Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh Chi Việt Nam (Ganodermalucidum) trên chuột gây suy gan thực nghiệm potx

nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam Ganodermalucidum trên chuột gây suy gan thực nghiệm Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội

nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam (Ganodermalucidum) trên chuột gây suy gan

thực nghiệm

Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan

Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội

Trên chuột cống trắng, các liều cao của paracetamol (PAR) (uống 2g/kg) và carbon tetraclorid (CCL4) (uống 1,4 ml/ kg) đã làm tăng rất mạnh nồng độ transminase AST và ALT huyết thanh, làm giảm khả năng tổng hợp cholesterol và protein toàn phần của gan Trên mô bệnh học, gan bị thoái hóa hạt, thoái hóa mỡ và xuất hiện các ổ hoại tử

Cao lỏng nấm linh chi (NLC) với liều uống 4g/ kg đã làm các thông số sinh hóa trên và các tổn thương mô bệnh học trở về gần bình thường Kết quả tương tự với liều uống 25mg/ kg Silymarin

I Đặt vấn đề

Do đảm nhận nhiều chức phận chuyển hoá

và là cửa ngõ của các chất thâm nhập vào cơ

thể từ bộ máy tiêu hoá nên gan là một cơ quan

dễ bị tác động nhất của các yếu tố độc hại

Theo y học cổ truyền, nấm linh chi (NLC) -

Ganoderma lucidum (Leyss ex.Fr.) Krst, thuộc

họ Nấm gỗ Ganodermataceae - có tác dụng

bảo vệ gan chống viêm gan cấp và mạn [1]

Tuy nhiên, NLC Việt Nam hầu như chưa được

đánh giá Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài này nhằm tìm hiểu tác dụng bảo vệ

gan của NLC Việt Nam trên chuột cống trắng

đã được gây suy gan thực nghiệm bằng

paracetamol (PAR) và carbon tetraclorid

(CCL4) thông qua một số chỉ tiêu sinh hóa và

mô bệnh học của gan

II Vật liệu - đối tượng và phương

pháp nghiên cứu

1 Vật liệu:

1.1 Thuốc nghiên cứu:

Nấm Linh chi Việt Nam sau khi thu hoạch

được phơi sấy khô để cả cuống và mũ nấm

Trong nghiên cứu được dùng dưới dạng cao

lỏng có dung môi là nước, cô đặc đến tỷ lệ 1: 2

(2ml cao lỏng chứa 1g nấm Linh chi)

1.2 Hoá chất, trang thiết bị

- Dung dịch CCl4, bột carboxy methyl celulose (CMC), bột PAR của Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 2), dầu olive

- Legalon 70mg (viên) của hãng Madaus A.G (Silymarin, hoạt chất từ quả cây cúc gai - Silybum mariuanumL- Họ cúc Astaraceae)

- Các loại hoá chất chuẩn để xác định nồng

độ AST, ALT, Cholesterol, Protein của hãng Hospitex diagnostics

- Máy xét nghiệm sinh hoá máu, Screen

master của hãng Hospitex diagnostics

2 Đối tượng

Chuột cống trắng cả hai giống, khoẻ mạnh, Trên mô hình gây suy gan bằng PAR, dùng chuột 8 tuần tuổi (130 ±10g); trên mô hình gây suy gan bằng CCl4, dùng chuột 12 tuần tuổi (180 ± 20g)

Trong suốt thời gian nghiên cứu, chuột được nuôi dưỡng trong cùng một điều kiện, tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược lý

3 Phương pháp nghiên cứu

Thực hiện trên mô hình gây nhiễm độc gan chuột bằng PAR và CCl4 theo phương pháp trích dẫn từ Dhawan [5]

3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao lỏng NLC ở chuột cống trắng gây nhiễm độc PAR

Chuột được chia thành 4 lô, mỗi lô 10 con

Lô 1: uống CMC 0,2g/ kg

Lô 2: uống CMC 0,2g/ kg

Lô 3: uống cao lỏng NLC 4g/ kg

Lô 4: uống Legalon (Silymarin) 25mg/kg

(liều lâm sàng) [2]

