Sau đây là kết quả nghiên cứu xác định nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở miền Bắc Việt Nam.. Xác định nhóm chủng tương đồng của vi khuẩn Xanthomonas oryzae nhờ kỹ thuật PCR RAPD
Trang 1Sự ĐA DạNG DI TRUYềN MộT Số CHủNG VI KHUẩN
Xanthomonas oryzae GÂY BệNH BạC Lá LúA ở MIềN BắC VIệT NAM
Genetic pathogenicity of the strain of Xanthomonas oryzae
caused bacterial leaf blight in northern Vietnam
Nguyễn Văn Viết Đặng Thị Phương Lan
Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam
Abstract
Bacterial leaf blight cause by Xanthomonas oryzae is a destructive disease of rice in Vietnam
Breeding for resistance to disease has become one of the important issue Therefore, research on
strains of Xanthomonas oryzae is required to generate information on the pathogen
Seventy infected leaf samples were collected from different rice varieties grown in different
ecological region of Northern Vietnam 60 isolate of Xanthomonas oryzae were isolate by isolation and PCR method, there are 13 different strains groups of Xanthomonas oryzae were identified Groups
of strain 2 and 3 were recorded with highest frequency of occurrence (14,89%)
Key words: Genetic pathogenicity, bacterial leaf blight, rice
I Đặt vấn đề
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas
oryzae pv oryzae gây ra là bệnh nhiệt đới điển
hình của các vùng trồng lúa Bạc lá lúa trở thành
đối tượng gây hại nghiêm trọng đối với cây lúa,
đặc biệt là trong vụ mùa ở miền Bắc Việt Nam
Mặc dù số lượng các giống lúa thuần, lúa lai gieo
cấy trong sản xuất khá lớn nhưng tỷ lệ các giống
có khả năng kháng bệnh rất thấp Với xu thế ngày
càng mở rộng các giống có thời gian sinh trưởng
ngắn và các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc
không có khả năng kháng bệnh, khả năng phát
sinh các dịch bệnh nặng rất dễ xảy ra Nghiên
cứu chọn tạo giống lúa vừa đáp ứng được các yêu
cầu về thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao,
chất lượng tốt và có khả năng kháng bệnh trở
thành nhu cầu bức xúc
Để chọn giống kháng bệnh bạc lá cần, xác
định các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá và các
gen kháng bệnh Cho đến nay trên thế giới đã
phát hiện được nhiều gen kháng bệnh bạc lá khác
nhau ở mỗi vùng, thậm chí trong cùng một vết
bệnh cùng tồn tại một số chủng gây bệnh ở Việt
Nam, thường xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn gây
bệnh bạc lá có độc tính cao và có sự đa dạng về
chủng rất lớn Sau đây là kết quả nghiên cứu xác
định nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở miền Bắc Việt Nam
II Vật liệu
và phương pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu: Mẫu bệnh bạc lá được thu thập trên các giống lúa ở các vùng sinh thái
khác nhau
Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh:
Phân lập vi khuẩn gây bệnh trên môi trường Wakimoto Sau khi xuất hiện khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc có hình dạng tròn, nhẵn bóng, lồi lên, kích thước 1 – 2 mm, màu vàng chanh, là đặc
trưng khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonnas
oryzae để cấy truyền Bảo quản Isolate đã phân
lập trên môi trường Skim milk
Phương pháp xác định vi khuẩn bạc lá bằng kỹ thuật PCR: tiến hành chiết xuất AND của vi khuẩn
Nhân gen PCR bằng mồi đặc hiệu để nhận biết đoạn trình tự 16S – 13S rDNA có mặt đặc thù trong DNA vi khuẩn bạc lá với trình tự mồi đặc hiệu XOR-F:5’- CATGACGTCATCGTCCTGT-3’ XOR-R2:5’-CTCGGAGCTATATGCCGTGC-3’ STT Tên m Trật tự mồi
Trang 22 XPC9 5’CTCACCGTCC3’
Điện di sản phẩm trên gel agarose 2% ở 65V,
150mA trong vòng 20 phút; Nhuộm bản gel bằng
Ethilium bromide rồi chụp ảnh để xác định các
Isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae
Xác định nhóm chủng tương đồng của vi
khuẩn Xanthomonas oryzae nhờ kỹ thuật PCR
(RAPD): sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để nhân các
đoạn AND ngẫu nhiên trong bộ gennom vi khuẩn
Xanthomonas oryzae
Sau khi có kết quả điện di tiến hành xử lý số
liệu bằng phần mềm NTSY spc2.0
III Kết quả và thảo luận
3.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh, phân lập
vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae trên
môi trường và xác địnhvi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR
Kết quả bảng 1 cho thấy, 70 mẫu bệnh bạc lá
đã được thu thập trên nhiều giống lúa khác nhau
từ nhiều địa phương khác nhau ở 3 vùng sinh thái chính của miền Bắc Việt Nam là miền núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ Kết quả phân lập trên môi trường và căn cứ và hình thái khuẩn lạc cho thấy có 65 mẫu bệnh khi
phân lập đã xác định có vi khuẩn Xanthomonas
