Nghiên cứu tính đa dạng của allele hla - DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction sequence specific primers PCR - SSP ở dân tộc kinh miền trung - Việt Nam Trần Đình Bình 1 , Wang
Trang 1Nghiên cứu tính đa dạng của allele hla - DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction
sequence specific primers (PCR - SSP) ở dân tộc
kinh miền trung - Việt Nam
Trần Đình Bình 1 , Wang Linlin 2 , Lin Weixiong 2 và cộng sự
1 Bộ môn Vi sinh vật Y học, Đại học Y khoa Huế
2 Trường Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc
Sử dụng kỹ thuật khuyếch đại chuỗi gen Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers (PCR - SSP) để nghiên cứu tính đa dạng của sự phân bố allel HLA - DQA1 ở 214 thanh thiếu niên khoẻ mạnh dân tộc Kinh, miền Trung Việt Nam, kết quả cho thấy:
10 allele HLA-DQA1 đã được tìm thấy, trong đó DQA1*0104 là phổ biến nhất với tần suất
là 25.8% và thấp nhất là DQA1*0601 (1%)
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng tính đa dạng allele HLA-DQA1 ở dân tộc Kinh miền trung Việt Nam có tính đặc trưng dân tộc và khác với các dân tộc khác ở Trung Quốc, ở Thái Lan
I Đặt vấn đề
Hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA,
human lymphocyte antigen) nằm trên
nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng
nguyên rất phức tạp, và đa dạng Hệ HLA
không những là tiêu chí di truyền của mỗi
người mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ với
chức năng điều hoà miễn dịch và các bệnh
tật khác Những người không cùng một loại
hình phân bố các allele của HLA thì tính
cảm thụ hay sức đề kháng với một số bệnh
không giống nhau Nhiều tác giả nước
ngoài đã nghiên cứu sự khác biệt về phân
bố allele HLA - DQA1 trong quần thể người
đã phát hiện một số người mang những
allele này sẽ có khả năng cảm thụ, hay đề
kháng với một số bệnh tật nhất định Trong
thực tế, mỗi dân tộc có mỗi bối cảnh di
truyền, yếu tố di truyền khác nhau, cùng
một dân tộc nhưng khác nhau về vị trí địa
lý thì sự phân bố các alleles của hệ HLA
cũng khác nhau [3, 7] ở Trung Quốc đã có
nhiều nghiên cứu về hệ HLA, nhất là sự
phân bố của allele HLA - DQA1 trên nhiều
dân tộc như Hán, Choang, Bố y, Duy Ngô,
Nhĩ, Mãn Thái Lan cũng đã có báo cáo về
vấn đề này, nhưng cho đến nay chưa có báo cáo nào về phân bố allele HLA - DQA1
ở Việt Nam Chúng tôi áp dụng kỹ thuật DCSVkhuyếch đại chuỗi gen Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers (PCR - SSP) để nghiên cứu tính đa dạng của sự phân bố allel HLA - DQA1 ở dân tộc Kinh, miền Trung Việt Nam để góp phần nghiên cứu sự khác biệt về di truyền giữa các dân tộc khác nhau
II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1 Đối tượng nghiên cứu:
Là 214 thanh thiếu niên khoẻ mạnh, tuổi
từ 7 - 36, dân tộc Kinh, cư trú tại các tỉnh Thừa Thiên Huế, Quảng Trị và Quảng Bình
tỷ lệ nam nữ: 1: 1, tuổi bình quân là 14
2 Tách DNA: trên mỗi đối tượng lấy 2ml
máu tĩnh mạch, thêm 0,5ml Natri citrate 3,8% chống đông và dùng phương pháp chiết tách DNA kinh điển có cải tiến là Phenol/chloroform Các bước như sau: Với 2ml máu chống đông, thêm 5ml dung dịch gelatine 3%, trộn đều ủ ở
370C/10 phút, tách lấy phần dịch phía trên,
