephrine, norepinephrine Cấu

trúc nên enzym và đảm bảo chức năng enzym tổng hợp các axit amin khác

2 Valine Tăng cường tái tạo cơ, tham gia quá trình tổng hợp năng lượng trong cơ thể

3 Threonine Cấu trúc phần quan trọng của protein collagen và elastin, thành phần da và mô liên kết

Tham gia tổng hợp lipit và có chức năng miễn dịch

4 Tryptophan Duy trì cân bằng nitơ, tiền chất của serotonin, một chất dẫn truyền thần kinh điều chỉnh sự

thèm ăn, giấc ngủ và tâm trạng

5 Methionine Có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất và giải độc, phát triển mô, hấp thụ kẽm,

selen, các khoáng chất

6 Leucine Quan trọng cho tổng hợp protein và sửa chữa cơ bắp; giúp điều chỉnh lượng đường máu,

kích thích chữa lành vết thương và sản xuất hormone tăng trưởng

7 Isoleucine Liên quan đến chuyển hóa trong mô cơ, bắp; vai trò trong chức năng hệ miễn dịch, sản xuất

huyết sắc tố và điều tiết năng lượng

8 Lysine Đóng vai trò chính trong tổng hợp protein, sản xuất hormone, enzyme và hấp thu canxi;

trong sản xuất năng lượng, chức năng miễn dịch, tổng hợp collagen và elastin

9 Histidine Tham gia sản xuất histamine, một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng đối với phản ứng

miễn dịch, tiêu hóa, chức năng tình dục và chu kỳ ngủ-thức; quan trọng trong việc duy trì vỏ myelin, hàng rào bảo vệ bao quanh các tế bào thần kinh

Axit amin

không tham gia cấu

trúc protein

Axit amin ít gặp

– Tính chất nhóm –COOH (xem lại kiến thức)

– Tính chất –NH2 (xem lại kiến thức)

– Loại dung môi: phụ

thuộc độ phân cực củagốc R và dung môi

Tính chất quang học

Cấu trúc lập thể: L- và

D-Cis-Trans axit amin

-Quyết định tính chất sinh học của protein

-Quyết định tính đặc hiệu Enzym

-Độ bền của mạch protein -Quyết định tính đặc hiệu Enzym

“CORN“

Hấp thụ tia UV

• Axit amin hấp thụ tia UV

aa thơm: Phenylalanine, tyrosine,

tryptophane

max at 250-290 nm

200-230 nmHistidine, cysteine, methionine

max at 200-210 nm

• Law Lambert beer: A= .L.C

A = εLC C mg/ml

OD

Nhắc lại định luật Lambert Beer

Ứng dụng định luật Lambert-Beer trong phân tích

• Lập đường chuẩn (A-C): quan hệ nồng

độ và độ hấp thụ dd chất tan

– Dung dịch chất chuẩn gốc: C0 mg/ml

– Pha hệ nồng độ C1-C5 (phạm vi tỉ lệ

thuận), thực hiện phản ứng– Dựng đường thẳng A=kC

Thực hiện phản ứng với dung dịch Cx

Đo Ax của dung dịch

Xác định Cx dựa vào đồ thị đường

chuẩn

Độ tan của axit amin nhỏ nhất tại

pI của nó

Tính chất Hóa học

• Xem lại tính chất nhóm –COOH

– Phản ứng với kiềm (tạo muối)

– Phản ứng với alcol (tạo este)

• Xem lại tính chất nhóm –NH2

– Chuyển nhóm –NH2 tạo axit amin mới

– Khử nhóm –NH2, (giải phóng –NH3)

TẠO LIÊN KẾT

PEPTIT

• Liên kết cộng hóa trị giữa nhóm –NH2

ở vị trí C của axit amin thứ nhất và nhóm -COOH ở vị trí C của axit

amin thứ 2

một mặt phẳng

Phản ứng ninhydrin (đặc trưng của axit amin)

Phản ứng định tính, định lượng axit amin (-NH2)Phương pháp đo quang (ứng

dụng định luật Lamber Beer

a.a 1

a.a 2

570 nm

Tính chất cảm quan

Chất cảm vị:

• Vị ngọt: Glycerin, Alanin, Valin

• Vị đắng: Arignin, Isoleucin Khi thủy phân protein gây vị đắng??

