Trong bài này, bằng kỹ thuật PCR và điện di trên bản gel polyacrylamide biến tính, chúng tôi đã xác định sơ bộ tần suất các allen của locus D13S317.. - Sử dụng kỹ thuật điện di trên gel
Trang 1Bước đầu khảo sát tần số phân bố alen của gen
D13S317
Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lương Thị Yến
Cục Kỹ thuật Hóa-Sinh Bộ Công an
D13S317 là đoạn ADN đa hình có trình tự lặp lại 4 đôi bazơ nitơ nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 13 Locus này chứa 9 alen, có độ dài từ 242 đến 270bp Người ta đã xác định được số
đoạn lặp lại trong quần thể người là 7,8,9,10,11,12,13,14 và 15 Trong bài này, bằng kỹ thuật PCR
và điện di trên bản gel polyacrylamide biến tính, chúng tôi đã xác định sơ bộ tần suất các allen của locus D13S317
I Đặt vấn đề
Ngày nay, việc nghiên cứu ứng dụng các
đoạn lặp, đặc biệt là các đoạn lặp ngắn (STR)
trong hệ gen người đã trở thành phổ biến trong
việc xác định cá thể người, xác định huyết
thống cha con, truy tìm người mất tích qua hài
cốt, xây dựng tàng thư gen tội phạm để phục
vụ các yêu cầu của tố tụng hình sự và dân sự
Các đoạn lặp của hệ STR thường có chiều
dài 2-7 cặp bazơ [4] ở mỗi cá thể khác nhau,
số lượng đoạn lặp khác nhau, do vậy mà người
ta coi đây là đặc điểm cơ bản để xác định sự
khác biệt giữa người này với người khác [3]
Ưu điểm của các đoạn lặp lại ngắn là khá bền
vững, có thể thực hiện nhân gen tổ hợp của các
đoạn gen khác nhau trong cùng một phản ứng
và phù hợp với các mẫu hình sự [2] Gen
D13S317 là gen có những đặc điểm như vậy
Sử dụng kỹ thuật PCR và điện di chúng tôi
đã xác định được các alen của gen D13S317
[1]
Mục tiêu nghiên cứu:
- Nghiên cứu các điều kiện PCR tối ưu để
nhân bội đoạn gen D13S317
- Sử dụng kỹ thuật điện di trên gel Polyacrylamide biến tính để xây dựng thang allen cho locus di truyền D13S317
- Khảo sát sơ bộ tần xuất allen của locus D13S17 ở một số người Việt Nam
II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1 Đối tượng
Máu tươi được lấy trực tiếp từ những người khoẻ mạnh, không có quan hệ họ hàng huyết thống Các cá thể này là người Việt được phân
bố ở các vùng địa lý khác nhau
2 Phương pháp
a Tách chiết ADN
Tiến hành tách theo phương pháp dùng phenol và chloroform [5]
Sản phẩm ADN sau khi tách được xác định nồng độ bằng quang phổ kế, kết quả cho thấy:
- Nồng độ tối thiểu: 10,5ng/àl
- Nồng độ tối đa: 290,5ng/àl
- Nồng độ trung bình: 150ng/àl
Trang 2Độ tinh sạch trung bình tính bằng chỉ số OD
trên 1,75; đảm bảo chất lượng cho các nghiên
cứu tiếp theo
b Phản ứng nhân gen (PCR)
- Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho locus
D13S317 do hãng Geneset Singapore Biotech
cung cấp
- Taq-polymerase, 10X PCR buffer và
dNTPs của hãng Pharmacia
- Hỗn hợp phản ứng PCR:
10X PCR Buffer : 2,5àl
Mồi xuôi : 1,0àl
Mồi ngược : 1,0àl
dH2O : 16,8àl
ADN khuôn : 1,0àl
- Thực hiện phản ứng nhân gen trên máy Geneamp-PCR System 9700 của hãng Perkin Elmer (Mỹ) hoặc máy Eppendorf (Mỹ)
Chu trình nhiệt:
95o - 5 phút x 1 chu kỳ
58o - 1 phút
72o - 1 phút x 35 chu kỳ
94o - 1 phút
58o - 1 phút x 1 chu kỳ
72o- 10 phút
4o
c Điện di và xác định alen
* Kỹ thuật điện di:
Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR
đã được kiểm tra trên gel agaroza 2% sau đó
được điện di trên gel polyacrylamide 6% sử dụng ure 7M Băng ADN được phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc của Bassam, 1991 [6]
Hình 1: Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agaroza 2%
* Chọn lọc và xây dựng thang alen-xác định alen:
- Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào
các alen quan sát được của các mẫu khác nhau
trên bản điện di, chúng tôi chọn ra các mẫu
mang các alen khác nhau và đánh số alen theo
thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từ băng
ADN có trọng lượng phân tử thấp nhất đến
băng ADN có trọng lượng phân tử cao nhất) Việc đánh số ở đây chỉ mang tính quy ước sao cho mỗi alen xác định được có ký hiệu riêng, vì
đây là quá trình khảo sát ban đầu chưa có thang alen chuẩn để so sánh
Trang 3- Xây dựng thang alen: Trong quá trình đánh
số, chúng tôi đồng thời chọn ra những mẫu
mang những alen khác nhau tập hợp lại để tạo
thang alen Thang alen được tạo bằng phương
pháp trộn mẫu
- Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các alen đã
khảo sát được theo quy ước quốc tế Alen của
locus D13S317 được ký hiệu từ 7 đến 15 căn cứ
vào số đoạn lặp của mỗi alen
Chúng tôi tiến hành chuẩn thang alen như
sau: lấy kết quả tần suất alen tính được so sánh
với tần suất alen đã khảo sát bằng thang alen
chuẩn theo tài liệu nghiên cứu ở một nhóm người Việt Nam sau đó ký hiệu lại các alen dựa vào tần suất tương đương
