Những đột biến gen gây thiếu hụt steroid 21-hydroxylase ở một bệnh nhi có hội chứng cường thượng thận bẩm sinh thể mất muối, mất nước Nguyễn Thị Ngọc Dao 1 , Nguyễn Thị Hoàn 2 , Rita B
Trang 1Những đột biến gen gây thiếu hụt steroid
21-hydroxylase ở một bệnh nhi có hội chứng cường
thượng thận bẩm sinh thể mất muối, mất nước
Nguyễn Thị Ngọc Dao 1 , Nguyễn Thị Hoàn 2 , Rita Bernhardt 3 , Ebert Schulze 4
2 Viện Nhi khoa Trung ương
4 Phòng xét nghiệm gen học phân tử của Prof F.Raue,Heidelberg - CHLB Đức
i Đặt vấn đề
Cường thượng thận bẩm sinh là một bệnh do
sự sai lệch di truyền trong sinh tổng hợp
cortisol gây ra Bình thường cortisol được tổng
hợp từ cholesterol trong vùng bó của vỏ thượng
thận với 5 bước có sự xúc tác của các enzym
khác nhau Đầu tiên chuỗi bên của cholesterol
được phân cắt bởi phản ứng do cholesterol
desmolase xúc tác tạo ra pregnenolone, chất
này sau đó được khử hydro ở vị trí 3β để tạo
thành progesterone, 2 phản ứng thủy phân ở 2
vị trí 17- α và 21 của progesterone tiếp theo sẽ
tạo ra 11 deoxycortisol, chất này sau đó chuyển
thành cortisol do phản ứng xúc tác bởi
11β-hydroxylase (P450c11) Tất cả các enzym xúc
tác các bước trên đều có thể có sự thiếu hụt do
đột biến gen nhưng phổ biến nhất là
21-Hydroxylase và 11 β-21-Hydroxylase
Sự thiếu hụt 21-hydroxylase dẫn tới giảm
lượng glucocorticoid thượng thận, trước hết là
giảm cortisol Sự tổng hợp mineralocorticoid
cũng giảm Mất muối là do thiếu
mineralcorticoid ở ống lượn xa, nơi mà Na+
được tái hấp thụ từ cầu thận và K+, H+ được thải
ra Triệu chứng lâm sàng là mất Na+ và nước,
toan chuyển hoá và hạ Na+ huyết, tăng K+ do
thiểu năng thận Triệu chứng rối loạn đặc trưng
là mất nước trầm trọng đến mức đe doạ tính mạng, nôn mửa và ỉa chảy trong vài tuần đầu tiên của cuộc sống Vào khoảng 1/3 các trường hợp CAH cổ điển là có khả năng sản xuất đủ mineralcorticoid để hạn chế mất muối [2] Biểu hiện khác về mặt sinh hoá của CAH là sự tăng sản phẩm androgen thượng thận, vì sự tổng hợp hormon này không cần 21-hydroxylase xúc tác
và sự tổng hợp tăng lên khi con đường chuyển hoá cần 21-OHD bị chặn Vì không có sự điều hoà ngược âm bởi cortisol nên tuyến yên và vùng dưới đồi tăng cường tổng hợp ACTH, chất này kích thích vỏ thượng thận và gây ra sự phì
đại tuyến, mặt khác do con đường chuyển hoá bình thường bị khoá do thiếu men 21-Hydroxylase nên lại càng tăng tổng hợp androgen thượng thận Những ảnh hưởng này xảy ra trong dạ con và kết quả là gây ra các mức độ nam hoá khác nhau ở bộ phận sinh dục ngoài của bào thai và trẻ sơ sinh gái Trẻ trai bị bệnh nói chung có thể coi là bình thường khi mới sinh
Gen mã hoá cho P450c 21 được ký hiệu là CYP 21 Còn có một bản sao giống hệt với CYP 21 được ký hiệu là Cyp 21P, gen này có 98% phù hợp với CYP 21 trong thứ tự nucleotid
ở các exon Tuy nhiên CYP 21 P là gen không
Trang 2hoạt động, có tới 15 dạng đột biến bao gồm đột
biến mất 8 bp ở exon 3, một đột biến ở vị trí
gắn của intron 2, thêm 1 Thymidin (T) vào
exon 7, một đột biến vô nghĩa C→T ở codon
318 một số đột biến điểm gây ra mất đoạn ở
exon 6 (missense mutation) Những đột biến
liên quan đến biểu hiện mất muối thường là đột
biến làm biến đổi Arg 356 Trp Đột biến ở
intron 2 có thể tìm thấy trong bệnh nhân mất