• Vị ngọt thịt: Glutamic-Na

• Không vị: Leucin

Axit amin và trao đổi chất

Mạch C của axit amin có thể là tiền chất tổng hợp glucose hoặc chất béo: giao thoa con đường trao đổi chất protein và gluxit

Chia ba loại:

– Tiền chất tạo glucose/glycogen(glycogenic): alanin, aspartate, glycin, metionin

– Tiền chất tạo chất béo (ketogenic): leucin, lysin

– Tiền chất cho glucose và chất béo : phenylalanine, isoleucine, tryptophan, tyrosin

Khái niệm:

• Peptit: bao gồm mạch các axit amin liên kết với nhau bằng

liên kết peptit

– Dipeptit: gồm hai gốc axit amin

Vd: Aspartam, chất tạo ngọt: Aspartic-phenylalanine- metyl

este

– Oligopeptit: cấu tạo bởi một vài-10 axit amin liên kết bởi

liên kết peptit

GHS -Gamma Glutamylcysteinglycine: Acid

glutamic-Cystein-Glycein, chất chống oxy hóa

– Polypeptit: < gốc 50 axitamin

Vd: Insulin, hoocmon

Aspartam

Structure of GSH

Protein: thành phần

Thành phần

• Do 20 L-axit amin phổ biến cấu tạo nên

• Khoảng 300-500 axit amin

• Các nguyên tố:

– C, H, O, N – N: 16%

Phân tử bao gồm (các) chuỗi

polypeptit có cấu trúc không

– Điều hòa/kích thích sinh trưởng: Hoocmon:

– Bảo vệ cơ thể: Kháng thể, globulin, tế bào T killer, thụ thể– Cảm ứng: Rhodopsin

Nhắc lại các liên kết cơ bản trong phân tử sinh học

Lkết giữa hai nguyên tử không tiếp xúc

do tương tác các lớp điện tử ngoài,

Sự góp chung cặp điện tử của các nguyên tử

trong phân tử sinh học

trong môi trường nước

Liên kết hydro - liên kết yếu

• Liên kết hydro tạo bởi lực hút tĩnh điện giữa nguyên tử H với

nguyên tử âm điện (O, N,F)

• Các nguyên tử tham gia LK có thể:

– Tạo liên kết giữa H- và các nguyên tử âm điện thuộc hai

phân tử khác nhau hoặc nội tại trong một phân tử (DNA, protein, cellulose): tạo cấu trúc phân tử

– Tạo liên kết với phân tử nước trên bề mặt phân tử trên

mạch C-C của phân tử (protein, gluxit…): quyết định tínhchất bề mặt của phân tử

Liên kết hydro

• Yếu tố ảnh hưởng độ bền liên kết hydro: Nhiệt độ, áp suất, độ dài

liên kết

- nhiệt độ thấp: tạo và làm bền LK hydro

- nhiệt độ cao: dao động nhiệt phá hủy liên kết hydrogen

Tạo, làm bền hoặc phá hủy cấu trúc bậc cao protein, DNA…

Liên kết ion

• Liên kết ion tạo bởi lực hút tĩnh điện giữa các nguyên tử

tích điện trái dấu

• Độ bền của liên kết ion

F = q 1 q 2 /d 2 e

e: hằng số điện môi, phụ thuộc độ phân cực dung môi

- Phụ thuộc vào điện tích;

- Tỉ lệ nghịch với

• khoảng cách giữa hai phần tử tích điện trái dấu

• độ phân cực của vi môi trường quanh nó

• Hầu hết LK ion tồn tại trên bề mặt protein ion hóa Trong

phân tử protein, liên kết ion có độ bền lớn hơn các liên

kết yếu khác, gần với LK cộng hóa trị (do các nhóm kỵ

nước bao quanh): làm bền cấu trúc protein

Liên kết ion trong phân tử protein

Liên kết kỵ nước

• Liên kết kỵ nước xảy ra giữa các nhóm kỵ nước (axit

amin có mạch bên kỵ nước, lipit, dung môi)

• Trong dung môi có cực, các nhóm kỵ nước có xu

hướng gần nhau

• Trong hệ nhũ tương, liên kết H giữa các phân tử nước

trên bề mặt protein (20-30) bị phá vỡ, phân tử nước

sắp xếp bao quanh các nhóm không cực, tạo màng

nước làm dung môi

• LK kỵ nước làm aa chứa R kỵ nước có xu hướng

quay vào trong phân tử protein, có vai trò quan trọng

trong tạo cấu trúc bậc cao protein (folding), ảnh

hưởng tính tan protein và tính chất protein biến tính

Liên kết kỵ nước sắp xếp các phân tử kỵ nước trong

hệ nhũ tương

Liên kết Van der Waals

• Khái niệm: lực hấp dẫn giữa các nguyên tử do các

đám mây điện tử tạo các cực tạm thời, cảm ứng tạo

các đám mây điện cực của nguyên tử khác, làm chúng

xích gần nhau tại một khoảng cách nhất định ( 5 nm)

phụ thuộc kích thước đám mây (đường kính Van der

Waals)