III Kết quả
1 Kết quả chọn lọc alen và tạo thang alen
Sử dụng các phương pháp đã nêu, bước đầu chúng tôi đã tạo được thang alen chuẩn cho locus D13S317 Thang alen này (ký hiệu LD) bao gồm 8 alen khác nhau (hình 2) được ký hiệu từ alen số 8 đến alen số 15 theo phương pháp chuẩn alen đã nêu
Hình 2 Thang alen chuẩn của locus D13S317 với 8 alen khác nhau được phân tách bằng kỹ
thuật điện trên gel PA biến tính
2 Kết quả tính tần suất alen của locus D13S317
Kết quả khảo sát của chúng tôi
Số lượng 0 100 31 24 62 50 12 2 1 Tần suất % 0 35.46 10.99 8.51 21.98 17.73 4.25 0.7 0.35
Kết quả khảo sát của nước ngoài đối với người Việt Nam
Tổng số mẫu được khảo sát : 141
- Số cá thể đồng hợp tử : 29
- Số cá thể dị hợp tử : 112
Trang 4- Số allen xác định được : 8allen ( ký hiệu từ
allen số 8 đến allen số 15)
- Allen có tần suất cao nhất là allen số 8 :
35,46%
- Allen có tần suất nhỏ nhất là allen số 15 :
0.35%
IV Bàn luận
Sử dụng kỹ thuật PCR và dùng đôi mồi đặc
hiệu chúng tôi đã nhân bội được đoạn gen di
truyền D13S317 có độ dài từ 242 đến 270 bp
Sản phẩm PCR được điện di trên gel
agaroza 2% Kết quả điện di cho thấy điện di
trên gel agarose các băng ADN hiện rất rõ
nhưng khả năng phân tách các đoạn lặp lại 4 bp
không cao [5]
Sử dụng kỹ thuật điện di trên gel
polyacrylamide biến tính kết hợp với phương
pháp nhuộm bạc [6] là phương pháp thích hợp
để phân tách các đoạn ADN cách nhau 4 bp
của đoạn gen D13S317 Sử dụng phương pháp
này chúng tôi đã chọn được 8 allen khác nhau
để xây dựng thang allen chuẩn theo thang
chuẩn quốc tế [7]
Kết quả khảo sát cho thấy ở gen D13S317
alen số 8 có tần suất cao nhất (35.46%),alen số
15 có tần suất thấp nhất (0.35%), chưa thấy
xuất hiện alen số 7 Tuy nhiên số liệu này cũng
tương đối phù hợp với số liệu khảo sát của các
tác giả [7] khi khảo sát 16 gen hệ STR của
quần thể người Việt
V Kết luận
1 Đã lựa chọn được qui trình PCR tối ưu
để nhân đoạn gen di truyền D13S317
2 Sử dụng sản phẩm PCR cùng kỹ thuật
điện di trên gel polyacrylamide biến tính xây
dựng được thang alen cho locus di truyền D13S317 Thang alen tạo được gồm 8 alen khác nhau ký hiệu từ alen số 8 đến 15
3 Đã khảo sát sơ bộ tần suất alen của locus D13S317 ở 141 mẫu ADN người Việt Nam dựa vào thang alen tạo được
Tần suất khảo sát thu được cao nhất ở alen
số 8,alen số 7 chưa thấy xuất hiện trong số mẫu
đã khảo sát
Tài liệu tham khảo
1 Budowle B., Safantila A., Hochmeister
M N., and Comey C T (1994): The
application of PCR to forensic science, The
PCR 244-256
2 Hammond H at al (1994): Evaluation
of 13 short tandem repeat loci for use in
personal identification application, Am.J Hum
Genet, 55: 175
3 Lewontin R C., Hartl D.L (1991): Population genetics in forensic DNA typing",
Science 254: 1745-1750
4 Lygo J E., Johnson P E J et al (1994): The validation of short tandem repeat (STR) loci for use in forensic casework
Int.J.Legal Med 107: 77-89
5 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis
T (1989): Molecular cloning -Vol 3, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, USA E10 -E12
Electrophoresis in Practice, VCH A Wiley
company, Federal Republic of Germany
287-292
7 Technical manual (1999): Geneprint
fluorescent STR systems, Promega 2-7, 36 –37
Trang 5Summary
Primary determination of allele frequencies of D13S317
locus in Vietnamese population
Repeated sequences in human genome especially short tandem repeat (STR) loci is used increasingly for forensic purpose including individualization, paternity testing, MIA (missing in action) casework and construction of criminal DNA profile In comparison with the traditional methods, STR analysis has many advantages STR loci consist of short repetitive sequence units of 2-7 base pair in length The number of repetitive sequence units is usually different between individuals This is a very important characteristic for individualization Another advantages which makes STR loci become useful for forensic analysis is their stability under changing environmental conditions because of their short length In addition, a PCR for multification of 2-3 STR loci of a DNA sample can be performed well in only one tube
D13S317 is a STR locus which located on the long hand of the chromosome No 13 The locus contains 9 alleles singed after their number of repeat units as 7, 8, 9, 10 ,11, 12, 13, 14, 15 In this report, PCR technique and denaturing polyacrylamide gel electrophoresis were applied for determination of allele frequencies of D13S317 locus The data investigated among 141 Vietnamese DNA samples shows the highest frequency at allele No 8 (35.46%) Allele No 7 has not been observed
