Xác định sơ bộ giá trị phần trăm, tuyệt đối của tiểu quần thể lympho T CD3, T CD4, T CD8, B, NK ở nhóm người bình thường tại thành phố hồ chí Minh bằng máy FASCALIBUR Trần Khiêm Hùng
Trang 1Xác định sơ bộ giá trị phần trăm, tuyệt đối
của tiểu quần thể lympho (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK)
ở nhóm người bình thường tại thành phố hồ chí Minh
bằng máy FASCALIBUR
Trần Khiêm Hùng
Phòng Miễn dịch tế bào, Viện Pasteur TP HCM
Mục tiêu là xác định các giá trị bình thường của tiểu quần thể lympho, trên cơ sởđó làm số
liệu tham chiếu cho bệnh nhân đến làm xét nghiệm tại viện Pasteur Thành phốHồ Chí Minh
và tiến hành so sánh các giá trị này với các giá trị của người Iran
Phương pháp áp dụng: lấy máu người bình thường (n=47) chống đông bằng EDTA ủ máu
với hai nhóm kháng thể của BD chứa trong hai ống khác nhau:
CD3/ CD8/ CD45/ CD4 ; CD3/ CD16,56 / CD45/ CD19
Sau khi xử lý mẫu được cho qua máy FASC, phân tích, tính toán, thống kê Cuối cùng xác
định các giá trị T CD3, T CD4, T CD8, B, NK ở từng mẫu riêng biệt
Kết quả: T CD3: % (⎯X = 68, SD: 7.94) Tuyệt đối (⎯X = 2412, SD: 691); T CD4: % (⎯X = 35.7, SD: 6.2) Tuyệt đối (⎯X = 915, SD: 339); T CD8: % (⎯X = 25.85, SD: 5.46) Tuyệt đối (⎯X = 626, SD: 245); B: % (⎯X = 7.97, SD: 2.79) Tuyệt đối (⎯X = 194, SD: 93); NK: % (⎯X = 20.1, SD: 7.18) Tuyệt đối (⎯X = 477, SD: 203); Tỉ lệ T CD4/ T CD8: ⎯X =1.53, SD: 0.46
Kết luận: Khi so sánh với các giá trị của quần thể Iran, thì chỉ có tỉ lệ % NK của nhóm nghiên cứu là cao còn những giá trị còn lại đều thấp hơn
i Đặt Vấn đề
Định giá trị của tiểu quần thể lympho rất
có giá trị trong một số trường hợp sau:
+ Định lượng lympho T CD4 để biết được
bệnh nhân nhiễm HIV đang ở giai đoạn nào
và làm cơ sở cho việc quyết định và theo dõi
điều trị
+ Xác định tình trạng thiếu hụt NK ở
những người nhiễm virus Herpes tái đi tái lại
+ Xác định tình trạng của hệ thống miễn
dịch [1, 2]
Tuy nhiên các số liệu tham chiếu cho
người bình thường hầu như chỉ dùa trên các
số liệu của người nước ngoài Trên người
Việt Nam thì rất ít, hoặc thiếu số liệu theo vùng địa lý
Mặc khác, còn một vấn đề rất quan trọng
là hiện nay tại Việt Nam vẫn chưa có một hệ
thống kiểm tra chất lượng bên trong, bên ngoài (internal quality control and external quality control) đối với máy FASCalibur nhaốm đảm bảo độ tin cậy của thử nghiệm
Mặc dầu cho tới bây giờ FASCalibur là một
công cụ rất đáng tin cậy nhờ vào việc sử
dụng các kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang và có thể phối hợp 4 chất huỳnh quang khác nhau cùng một lúc khi thử nghiệm
Trang 2Do đó việc xây dựng một bộ giá trị tham
chiếu cho tiểu quần thể lympho của phòng
miễn dịch tế bào (viện Pasteur TP.HCM) có
giá trị thực tiễn
Hơn thế nữa chúng tôi cũng muốn so
sánh các giá trị của nhóm nghiên cứu với
những nhóm dân số khác để xem tỷ lệ của
tiểu quần thể lympho có thay đổi gì hay
không?