muối hoặc nam hoá đơn thuần Đột biến Ile
172 Asp liên quan với nam hoá đơn thuần trong
khi Pro 30 leu và Val 281 Leu thường được
thấy trong bệnh nhân dạng cổ điển
Cả 2 gen này nằm trên nhiễm sắc thể 6 P
21.3, liền kề và xen kẽ với gen C4A và C4B mã
hoá cho cấu tử thứ 4 của bổ thể huyết thanh
Cho đến nay người ta đã công bố 56 đột biến
khác nhau của CYP 21
Vì 21-hydroxylase chỉ biểu hiện ở vỏ
thượng thận nên rất khó xác định hoạt tính
enzym này trong máu hoặc tổ chức
Progesteron và 17-OHP là những hợp chất được
tích lũy và tăng cao ở bệnh nhân thiếu hụt
enzym cyp 21-Hydroxylas Việc định lượng
các nội tiết tố trên cũng là những xét nghiệm
quan trọng giúp cho chẩn đoán
Gần đây, chẩn đoán gen học phân tử của
bệnh thiếu hụt 21-hydroxylase qua sự phân tch
trực tiếp gen CYP 21 đã được khảo nghiệm là
phù hợp và chính xác Phương pháp phân tích
gene tiến hành qua 2 bước: Bước thứ nhất, một
đoạn gen đặc hiệu CYP 21 được nhân ra, đoạn
này sẽ trở thành khuôn cho phản ứng phát hiện
đột biến ở bước 2 Sự khuếch đại đặc hiệu CYP
21 thường được tiến hành bởi những mồi đặc
hiệu allele, kết quả thu được 2-3 đoạn khuôn
Sản phẩm PCR sau đó là đối tượng để tìm đột
biến bằng các phương pháp khác nhau như: lai
các nucleotid đặc hiệu allele, SSCP
(single-strand conformation polymorphism) hoặc đọc
trình tự trực tiếp DNA
ii Vật liệu và phương pháp nghiên cứu:
Mẫu DNA tách từ máu tĩnh mạch (chống
đông bằng EDTA) theo phương pháp chuẩn sử dụng phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) Hàm lượng và độ sạch của DNAsau khi tách được kiểm tra bằng quang phổ ở 2 bước sóng 260/280 nm và điện di gel agarose 0,8% Sau đó 2 đoạn gen đặc hiệu 21-OH( fragment III ở exon 6 và I ở exon 3) được khuếch đại bằng phản ứng PCR.Các cặp mồi cyp5/cyp14 và cyp 11/cyp12 đã được sử dụng
Trình tự các cặp mồi:
cyp-5:5’ AGC TAT AAG TGG CAC CTC AGG 3’
cyp-11: 5’ CTT GGG AGA CTA CTC CCT GCT 3’
cyp-12: 5’ GTT CGT ACG GGA GCA ATA ÂAG 3’
cyp -14 :5’ GCA TCT CCA CGA TGT GA 3’
Chương trình chạy:
94oC trong 4 phút
94oC trong 45 giây
56 oC trong 45 giây x 25 lần
72 oC trong 2,5 phút
94oC trong 45 giây
58 oC trong 45 giây x 10 lần
72 oC trong 4 phút
10oC kết thúc Sản phẩm PCR dài khoảng 700-850 bp
được đọc trình tự trực tiếp trên máy DNA sequencer của hãng Global Edition IR29(NEN) Readir 4200 để tìm các đột biến Mỗi bản gel acrylamid cùng lúc phân tích trình tự được 15
Trang 3mẫu DNA (60 giếng).Sử dụng chất đánh dấu
huỳnh quang đê phát hiện các base nucleotid
iii Kết quả
Kết quả đọc trình tự gene cho thấy: Tất cả
các thành viên trong gia đình bệnh nhân đều
có đột biến gen CYP 21 với các thể loại khác
nhau Dưới đây là kết quả cụ thể của từng người:
Hình 1: Sơ đồ về sự di truyền các đột biến gen CYP 21ở gia đình bệnh nhân Ngo Đuc M
Mẹ
Dị hợp tử
12 (nt 656) G/C
Bố
Dị hợp tử P30L, 12 (nt 656) G/A, mất đoạn 8 cặp base (cả 3 đột biến này nằm trên một allel)
Bệnh nhân Em trai bệnh nhân: dị hợp tử
Đột biến nhận từ bố: P30L,
12 (nt 656) G Mất đoạn 8bp (exon 3)
Đột biến nhận từ mẹ:
12(nt 656) G
Vị trí 12 (nt 656) G/G đồng hợp tử
Dẫn tới:
- 0% hoạt tính enzym 21-OH
- Mất muối
Đột biến 12 (nt 656) G/A
nhận từ mẹ nhận từ bố
Khỏe mạnh về lâm sàng
Ghi chú: 12 (nt 656) G là bệnh lý, 12 (nt