oryzae là nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa Có 5
mẫu khi phân lập không thấy sự hiện diện của vi
khuẩn Xanthomonas oryzae
Bằng kỹ thuật PCR đã xác định được 60 mẫu
có vi khuẩn tương đồng với bộ genom của vi
khuẩn Xanthomonas oryzae 60 mẫu xác định có
Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật PCR hoàn
toàn trùng lặp với kết quả phân lập trên môi trường nhân tạo
Bảng 1 Kết quả thu thập mẫu bệnh, phân lập trên môi trường và
xác định vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật PCR
thập
Kết quả phân lập trên môi trường
Kết quả xác định bằng PCR
phía Bắc
Trang 3TT Mã số Vùng
thập
Kết quả phân lập trên môi trường
Kết quả xác định bằng PCR
bằng sông Hồng
Trang 4TT Mã số Vùng
thập
Kết quả phân lập trên môi trường
Kết quả xác định bằng PCR
Trung Bộ
Ghi chú: + Phân lập thành công, kiểm tra PCR đúng là vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
- Phân lập không thành công, kiểm tra PCR không phải là vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
Ghi chú: Những giếng có vệt sáng là AND được nhân lên của vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv oryzae Hình 1: Hình ảnh chạy điện di phát hiện vi khuẩn gây bệnh bạc lá
3.2 Xác định các nhóm chủng vi khuẩn
Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa
Để xác định các nhóm chủng, đã chọn 47
isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae có độc tính
cao trong số 60 isolate đã được xác định là
Xanthomonas oryzae Qua phân tích bằng 10
đoạn mồi khác nhau để nhân các đoạn AND
trong bộ genom của vi khuẩn Xanthomonas
oryzae cho thấy có 4 mồi cho các băng đa hình là
XPC15, PAG01, XPC9 và OPEF3 Các mồi còn
lại hoặc là không nhân lên được đoạn AND nào
hoặc là chỉ có 1 đoạn, không có ý nghĩa trong
việc xác định đa hình AND Những mồi đa hình được ghi lại số băng, trong đó có vệt băng là 1 và không có vệt băng là 0 Mồi XPC9 va XPC15 nhân được 3 đoạn AND trong bộ genom vi khuẩn; mồi OPAF3 nhân được 4 đoạn, còn mồi PAG1 nhân được 5 đoạn Sử dụng phần mềm NTSYS 2.0 đã cho cây phân loại của 47 isolate
Từ cây phân loại 1 và 2 và ở mức tương đồng 0,7
47 isolate vi khuẩn được chia thành 13 nhóm đại diện cho 13 nhóm chủng trong 47 isolate phân tích (Hình 1 và 2)
Số liệu phân tích trên bảng 2 cho thấy trong số
Trang 513 nhóm chủng, nhóm 2 và 3 phổ biến nhất (mỗi
nhóm chiếm 14,89%); Nhóm chủng 1, 4, 5 7,8,9
chiếm tỷ lệ trung bình (từ 6,38 – 8,51%); Nhóm
chủng 10, 11, 12 và 13 chiếm tỷ lệ ít nhất (2,12 –
4,25%)
Sự phân bố của các nhóm chủng ở các địa
phương khá đa dạng, thường đan xen Một chủng phân bố ở nhiều địa phương, một địa phương có
sự hiện diện của nhiều nhóm chủng Do đặc điểm này cần bố trí cơ cấu giống lúa đa dạng với đặc điểm di truyền, đa dạng về tính kháng để hạn chế tác hại của bệnh
Bảng 2 Các nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae và sự phân bố
của chúng ở các địa phương
Nhóm
Thái Bình
Định
Thanh Hóa
Bình
Trang 6
1
19
12
32
34
21
26
2
3
5
27
22
7
8
18
14
23
38
16
36
24
28
17
35
25 11
13
15
30
31
Hình 1 Cây phân loại 30 isolate vi khuẩn bạc lá
Coefficient
39
49
40
59
42
52
61
65
63
64
41
55
47
53 350
60
54
Hình 2 Cây phân loại 17 isolate vi khuẩn gây bệnh bạc lá
Trang 7Hình 3 Điện di sản phẩm RAPD sử dụng mồi XOP15
Hình 4 Điện di sản phẩm RAPD sử dụng mồi APG01
Hình 5 Điện di sản phẩm RAPD sử dụng mồi XPC9
Trang 8IV Kết luận
- Dựa vào đặc điểm hình thái của khuẩn lạc
trên môi trường nhân tạo và phân tích bằng ký
thuật PCR đã xác định được 60 isolate vi khuẩn
Xanthomonas oryzae trong số 69 mẫu bệnh bạc
lá lúa thu thập từ một số vùng trồng lúa
Xanthomonas oryzae thu thập từ địa phương ở
miền Bắc Việt nam đã xác định được 13 nhóm
chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh
bạc lá lúa Trong số 13 nhóm, nhóm 2 và 3 phổ
biến nhất (mỗi nhóm chiếm 14,89%)
- Các nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá
phân bố đan xen, 1 nhóm chủng có thể xuất
hiện ở nhiều địa phương, 1 địa phương có thể
có nhiều nhóm chủng Để hạn chế tác hại của
bệnh cần đa dạng nguồn gen lúa và bố trí đa
dạng các giống kháng trong một vùng
Tài LIệU THAM KHảO
1 Phan Hữu Tôn, Bùi Trọng Thuỷ Khả năng gây nhiễm của các chủng bệnh bạc lá lúa miềm Bắc Việt Nam Hội thảo Quốc gia bệnh cây và sinh học phân tử ĐH Nông nghiệp 1, 23-25/10/2003 NXB NN, 2003 78-86
2 Nguyễn Văn Viết và CTV Một số kết quả nghiên cứu thành phần nhóm nòi sinh lý vi
khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae ở miền
Bắc hiện nay và xác định nguồn gen kháng bệnh giai đoạn 199-2001 Kỷ yếu hội thảo Quốc gia về khoa học công nghệ bảo vệ thực