ii Đối tượng và phương pháp
nghiên cứu
1 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu:
- ống chống đông bằng EDTA-TRI K
cung cấp bởi LMD Paris
- ống nghiệm 5ml, cỡ 12 575mm do hãng
BD cung cấp
- Kháng thể của BD: + CD3 (FITC)/ CD8
(PE) / CD45 (PerCP) / CD4 (APC)
+ CD3 (FITC) / CD16,56 (PE) / CD45
(PerCP) / CD19 (APC)
- Dung dịch ly giải hồng cầu
- Máy FASCalibur của BD
- Phần mềm cellquest, excel…
- Mẫu máu có được lấy từ những người
hiến máu nhiều lần tại hội chữ thập đỏ
TP.HCM
+ Tuổi từ 19 đến 50 tuổi bao gồm 40 nam
và 8 nữ
+ Các xét nghiệm: kháng thể bất thường,
VDRL, KSTSR, HCV, HIV, HbsAg đều âm
tính
+ Công thức máu trong giới hạn bình
thường
Vì tiến hành lấy máu trước khi xét
nghiệm, sau khi có kết quả trong mẫu
nghiên cứu loại trừ một trường hợp vì có
HbsAg (+) Nên cỡ mẫu thật sự chỉ là 47
2 Phương pháp:
+ Xử lý mẫu:
* 1 ml máu tươi chống đông bằng EDTA
được xử lý trong vòng 4 giờ
* 100 àl máu chống đông vào mỗi ống nghiệm vàủ trong vòng 30’
- ống 1: có 5 àl kháng thể CD3 (FITC)/ CD8 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD4(APC)
- ống 2: có 5 àl kháng thể CD3 (FITC)/ CD16,56 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD19(APC)
* Hồng cầu bị ly giải bằng 1 ml dung dịch
ly
* Trung hòa bằng 1ml dung dịch PBS
* Ly tâm 2000 rpm/1’ trong vòng 4 phút
Bỏ dịch nổi, thêm vào 500 àl dung dịch PBS,
lắc đều và các tế bào được phân tách sau
đó bằng máy FASC
+ Mẫu được chạy bằng máy FASCalibur,
sản phẩm của hãng BD (Hoa Kĩ)
* Máy có 2 đèn laser
- Xanh: cung cấp ánh sáng ở bước sóng
488 nm
- Đỏ: cung cấp ánh sáng ở bước sóng
620 nm
* Có 6 cảm thụ quan nhận cảm ánh sáng
phát xạ và những cảm thụ quan này cho ta
biết được:
- FSC: hình thái của tế bào
- SSC: cấu trúc của tế bào
- Fl1: bắt màu huỳnh quang FITC
- Fl2: bắt màu huỳnh quang PE
- Fl3: bắt màu huỳnh quang PerCP
- Fl4: bắt màu huỳnh quang APC
+ Mẫu được phân tích bằng sơ đồ chạy trong chương trình Cellquest
% TCD8, TCD4, TCD3 dùa vào kháng
thể CD3 (FITC)/ CD8 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD4 (APC) và có cách tính như sau:
Trang 3Sample ID: 160402/6-X7
Quad Events % Gated
UL 614 8.01
UR 2492 32.52
LL 1909 24.91
LR 2648 34.56
Sample ID: 160402/6-X7 Quad Events % Gated
UL 28 0.37
UR 2665 34.78
LL 2492 32.52
LR 2478 32.34
R2
UL
LR UR=32.52%
UL
UR=34.78%
LR
Hình 1: Phương pháp xác định tỷ lệ % TCD4, TCD8
A- Dùng cửa sổ x=SSC, y=Fl3-CD45 để
loại trừ hồng cầu chưa ly giải, mảnh vỡ của
tế bào bằng cách giới hạn các tế bào cần