Trang 2ly tâm 3500 rpm/5 phút, bỏ phần dịch phía
trên, thêm 2ml dung dịch TES 2mm, trộn
đều, thêm 0,5ml dung dịch 10% SDS, trộn
đều, thêm 2ml dung dịch Phenol bão hoà
trong TES Trộn đều, ly tâm 3500 rpm/5
phút, tách lấy phần dịch ở trên (có thể tiến
hành bước này thêm một lần nữa), thêm
2ml dung dịch Chloroform/Isoamylic (v/v:
24/1) trộn đều, ly tâm 3500 rpm/5 phút
Tách lấy phần nước trong ở trên, thêm 5ml
dung dịch cồn Ethylic 95%, nhẹ nhàng quay
ống nghiệm để các sợi DNA xoắn lại, dùng
ống hút nhỏ nhẹ nhàng hút lấy DNA và bảo
quản ở một ống khác trong dung dịch cồn
75% Khi sử dụng có thể dùng dung dịch
TE hoặc nước cất để hoà tan DNA
3 Kỹ thuật PCR để phân tích allele
HLA - DQA1
Các cặp mồi đặc hiệu (specifiec
primers) căn cứ vào bảng các nucleotides
của các alleles của hệ HLA II năm 2002 và
dựa vào các Primers đặc hiệu của
O.Olerup, chúng tôi thấy các Primers đặc
hiệu từ Trung tâm nghiên cứu Vi sinh vật
học và Công nghệ sinh học của Viện Khoa
học Trung Quốc (tham khảo bảng 1), bao
gồm 9 chuỗi 5' và 7 chuỗi 3' hợp thành 12
đôi Primers đặc hiệu để khuyếch đại và
phân tích exon thứ 2 của HLA - DQA1
allele
Các cặp mồi đối chiếu: mỗi lần tiến hành PCR đều dùng một đôi mồi đối chiếu là
CAT TC3, 23 mer, TM 660C) Ctrl 2 (AAT
mer, Tm 700C) để kiểm soát và đối chiếu phản ứng khuyếch đại PCR
Kỹ thuật PCR - SSP: Dựa vào phương pháp của O Olerup để tiến hành, cụ thể là:
mỗi ống tiến hành PCR chứa 10àl gồm có:
75ng tiêu bản DNA, dung dịch đệm 5 x PCR (50mmol KCl; 1.5mmol MgCl2;
10mmol Tris-HCl (pH 8.3); 0,001% (w/v) Gelatin) 1% BSA, 200àl dNTPs chính là các dATP, dGTP, dCTP và dTTP; 0,25 àM các
đôi mồi đặc hiệu, 0,05 àM đôi mồi đối chiếu
và 0,50 IU Taq DNA polymerase Tiến hành
30 chu kỳ, mỗi chu kỳ như sau: Biến tính
940C/30 giây => giảm nhiệt 620C/30 giây =>
nối dài 720C/90 giây Sản phẩm thu được sau PCR được tiến hành điện di ở trong thạch Agarose 1,5% với điện áp 100V trong
15 phút Xem và phân tích kết quả ở đèn cực tím hoặc ở máy vi tính để chụp ảnh và bảo lưu kết quả
4 Xử lý số liệu thống kê: dùng cách
tính tần suất % theo Hardy - Weinberg để thống kê và xử ý các kết quả đạt được
Bảng 1: Vị trí, kích thước và tên gọi của các Primers đặc hiệu để khuyếch đại allele
DQA1
TT Tên gọi các
allele
Đôi Primers đặc hiệu
Sản phẩm PCR
Các allele thu hoạch sau PCR
DQA1*0104
DQA1*0102, DQA1*0104
DQA1*0103
Trang 3Bảng 1: Vị trí, kích thước và tên gọi của các Primers đặc hiệu để khuyếch đại allele
DQA1(tiếp)
TT Tên gọi các
allele
Đôi Primers đặc hiệu
Sản phẩm PCR
Các allele thu hoạch sau PCR
except DQA1*0104
II Kết quả
Kết quả phân tích HLA - DQA1 từ 214
mẫu máu (xem bảng 2) Đã kiểm tra được
10 loại allele DAQ1, tần suất tìm thấy cao
nhất là allele DQA1 * 0140 (25,8%), tiếp đó
là các allele DQA1 * 0101 và DQA1 * 0102
với tần suất tìm thấy lần lượt là 19,4% và
15,7%, các allele DQA1 còn lại đều được
tìm thấy dưới 10% Nhiều alleles là đồng
hợp tử nên tổng số các alleles là đồng hợp
tử thì cần phải tiếp tục kiểm tra chuỗi DNA
Đề tài này chưa tiến hành xác định các alleles là đồng hợp tử bằng kỹ thuật đọc chuỗi Hình ảnh dưới đây là kết quả điện di sản phẩm PCR sau khuyếch đại được phân tích và lưu ảnh ở máy tính Bio - Rad Gel Doc 2000