• Độ bền lực Van Der Waal thấp nhất trong số liên kết

yếu, phụ thuộc khoảng cách giữa hai phân tử và kích

thước/khối lượng của phân tử

• Đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc bậc cao protein

do các nguyên tử gần nhau đều có thể tham gia LK,

cấu trúc nên cấu trúc bậc cao protein

Liên kết cộng hóa trị

• LK góp chung điện tử vỏ ngoài cuả các nguyên tố

• Là LK mạnh nhất liên kết các nguyên tử trong phân tử sinh học -(50 to -100

Các mức cấu trúc protein

Tổng hợp mạch polypeptit Cuộn mạch (folding) Đóng gói Tương tác giữa các mạch peptit

CẤU TRÚC BẬC 1 PROTEIN

Đặc trưng cấu trúc bậc 1 protein:

• Thành phần, trình tự và số lượng axit amin

• Liên kết peptit: liên kết công hóa trị, bền → cấu trúc bậc 1 bền

Cách gọi tên mạch polypeptit

• Trình tự axit amin đọc từ đầu

N-• (Tổng hợp protein từ đầu N)

• Gốc axit amin đầu N: “-yl”;

• Gốc axit amin đầu C: “-ine”

Name (residues) Source or Function Amino Acid Sequence

Glutathione (3) Most Living Cells

(stimulates tissue growth)

(+) H3NCH(CO2(–) )CH2CH2CONHCH(CH2SH)CONHCH2CO2H γ-Glu-Cys-Gly (or γ ECG )

TRH (3) Hypothalmic Neurohormone

(governs release of thyrotropin)

Angiotensin II (8) Pressor Agent

(acts on the adrenal gland) Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-PheNH2 (or DRVYIHPFNH2)

Bradykinen (9) Hypotensive Vasodilator

(acts on smooth muscle) Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg (or RPPGFSPFR)

Oxytocin (9) Uterus-Contracting Hormone

(also stimulates lactation)

Somatostatin (14) Inhibits Growth Hormone Release

(used to treat ulcers)

Endothelin (21) Potent Vasoconstrictor

(structurally similar to some snake venoms) <>

Melittin (26) Honey Bee Venom

(used to treat rheumatism)

Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro~

~Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-GlnNH2(or GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQNH2)

Glucagon (29) Hyperglycemic Factor

(used as an antidiabetic)

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp~

~Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (or HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT )

Insulin (51) Pancreatic Hormone

(used in treatment of diabetes) <>

Một số peptit tự nhiên có hoạt tính sinh học

Cấu trúc bậc 1 của insulin (bò)

Chain A: GIVEQCCASVCSLYQLENYCN

Chain B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA

CẤU TRÚC BẬC HAI PROTEIN

Vòng cung 

( turn)

Đặc điểm cấu trúc bậc 2 protein:

• Sự quay quanh C*→ cuộn mạch peptit

• Liên kết làm bền cấu trúc bậc 2: liên kết hydrogen dọc trục

• Liên kết hydrogen yếu: Cấu trúc bậc 2 không bền

• Protein có thể chứa các dạng cấu trúc bậc 2 khác nhau

Xoắn 

( spiral)

• Cấu trúc bậc 2 phổ biến của

protein

• Cấu trúc xoắn: lk peptit tạo khung

xương, nhóm bên R quay ngoài

- Khoảng cách hai sợi: 3,5 Å

- Bền nhiệt

Cacbonic anhydrase

- Bước xoắn: 0 Å

• Các liên kết yếu làm bền cấu trúc

• Cấu trúc bậc 3 bao gồm các dạng cấu trúc bậc hai trong mạch

-Sheet Xoắn 

Cấu trúc bậc 4 protein

-Protein bao gồm một hay nhiều chuỗi peptit ( một chuỗi peptit: 1 dưới đơn vị-subunit)

- Các liên kết yếu + cộng hóa trị làm bền cấu trúc

Protein bao gồm các subunit giống nhau

Protein tạo từ các subunit khác nhau

Hemoglobin

• 2  globin subunits

• 2  globin subunits

Tổng kêt liên kết trong phân tử protein

- Các gốc a.a kỵ nước (không cực): xu hướng cuộn vào trong, tránh không

tiếp xúc phân tử nước

- Các gốc a.a háo nước : Tạo liên kết hydrogen với nhau, với nước, với các

- Albumin…

Kháng thể: Antibody:

• Protein do hệ miễn dịch sinh

ra, gắn với phân tử lạ với cơ thể (vi khuẩn, virus-kháng

nguyên-antigen

• Gắn đặc hiệu với

antigen, trung hòa

Khối lượng phân tử

Protein: > 10,000 Da- 10 KDa: cao phân tử/polyme

- pH>pI: protein tích điện (-)

- pH<pI: Protein tích điện (+)

Tính tan của Protein

- Phụ thuộc gốc R (tính tan axitamin thành phần, cấutrúc cuộn Pr)

- Phụ thuộc pH môi trường, tại pI, độ tan nhỏ

- Loại dung môi: phân cực mạnh (nước, glycerol,

formic)

- Nồng độ thấp: tăng tính tan: salting in

- Nồng độ muối cao: kết tủa protein: salting out

Kết tủa protein:

Sữa chua: pH giảm do VSV lên men

đường: protein sữa đông tụ Đậu phụ: pH giảm khi thêm nướcchua: protein đậu nành đông tụ

Tác động của pH

- Thay đổi khả năng ion hóa của protein → thay đổi liên kết ion trong tạo cấu trúc protein→ bộc lộ nhóm ưa/kỵ nước →thay đổitính tan Pr

- pH gần pI: Pr trung hòa điện, khả năng hòa tan giảm: kết tụ

• Kết tủa protein bởi hiệu ứng salting out

Bổ sung muối (NH4)2SO4/Na2SO4/NaCl…

• Cạnh tranh kết hợp phân tử nước

• Tách vỏ hydrat của protein → Protein kết tủa

• Mw cao, , nồng độ muối cho kết tủa nhỏ

• Kết tủa bởi dung môi hữu cơ

• Tách vỏ hydrat của protein → Protein kết tủa

• Kết tủa bởi kim loại nặng (gây độc)

• Ion kim loại nặng tích điện dương (Pb+2, Hg+2, Fe+2, Zn+2, Cd+2 )

• Protein tích điện (-) (pH>pI)

• Tạo liên kết ion với KL, gây kết tủa protein

• Kết tủa protein bởi anion: Axit Tricloacetic (TCA), Axit Sulphosalicylic

– Protein tích điện (+) trong môi trường axit (pH<pI)

– Liên kết ion tạo phức, kêt tủa protein

Khả năng hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại

– Các protein/peptit hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại

– Tỉ lệ với nồng độ (định luật Lambertbeer)

– Bước sóng đặc trưng (cho độ hấp thụ mạnh nhất) khác nhau

• Axit amin: 270-273 nm

• Peptit/Protein: 280 nm - Xác định hàm lượng protein chung

- Phát hiện protein trong sắc ký…

Khái niệm:

Biến tính protein là sự thay đổi cấu trúc không gian (cấu trúc bậc cao) do đứt gãy

hoặc thay đổi liên kết thứ cấp của protein dưới tác động của các yếu tố môi trường(lưu ý cấu trúc bậc 1 không đổi), dẫn đến thay đổi tính chất, mất chức năng sinh học của Protein

Sự biến tính (denaturation) của protein

- Sự biến tính có thể thuận nghịch tùy vào tác nhân gây biến tính (cơ chế biến tính)

Tác nhân biến tính protein

Vật lý:

• Nhiệt độ >50oC: tăng chuyển động nhiệt, phá vỡ liên kết hydrogen

• Tia năng lượng: phá vỡ lk yếu

• Áp suất thủy tĩnh

• Cơ học: phá vỡ lk yếu

Hóa học:

• pH/axit bazơ: thay đổi liên kết ion, cầu muối

• Dung môi: thay đổi liên kết hydrogen, lk kỵ nước, Van der Waal

• Chất khử (urea, hydroclorit guanidine): tạo mới lk hydrogen, phá hủy cầu S-S

• Muối: cạnh tranh lk hydrogen với phân tử nước

• Kim loại nặng: thay đổi liên kết cầu ion với protein, cầu S-S

Bất thuận nghịch

Thuận nghịch

Tác nhân biến tính Liên kết bị phá hủy Ví dụ quá trình

Liên kết kỵ nước Kết tủa protein trong

ethanol ,dung môi hữu cơ

Cầu S-S

(tạo liên kết ion)