phân tích trong khu vực R1 Vì thế quần thể
lympho phân tích sau này thuần nhất hơn
B- Cửa sổ thứ 2 (x=FSC, y=SSC) bắt
nguồn từ vùng R1 Thấy rõ 3 nhóm dân số:
lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt
Giới hạn dân số lympho trong vùng R2
C- Cửa sổ thứ 3 (x=Fl1-CD3, y=Fl2-CD8)
bắt nguồn từ hội của vùng R1 và R2 Kết
hợp với phần thống kê của cửa sổ này (hình
1 E) cho ta biết được tỉ lệ phần trăm của
TCD8 =% vùng UR cho Fl1 và Fl2 Trong
hình là 32.52%
D- Cửa sổ thứ 4 (x=Fl1-CD3, y=Fl4-CD4)
bắt nguồn từ hội của vùng R1 và R2 Kết
hợp với phần thống kê của cửa sổ này (hình
1 F) cho ta biết được tỉ lệ phần trăm của TCD4 =% vùng UR cho Fl1 và Fl4 Trong
hình là 34,78%
Và tỉ lệ % CD3 = % UR + % LR Các số
liệu có thể lấy ở cửa sổ 3 hay 4
% NK, B dựa vào kháng thể CD3 (FITC)/ CD16.56 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD19(APC)
và có cách tính như sau:
Trang 4Sample ID: 160402/5-X7
R1
R2
Sample ID: 160402/5-X7
LR
LR
UL=20.9%
Hình 2: Phương pháp xác định tỷ lệ % B, NK
A- Dùng cửa sổ x=SSC, y=Fl3-CD45 để
loại trừ hồng cầu chưa ly giải, mảnh vỡ của
tế bào bằng cách giới hạn các tế bào cần
phân tích trong khu vực R1 Vì thế quần thể
lympho phân tích sau này thuần nhất hơn
B- Cửa sổ thứ 2 (x=FSC, y=SSC) bắt
nguồn từ vùng R1 Thấy rõ 3 nhóm dân số:
lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt
Giới hạn dân số lympho trong vùng R2
C- Cửa sổ thứ 3 (x=Fl1-CD3,
y=Fl2-CD16.56) bắt nguồn từ hội của vùng R1 và
R2 Kết hợp với phần thống kê của cửa sổ
này (hình 2 E) cho ta biết được tỉ lệ phần
trăm của NK=% vùng UL cho Fl1 và Fl2
Trong hình là 20.9%
D- Cửa sổ thứ 4 (x=Fl1-CD3, y=Fl4-CD19) bắt nguồn từ hội của vùng R1 và R2
Kết hợp với phần thống kê của cửa sổ này (hình 2 F) cho ta biết được tỉ lệ phần trăm
của B=% vùng UL cho Fl1 và Fl4 Trong
hình là 2.16%
2 Phương pháp thống kê:
Dùng phần mềm Excell để xác định giá
trị trung bình, độ lệch chuẩn của các thông
số
Dùng phép kiểm t để so sánh trung bình
của 2 nhóm dân số Trước tiên xác định t
tính, với trị số t này tra bảng phân phối t với
độ tự do (n1+n2-2) để ước lượng giá trị p (p value) n1, n2 là cỡ mẫu của 2 nhóm dân số
tương ứng
Trang 5iii Kỏt quộ
Bộng 1: Tủ lơ phđn trÙm, giĨ trẺ tuyơt ợèi cĐa tiốu quđn thố lympho ẽ nhãm dờn sè
TP.HCM
T CD3 ⎯X: 68, SD: 7.94 ⎯X: 2412, SD: 691
T CD4 ⎯X: 35.7, SD: 6.2 ⎯X: 915, SD: 339
T CD8 ⎯X: 25.85, SD: 5.46 ⎯X: 626, SD: 245
Từ lơ TCD4/TCD8 ⎯X: 1.53, SD: 0.46