Bảng 2: Tần suất các allele HLA - DQA1 của người Kinh Việt Nam
TT Tên gọi các
allele
Lượt tìm thấy (328)
Tần suất kháng nguyên (%)
Tần suất allele tìm
được (%)
III Bàn luận
Cho đến nay, hệ kháng nguyên bạch
cầu người (HLA) được coi là hệ kháng
nguyên di truyền phức tạp và đa dạng nhất
Chúng không chỉ có sự phân bố khác nhau giữa các cá thể khác nhau, mà còn sự khác biệt giữa các dân tộc do khác nhau về bối cảnh di truyền, yếu tố di truyền và ngay cả cùng một dân tộc nhưng khác nhau về vị trí
Trang 4địa lý Nghiên cứu tính đa dạng của hệ
kháng nguyên bạch cầu người có vị trí rất
quan trọng vì nó là một tiêu chí di truyền
học vô cùng chắc chắn, ứng dụng nhiều
trong việc xác định con cái, bố mẹ, trong
khoa học hình sự để tìm tội phạm, trong
nghiên cứu nhân chủng học, dân tộc học để
tìm hiểu nguồn gốc của một dân tộc [1]
Ngoài ra, nhiều kết quả nghiên cứu gần đây
còn khẳng định mối liên hệ mật thiết giữa
HLA và một số bệnh tật như: đái tháo
đường không phụ thuộc Isulin, Viêm cứng
cột sống, viêm đa khớp dạng thấp, viêm
khớp thiếu niên Vì thế nghiên cứu HLA
còn có ý nghĩa quan trọng trong phân loại,
chuẩn đoán và hỗ trợ chuẩn đoán, tiên
lượng bệnh, dự phòng và điều trị một số
bệnh tật Theo đà phát triển mạnh mẽ của
sinh học phân tử, việc nghiên cứu HLA
ngày càng đơn giản, thuận tiện và chính
xác Tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu về
HLA vẫn còn khu trú tại các Viện nghiên
cứu, Phòng Khoa học hình sự còn chưa
được sử dụng nhiều trong bệnh viện và các
phòng thí nghiệm y học Đây có lẽ là nghiên
cứu đầu tiên tại Việt Nam về HLA, dẫu rằng
có tài liệu đề cập đến hệ HLA của người
Việt Nam nhưng không ghi rõ nơi nghiên
cứu [1]
Theo kết quả nghiên cứu trên đây, người
dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam có tần
suất tìm thấy allele HLA - DQA1 * 0104 là
cao nhất 25,8%, tiếp đó là các allele DQA1
* 0101 và DQA1 * 0102 với tần suất tìm
thấy lần lượt là 19,4% và 15,7%, các allele
khác được tìm thấy với tần suất rất thấp So
sánh với các dân tộc khác ở Trung Quốc
thấy rằng tần suất tìm thấy các allele phân
bố khá giống với dân tộc Choang (đã tìm
thấy allele HLA - DQA1 * 0104 với tần suất
22,1% và allele HLA - DQA1 * 0401 là
1,1%) Dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam
có các allele HLA - DQA1 * 0301 và HLA -
DQA1 * 0501 được tìm thấy rất thấp, đều
thấp hơn cả 10 dân tộc ở Trung Quốc (xem
bảng 3) Như vậy, tần suất allele HLA -
DQA1 * 0401 cao, HLA - DQA1 * 0301 và HLA - DQA1 * 0501 thấp có lẽ là đặc trưng phân bố allele HLA - DQA1 của người Kinh miền Trung Việt Nam So sánh với nghiên cứu trên người Thái Lan thấy HLA - DQA1 *
0101, HLA - DQA1 * 0102 có tần suất tương
tự nhưng tần suất HLA - DQA1 * 0501 (12,8%) cũng cao hơn nhiều so với người Kinh miền Trung Việt Nam (p < 0,005)
Dân số Việt Nam hiện nay khoảng 80 triệu người, với 54 dân tộc anh em, trong đó người Kinh chiếm tỷ lệ rất lớn (khoảng 90%) phân bổ khắp toàn quốc Dân tộc Kinh có truyền thống, lịch sử, văn hoá rất lâu đời
Nghiên cứu về dân tộc học cần tập trung trên nhiều phương diện như văn hoá, lịch