Chuột trong tất cả các lô được uống các

thuốc trên hàng ngày, trong 8 ngày liền Vào

ngày thứ 6, chuột lô 2, 3, 4 được gây nhiễm

độc gan bằng uống thêm paracetamol với liều

2g/kg Ngày thứ 8 sau khi uống liều thuốc cuối

cùng 4 giờ, tất cả chuột của 4 lô đều bị giết để

lấy máu làm xét nghiệm chức phận gan, quan

sát đại thể các tạng và kiểm tra vi thể mô bệnh

học gan

3.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của

CLNLC trên chuột cống trắng gây nhiễm

Chuột được được chia thành 4 lô, mỗi lô 10

con

Lô 1: uống olive - 10ml /kg Lô 2: uống olive - 10ml/ kg Lô 3: uống cao lỏng NLC 4g/ kg Lô 4: uống Legalon (Silymarin) 25mg/ kg Chuột ở tất cả các lô được uống các thuốc tương ứng trong 9 ngày Ngày thứ 6 và thứ 8, tiêm màng bụng cho chuột ở lô 2, 3, 4 CCl4/olive (1:1) 1,4ml/kg ở giờ thứ 24 sau tiêm CCl4 lần 2 thì giết toàn bộ chuột, lấy máu làm xét nghiệm đánh giá chức năng gan, lấy gan quan sát đại thể và làm mô bệnh học để quan

sát cấu trúc vi thể gan

4 Xử lý số liệu: Kết quả nghiên cứu được

xử lý theo phương pháp thống kê

III Kết quả

1 Tác dụng bảo vệ của cao lỏng NLC trên chuột gây nhiễm độc paracetamol

1.1 Trên nồng độ transaminase huyết thanh (bảng 1)

Bảng 1

M ± SD

ALT (UI/L)

M ± SD

Chỉ số

De Ritis

2 CMC + PAR 10 6136,9 ± 2108,6 (a) 204,4 ± 62,9(a) 30,0

3 NLC + PAR 10 298,4 ± 99,9 (b) 56,9 ± 33,6 (b) 5,2

4 Silymarin + PAR 10 233,6 ± 93,2 (b) 38,8 ± 9,3 (b) 6,0

(a): p < 0,01 so với (1); (b): p < 0,001 so với (2)

Khi dùng cao lỏng NLC trước 6 ngày và cả trong thời gian cho uống paracetamol (lô 3) thì cao lỏng NLC có tác dụng ngăn cản đáng kể sự tăng AST và ALT do paracetamol gây ra

1.2 Trên nồng độ protein và cholesterol toàn phần huyết thanh (bảng 2)

Lô Thuốc dùng n Protein toàn phần

(mg/100ml)

Cholesterol toàn phần (mg/ 100ml)

(+) : p> 0,05 so với lô 1

(*) : p < 0,05; (**) : p < 0,01 so với lô 1

Nhận xét: Nồng độ của protein toàn phần ở

các lô chuột đều khác nhau không có ý nghĩa

thống kê so với lô chứng

Nồng độ cholestorol huyết thanh cao hơn có

ý nghĩa thống kê so với lô 2 là lô chuột gây viêm gan đơn thuần, nhưng vẫn thấp hơn lô chứng

1.3 Kết quả giải phẫu bệnh học gan

Qua quan sát đại thể và hình ảnh vi thể gan

chuột trong các lô nghiên cứu trên kính hiển vi

quang học được trình bày trong các ảnh dưới đây

1.3.1 Chuột uống CMC và paracetamol

- Đại thể: gan chuột màu đỏ thẫm, xung

huyết mạnh, bờ gan không còn, bề mặt sần sùi

không có độ nhẵn bóng, mật độ chắc, có nhiều

hoại tử, tại đó tổ chức gan mủn

- Vi thể: Mô gan hoại tử ổ nặng chủ yếu ở

quanh các tiểu thuỳ, hoại tử bắc cầu thoái hoá

hạt, một số tiểu thuỳ có hoại tử: ở trung tâm,

vùng hoại tử xung huyết mạnh và chảy máu,

phần nhu mô gan còn lại có nhiều tế bào thoái

hoá mỡ, có hiện tượng nhân đông và nhân tan,

có thâm nhiễm bạch cầu đa nhân (ảnh 1)

Ảnh 1: Hình ảnh cấu trúc gan chuột nhiễm

độc paracetamol (Độ phóng đại 100 lần)

1 Cả vùng hoại tử lớn 2 Thoái hoá hạt

3 Thoái hoá mỡ

1.3.2 Chuột uống cao lỏng NLC và gây viêm gan bằng paracetamol

- Đại thể: gan chuột màu đỏ, xung huyết

nhẹ, bờ gan bình thường, còn một vài ổ tổn thương nhỏ

- Vi thể: Hình ảnh tổn thương thoái hoá tế

bào gan mức độ nhẹ, nhu mô gan gần trở lại

bình thường (ảnh 2)

ảnh 2: Hình ảnh cấu trúc gan chuột cống CLNLC và gây viêm gan bằng paracetamol

(độ phóng đại 200 lần)