Khi so sĨnh kỏt quộ nÌy (HCM) vắi sè liơu ng−êi Iran [3] chừ giắi hÓn ẽ tủ lơ phđn trÙm (xem bộng 2)
Bộng 2: Bộng so sĨnh cĨc giĨ trẺ giƠa nhãm dờn sè TP.HCM vắi nhãm dờn sè Iran
% Mean Ử SD
Iran (n=152)
% Mean Ử SD
T tÝnh p
TCD3 68 Ử 7.94 70.62 Ử 7.29 2.11 p < 0.05 TCD4 35.7 Ử 6.2 42.11 Ử 6.95 5.66 p < 0.001 TCD8 25.85 Ử 5.46 28.41 Ử 8.58 1.9 0.05 < p < 0.1 CD4/CD8 1.53 Ử 0.46 1.61 Ử 0.6 0.84 0.2 < p < 0.5 CD19 7.97 Ử 2.79 13.72 Ử 4.59 8.13 p < 0.001
NK 20.1 Ử 7.18 15.81 Ử 6.97 -3.66 p < 0.001
IV BÌn luẹn
NgoÓi trõ TCD8, TCD4/TCD8 cã p > 0,05
tục lÌ khỡng cã sù khĨc biơt vồ trung bÈnh ẽ
hai nhãm dờn sè trởn Trong khi ợã TCD3,
TCD4, CD19 ợồu cã sù khĨc biơt (p < 0,05)
vắi tủ lơ thÊp hŨn ẽ nhãm dờn sè TP.HCM
T−Ũng tù vắi NK còng cã sù khĨc biơt (p <
0,05) nh−ng tủ lơẽ nhãm Iran lÓi thÊp hŨn
Mẽ réng vÊn ợồ nÌy ợèi vắi mét sè chĐng
téc khĨc Vắi nghiởn cụu cĐa Lee BW vÌ
céng sù nhẹn thÊy tủ lơ NK ẽ người ớÌi
Loan thÈ cao hŨn người Chờu ằu trong khi tủ
lơ TCD4 thÈ thÊp hŨn [4] Kỏt luẹn t−Ũng tù
còng tÈm thÊy trởn bĨo cĨo cĐa Prime vÌ
céng sù [3] lÌ tủ lơ NK ẽ ng−êi Trung Hoa
cao hŨn ẽ ng−êi Chờu ằu Theo Shahpour
Shahghasempour khi nghiởn cụu trởn ng−êi
Iran (lÌ quđn thố chóng tỡi dĩng ợố so sĨnh
vắi nhãm nghiởn cụu tÓi TP.Hạ ChÝ Minh) [3]
thÈ NK cĐa ng−êi Iran cao hŨn ng−êi Chờu
ằu, trong khi tủ lơ TCD8 thÈ thÊp hŨn
Tõ nhƠng thỡng tin nÌy khiỏn ng−êi ta nghượỏn khộ nÙng lÌ tủ lơ cĐa tiốu quđn thố lympho sù thay ợăi khi cã sù khĨc biơt vồ
chĐng téc
Mậc khĨc vắi tủ lơ NK cĐa nhãm nghiởn
cụu cao hŨn hÒn khi so vắi nhãm ng−êi Iran,
Chờu ằu, trong khi TCD3, TCD4, CD19 ợồu
thÊp hŨn Vắi sù khĨc biơt nÌy khiỏn ng−êi
ta suy nghư nh− thỏ nÌo vồ vai trß cĐa ợĨp
ụng miÔn dẺch tù nhiởn (thỡng qua NK) ẽ
quđn thố nÌy? Sù cao hŨn vồ tủ lơ NK cã
gióp Ých gÈ cho cĨc cĨ thố trong viơc gióp cŨ
thố chèng lÓi nhƠng tĨc nhờn gờy hÓi?Ẩ ợố
trộ lêi cho nhƠng cờu hái trởn chóng ta cđn nghiởn cụu lÓi vÊn ợồ nÌy vắi cì mÉu réng
hŨn nhữm xĨc lẹp lÓi thẹt sù tủ lơ NK ẽ
ng−êi bÈnh th−êng tÓi TP.HCM cao hŨn
Trang 6nhóm người Iran, Châu Âu Thậm chí cần
nghiên cứu sâu hơn về chức năng của NK,
khảo sát một số CD bề mặt của NK như:
CD1.7.1, CD158a, KAR, KIR P70, CD28,
HLA-DR… là những CD cho biết được tình
trạng hoạt động, kích hoạt… của tế bào
NK…
v Kết luận
Sau khi xử lý mẫu được cho qua máy
FASC, phân tích, tính toán, thống kê Cuối
cùng xác định các giá trị T CD3, T CD4, T
CD8, B, NK ở từng mẫu riêng biệt
Kết quả: T CD3: % (⎯X = 68, SD: 7.94)
Tuyệt đối (⎯X = 2412, SD: 691); T CD4: %