656) A hoặc C là bình thường
Bệnh nhân Ngô Đức M.:
Trên Allel 1: Đột biến điểm ở nucleotid 656 (A/C →G) ở intron 2 của CYP 21 (gen hoạt
động của 21-hydroxylase) A hoặc C là polymorphismen bình thường, G là bệnh lý
Đột biến ở intron 2 dẫn tới sự rối loạn cơ chế
Trang 4gắn (splicing-mechanismus) và dẫn tới sự đứt
quãng trong tổng hợp protein
Trên Allel 2: Có 3 đột biến gồm:
- Đột biến điểm ở codon 30 (CCG → CTG)
làm thay đổi aminoacid từ Prolin thành leucin
(pro 30 leu) trong exon 1 của CYP 21
- Đột biến điểm ở vị trí 656 (A/C → G) ở
intron 2 của CYP 21
- Mất đoạn 8 bp (GÂGACTAC) ở exon 3
3 đột biến này phù hợp với sự trao đổi ADN
đáng kể giữa CYP 21 và CYP 21P Những đột
biến này cũng nằm trên allel của cha Do đột
biến ở intron 2 (vị trí 656) và mất đoạn ở exon
3 nên cả 2 allele hoàn toàn bất hoạt.Từ đó có
thể khẳng định bệnh nhân Ngo Đức M bị bệnh
CAH thể cổ điển với triệu chứng mất muối
Bố bệnh nhân ( Ngô Văn.Th.):
Đột biến điểm dị hợp tử ở codon 30 (CCG
→ CTG) với sự thay đổi Pro 30 thành leu
trong exon 1 của CYP 21
Đột biến điểm dị hợp tử ở nucleotid 656 (A
→G) ở intron 2 của CYP 21 (gen hoạt động
của 21-hydroxylase), G là bệnh lý, A là bình
thường
Mất đoạn gen dị hợp tử của 8 bp
(GAGACTAC) ở exon 3 của CYP 21
Tất cả 3 đột biến này nằm trên cùng một
allele và di truyền cho con là Ngô Đức M
Mẹ bệnh nhân, (Hoàng Thị Hiền L).:
Đột biến điểm dị hợp tử ở nucleotid 656
(G/A) ở intron 2 G là bệnh lý, A là bình
thường
Như vậy là cha và mẹ bệnh nhân đã di
truyền dị hợp tử cho con và bệnh ở con họ là
thiếu hụt 21-hydroxylase thể cổ điển (classic)
Em trai bệnh nhân,( Ngô Minh Q).:
Đột biến điểm dị hợp tử ở codon 656 (G/A)
ở itron 2 Đột biến này nằm trên allele của mẹ, không có ở allele do bố di truyền nên Ngô Minh Q là người mang dị hợp tử của nguy cơ bệnh thiếu hụt 21-hydroxylase thể cổ điển Bệnh nhi là con trai đầu, già tháng, phải mổ
đẻ 18 ngày tuổi đã phải cấp cứu vào viện do quấy khóc, bỏ bú Khám tháy da khô, thóp lõm Trẻ tỉnh táo nhưng mệt,vã mồ hôi, chân tay lạnh Da đen xạm nhất là vùng bộ phận sinh dục.Chẩn đoán ban đầu là viêm phế quản va theo dõi hội chứng sinh dục thượng thận Xét nghiệm máu cho thấy Na+ giảm (112mmol/l), K+ tăng (>7 mmol/l), testosteron cao (14,6nmol/l), progesteron 17,4nmol/l Điều trị bàng DCA tiêm và Prednisolon Dựa vào các dấu hiệu lâm sàng, các bác sĩ đã chẩn đoán bệnh nhi bị hội chứng sinh dục thượng thận thể mất muối, nước Bố mẹ và em của bệnh nhi đều không có biểu hiện bệnh lý Qua phân tích gen mới biết được cả bố mẹ và em bệnh nhân đều
là người mang gen bệnh dị hợp tử
Chẩn đoán phân tích gen là phương pháp hiện đại giúp phát hiện và phân loại bệnh một cách chính xác để có hướng điều trị đúng.Từ bệnh nhân có thể phát hiện các thành viên có liên quan di truyền trong gia đình là những người dị hợp tử có mang gen bệnh.Trên cơ sở
đó có thể quản lý,theo dõi được bệnh nhân cũng như người lành mang bệnh Góp phần tư vấn phòng tránh nguy cơ di truyền các đột biến tạo thành bệnh và có thể chủ động diều trị bầng Dexametason cho người mẹ có nguy cơ ngay từ khi mang thai.Hiện nay,các nhà khoa học đang nghiên cứu liệu pháp điều trị gene cho một số bệnh di truyền,trong đó có bệnh thiếu hụt 21-Hydroxylase ở nhiều nước trên thế giới, thiếu hụt 21-hydroxylase đã được đưa vào chương trình sàng lọc sơ sinh để phát hiện sớm và điều trị kịp thơi giúp trẻ có thể có cuooc sống tốt hơn.Những chẩn đoán trước sinh có giá trị quan trong trong điều trị các thai nhi gái trong việc hạn chế biểu hiện bệnh