sử, truyền thống, nhân chủng học trong
đó di truyền học giữ một vai trò quan trọng
Báo cáo này có lẽ là nghiên cứu đầu tiên về phân bố các alleles của HLA - DQA1 trên người Kinh ở miền Trung Việt Nam, với những số liệu ban đầu này, chúng tôi hy vọng có thể tiếp tục nghiên cứu thêm về phân bố kháng nguyên hệ HLA nhằm tìm ra
được đặc trưng phân bố kháng nguyên HLA trên người Kinh Việt Nam, điều này có ý nghĩa lớn trong Y học (chuẩn đoán, dự phòng, tiên lượng, điều trị một số bệnh ), trong nhân chủng học nhằm nghiên cứu các nguồn gốc các dân tộc và mối liên hệ giữa các dân tộc khác nhau
Để hoàn thành nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường
Đại học Y khoa Huế, Bệnh viện thực hành Trường Đại học Y khoa Huế, Bộ môn Vi sinh, Khoa Xét nghiệm trường Đại học Y khoa Huế, Trung tâm thí nghiệm Trường
Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc và các thầy cô, đồng nghiệp Xin chân thành biết ơn
Tài liệu tham khảo
1 Cao Mengde, Tai Dongchun, Sun Hanxiao et al: Biological molecular and Clinincal applies of HLA Human Medical University Publishing, 1998, 1 - 58
Trang 52 Meng Haiying, Hou Yiping: New reseach
hotpots of HLA, Chin J.Med Genet, 2000 17
(5), 355 - 357
3 Xu xingpei, Wang Shaoying, Cao
Jianying: Study on DNA typing of HLA - II class
genes of Chinese Buyi nationality Chin J
Microbiol Immnol 1992 12(5), 285 - 289
4 Long Guifang, Ahmed Abdi Mohamed:
HLA - DQA1, DQB1 alleles genotyping by PCR
- SSP in Guangxi Chinese Zhuang nationality
Chin J Microbiol Immnol 1999 19(6) 504 -
505
5 Shen Jingjing, Guan Xiaofan, Yang Ze et
al: Allels at five HLA - II class determined in
Weiwuer nationality in North - Western of
China Chin.J.Med Genet 2000, 17 3), 219 -
220
6 Li Xiaofeng, Chang Chang, Hong
Shenxue et al: Association of alleles HLA -
DRB1, DQA1, DQB1 with SLE in Han
populations in Yunnan, China Chin J Med
Genet 2001, 18(5), 408 -409
7 D Chandanayingyong, Henry A.F.Stephens, R.Claythong et al: HLA - A, -B, - DQA1 and - DQB1 Polymorphism in Thais Human Inmmunology, 17, 53, 174 - 182
8 O Olerup, A.Aldener, A Fogdell: HLA - DQB1 and DQA1 typing by PCR - SSP in 2 hours Tissue Antigens, 193, 41(3), 119 - 134
9 Zhou Xiaoling, Lin Weixiong: DNA detection from peripheral blood Chinese Guangxi Medical University Magazine, 1999, 16(2), 223
10 Zhao Tongmao: Genetics of Human Blood Group, Chinese Science Publishing,
187, 226 -236
Summary Analysis of HLA – DQA1 alleles of jing nationality in
central vietnam
Objective: To analyse of HLA-DQA1 alleles in Jing nationality of Central Vietnam
Methods: Applied PCR-SSP technique to determine the polymorphism of the HLA-DQA1 alleles of
214 healthy children and yoth, unrelated individuals in Centre of Vietnam
Results: 10 HLA-DQA1 alleles were detected, of which DQA1*0104 were the most common alleles with frequency of 25.8%, and lowest frequency is DQA1*0601 (1%)
Conclusion: The results indicate that HLA-DQA1 alleles polymorphism of Jing nationality in Central Vietnam have national characteristics and that are different from the other Chinese and Thais
(Key word: Human leucocyte antigen, HLA-DQA1, PCR-SSP, Jing nationality of Vietnam)