(⎯X = 35.7, SD: 6.2) Tuyệt đối (⎯X = 915,
SD: 339); T CD8: % (⎯X = 25.85, SD: 5.46)
Tuyệt đối (⎯X = 626, SD: 245); B: % (⎯X =
7.97, SD: 2.79) Tuyệt đối (⎯X = 194, SD:
93); NK: % (⎯X = 20.1, SD: 7.18) Tuyệt đối
(⎯X = 477, SD: 203); Tỉ lệ T CD4/ T CD8: ⎯X
=1.53, SD: 0.46
Khi so sánh với các giá trị của quần thể Iran, thì chỉ có tỉ lệ % NK của nhóm nghiên
cứu là cao còn những giá trị còn lại đều thấp
hơn
Tài liệu tham khảo
1 Flow cytometry protocols Mark J.Jaroszeski, Richard Heller Humana Press
2 Practical flow cytometry Howard M Shapiro, M.D.Wiley Liss.1995
3 Enumeration of peripheral blood lymphocyte subsets in a healthy iranian population Shahpour Shahghasempour, Mitra Gerami, Zinat Entezami Archives of Iranian Medecine, 2001; 4(2): 80-83
4 Age and sex related changes in lymphocyte subpopulation of healthy Asian subjects from birth to adulthood Lee BW, Yap HK, Chew FT, Quah TC, Prabhakaran
K, Chan GS, Wong SC, Seah CC Cytometry
1996 Mar 15; 26 (1):8-15
Summary
LYMPHOCYTE SUBPOPULATION IN HEALTHY ADULTS
DONORS OF HO CHI MINH CITY VIET NAM
The primary objective of this study was to establish reference ranges for the lymphocyte subsets (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK) in the peripheral blood of healthy adults donors
This reference ranges is used like target values for the patients at Pasteur Institute-HCMC and then compare the results with those obtained in a group of healthy adults Iranian population
The samples obtained from the 47 healthy adults donors were stained with two premixed monoclonal antibodies:CD3 (FITC)/ CD8 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD4 (APC); CD3 (FITC)/ CD16-56 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD19 (APC)
After stain, whole blood is passed lyses procedures, wash and final they were analyzed by flow cytometry
The results: T CD3: % (⎯X= 68, SD: 7.94) Absolute (⎯X = 2412, SD: 691); T CD4: % (⎯X = 35.7, SD: 6.2) Absolute (⎯X = 915, SD: 339); T CD8: % (⎯X = 25.85, SD: 5.46) Absolute (⎯X
= 626, SD: 245); B: % (⎯X = 7.97, SD: 2.79) Absolute (⎯X = 194, SD: 93); NK: % (⎯X = 20.1, SD: 7.18) Absolute (⎯X = 477, SD: 203); Ratio T CD4/ T CD8: ⎯X =1.53, SD: 0.46
We have the difference clearly in subpopulation NK (population of HCMC is higher than Iranian population) The study demonstrate that on population's HCMC, the innate immunity may have a role protection importance But we need more study with a larger of sample size
to clarify