Trang 5Những nghiên cứu phân tích gene trên số
lương lớn bệnh nhân để tìm dạng đột biến đặc
trưng cho cộng đông hoặc tìm ra các dạng mới
ở người Việt nam cũng là việc làm cần thiết để
góp phần tìm hiểu đặc điểm di truyền,cơ sở
phân tử của bệnh đồng thời góp phần vào chẩn
đoán nhanh,chính xác và điều trị có hiệu quả
căn bệnh này
Tài liệu tham khảo
1 Maria I, New at al Prenatal Diagnosis
for congenital adrenal hyperplasia in 532
Pregnancies: Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism 2001, 86 (12):
5651-5657
2 Lee HH: CYP 21 mutations and
congenital adrenal hyperplasia Clinical
Genetics 2001, 59: 293-301
3 Paulo Ferrez Collett –Solberg CAH: From genetics and Biochemistry to clinical
practice Part I and II Clin.Pediatrics 2001,
40: 1-16 and 125-132
4 Perin C.White and Phyllis W.Speiser: CAH due to 21-hydrroxylase deficiency
Endocrine Reviews 2000, 21: 245-291
5 Weisenpecharova R Abtracts of 2nd
international FEBS advanced course: Cyt-P450 systems: from Structur to application Distribution of CYP 21 gene mutatión in Slovak Patients with Congenital adrenal hyperplasia (enzym P450C21deficiency) 2002
6 Catherine E Keegan and Anthony A.Killeen.An Overrview of molecular diagnosis of steroid 21-Hydroxxylase deficiency Journal of molecular diagnostics
2001, Vol.3 N 2; May 2001: 49-54
Summary
The mutations caused steroid 21-hydroxylase
deficiency on a patient with symptom of congenital
adreanal hyperplasia-SW
Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is a common inherited disorders of adrenal steroidogenesis caused maindly by defecfs in the steroid 21- hydroxylase (CYP21) gene More than 90% of CAH cases are caused by mutations of the CYP 21 gene on chromosome 6 p 21.3 The wide range of CAH phenotype is associated with multiple mutaion known to affect 21- Hydroxylase enzyme activity To date, 56 different CYP-21 mutations have been reported, mostly point mutations, but small deletation or insertions have been described too, as well as complete gene deletions A reliable and accutate detection of CYP 21 mutation is not only important for clinical diagnosis, but also for carrier detection as there is a high variability in the basal level of 17- hydroxy progesterone between normal and heterorygous individuals Several strategies based on polymerase chain reaction (PCR)- driven amplification with allele- specific oligonucleotides to the CYP 21 gene have been developed.There is a direct relation between the severity of the disease and the reduction in enzym activity caused by mutations
In this article, the DNA sequence results of a patient with CAH ( salt wasting variation) and his family members have been described This patient have been in herited all mutations from his parents This results are agreed with clinical diagnosis and experimental estimation of blood and urine hormon levels
Keyword: 21-Hydroxylase,CAH,CYP 21 mutations