Các kết quả trên đã cho thấy cao lỏng NLC hạn chế được các tổn thương giải phẫu bệnh lý

về gan do paracetamol gây ra tương đương với silymarin Tuy nhiên hình ảnh gan chuột trong các lô dùng thuốc điều trị (lô 3 và 4) còn một

số tổn thương nhỏ so với hình ảnh cấu trúc gan chuột trong lô chứng

2 Tác dụng bảo vệ gan của cao lỏng NLC ở chuột nhiễm độc CCl 4

2.1 Trên nồng độ transaminase huyết thanh chuột cống trắng (bảng 3)

2 CCl4/olive 8 313,4 ±47,3 (a) 79,7 ± 14,2 (a) 3,9

3 NLC + CCl4/olive 8 198,0 ± 59,5 (b) 40,8 ± 10,0 (b) 4,9

4 Silymarin + CCl4/olive 8 233,4 ± 51,7 (b) 39,7 ± 14,5 (b) 5,9

(a) : p < 0,001 so với (1)

(b) : p < 0,001 so với (2)

(b) : < 0,01 so với (2)

Nhận xét: Lô chuột tiêm màng bụng CCl4

/dầu olive thì nồng độ transaminase huyết thanh tăng 2,7 lần với AST; 2,9 lần với ALT so với lô uống nước muối sinh lý

ở lô chuột gây độc bằng CCl4 /olive có

uống NLC (lô 3) thì nồng độ của transamirase

huyết thanh chỉ tăng 1,7 lần với AST; 1,5 lần

với ALT

ở lô chuột gây độc bằng CCl4/olive uống kèm silymarin thì nồng độ transaminase huyết thanh cũng chỉ tăng 2,0 lần với AST và 1,5 lần với ALT

2.2 Trên nồng độ cholesterol và protein toàn phần huyết thanh (bảng4)

Lô

Thuốc n Cholesterol TP (mg %)

Protein TP

2 Olive + CCl4/olive 8 95,6 ± 7,3 57,0 ± 4,4 < 0,05 so với 1

3 NLC + CCl4/olive 8 108,5 ± 5,8 66,5 ± 4,0 > 0,05 so với 1

4 Silymarin+ CCl4/olive 8 108,2 ± 6,4 67,4 ± 1,4 > 0,05 so với 1

Nhận xét: Các kết quả về nồng độ cholesterol

toàn phần và protein toàn phần huyết thanh ở

bảng 4 cho thấy ở lô gây độc gan bằng CCl4 thì

nồng độ cholesterol và protein toàn phần thấp

hơn 1,2 lần so với lô chứng Còn ở lô chuột gây

độc có uống kèm NLC và Silymarin thì nồng độ

cholesterol và protein toàn phần huyết thanh gần

trở về bình thường

2.3 Kết quả giải phẫu bệnh

2.3.1 Chuột uống olive và tiêm màng

bụng cacbon tetraclorid

- Đại thể: Gan chuột bạc màu hơn, có

những chấm xung huyết, mặt gan không nhẵn,

bờ phù nề, có nhiều tổn tương nhu mô gan

dạng hoại tử, tổ chức gan tại ổ hoại tử mủn

- Vi thể: Nhu mô gan hoại tử ổ, tế bào gan

thoái hoá mỡ diện rộng rải rác có thoái hoá hạt,

tổn thương biến dạng tế bào, tế bào phình to,

màng tế bào có nhiều chỗ phân tán, tổn thương

tới cả nhân tế bào, nhân đông vón lại và bắt

màu kiềm mạnh, màng nhân mất, có nhiều

nhân chia

2.3.2 Chuột uống NLC và gây viêm gan

bằng cacbon tetraclorid

- Đại thể: Gan bạc màu mức độ vừa, mặt gan

không được nhẵn bóng không thấy tổn thương

trên bề mặt gan Thoái hoá mỡ màu đỏ vừa

- Vi thể: tế bào gan tương đối bình thường,

không có tổn thương biến dạng, không có tổn

thương nhân, bào tương của phần lớn tế bào

gan có nhiều hốc mỡ do thoái hoá mức độ vừa

có hiện tượng tăng sinh mô liên kết, xen kẽ tế bào viêm đơn nhân

IV bàn luận

Cơ chế gây tổn thương gan bằng liều cao PAR đã được khẳng định là do chất chuyển hóa trung gian N- acetyl- p- benzoquinoimin (NAPQI) có tác dụng huỷ hoại tế bào gan do

được tạo ra quá nhiều, vượt quá khả năng khử

độc của glutathion, chất chống oxy hóa tự nhiên luôn có sẵn ở gan [6] Còn cơ chế gây tổn thương gan do CCl4 là do chất này bị chuyển hóa ở gan dưới tác dụng của Cyt P450 tạo ra gốc tự do CCl•3 [7] Chúng tôi sử dụng 2 chất này để gây mô hình thực nghiệm trên chuột cống [3] [5]

Trên cả 2 mô hình thực nghiệm của chúng tôi, các tế bào gan đã bị tổn thương rất rõ cả về mặt sinh hóa (hàm lượng transaminase AST và ALT tăng cao; cholesterol và protein toàn phần giảm), cả về tổn thương mô bệnh học

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tác dụng bảo vệ gan của cao lỏng NLC thông qua chỉ số transaminase ALT và AST ở bảng 1, PAR đã làm nồng độ AST tăng tới 54 lần (6136,9 so với 113,8 UI/L) và ALT tăng gấp 7,4 lần (204,4 so với 27,5 UI/ L) Tuy nhiên, trên lô chuột được

điều trị trước bằng cao lỏng NLC 4g/ kg (lô 3 bảng 1) thì AST chỉ còn tăng 2,6 lần và ALT là 2,1 lần so với lô chứng chỉ uống NaCl 0,9% Chỉ số De Ritis là tỉ lệ AST/ ALT bằng 30 ở lô 2

bị gây độc bằng PAR chứng tỏ tổn thương ở mức dưới tế bào rất nặng Nhưng khi được điều trị trước bằng NLC hoặc silymarin thì các chỉ số

tương ứng là 5,2 và 6,0, rất gần với chỉ số ở lô

chứng 4,13, điều đó chứng tỏ NLC hồi phục

được cả tổn thương ở mức tế bào và cả tổn

thương ở mức dưới tế bào

Trên chuột gây nhiễm độc bằng CCl4, kết

quả ở bảng 3 cũng cho thấy AST tăng gấp 2,7

lần (313,4 so với 114,5UI/ L) và ALT tăng gấp

2,9 lần Cao lỏng linh chi và cả silymarin chỉ ức

chế được một phần sự tăng này, từ 40 - 50%

Chỉ số De Ritis ở tất cả các lô chỉ thay đổi ít

PAR và CCl4 đều làm giảm khả năng tổng

hợp cholesterol và protein toàn phần của gan

(bảng 2, 4) Dịch chiết NLC đã phục hồi sự

tổng hợp này trở về gần bình thường

Về kết quả mô bệnh học cũng cho thấy dịch

chiết NLC đã hạn chế rất rõ ràng tác dụng gây

tổn thương tế bào gan của PAR (ảnh 1, 2) và

cả của CCl4

Như vậy, dịch chiết NLC đã hầu như có tác

dụng đối lập với cơ chế gây độc của PAR và

CCl4 trên tế bào gan chuột, tuy 2 mô hình này

gây mức độ tổn thương khác nhau và cơ chế

không giống nhau

Silymarin là hoạt chất flavonoid chiết ra từ

quả cây cúc gai đã được sản xuất thành thuốc

thương phẩm dưới tên Legalon để điều trị bệnh

suy gan [2] [4] với cơ chế được coi là có tác

dụng bảo vệ màng tế bào, ức chế quá trình

peroxy hóa lipid, chống oxy hóa và bắt giữ gốc

tự do Trong các mô hình nghiên cứu chúng tôi

đều có một lô chuột dùng silymarin để làm

chuẩn so sánh Kết quả cho thấy, trên mọi

thông số theo dõi, dịch chiết NLC uống 4g/ kg

có tác dụng tương tự silymarin 25mg/ kg Điều

đó gợi ý cho chúng tôi nghĩ rằng cơ chế bảo vệ

gan của NLC có thể rất gần với silymarin, và

rất cần được nghiên cứu sâu thêm

V Kết luận

Trên mô hình chuột cống trắng được gây

suy gan bằng paracetamol (PAR) và carbon

tetraclorid (CCl4), cao lỏng nấm linh chi (NLC)

Việt Nam đã ngăn cản được rõ rệt tác dụng làm

tăng AST, ALT và tác dụng làm giảm tổng hợp

cholesterol, protein toàn phần của cả PAR và

CCl4 Tác dụng bảo vệ gan của NLC còn được thấy rõ trên hình ảnh mô bệnh học của gan Cơ chế tác dụng bảo vệ gan của NLC có thể tương

tự như Silymarin

Tài liệu tham khảo

1 Đỗ Tất Lợi (1999) “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” Nhà xuất bản KH&KT, tr

2 Đào Văn Phan (2000) “ Silymarin (Legalon)-đặc điểm dược lý và các ứng dụng trong lâm sàng” Hội thảo khoa học Legalon và ứng dụng, tr 12-15

3 Lại Thị Vân (2003): Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và một số tác dụng dược lý liên quan của cây nhó đông (Psychotria morindoides hutch- Rubiaceae) Luận văn thạc

sĩ y học- Trường Đại học Y Hà Nội

4 Bindoli, A., L Cavallinin, N.Siliprandin (1997): Inhibitory action of Silymarin of lipid peroxide formation in Rat liver mitochondria and microsomes Biochem Pharmacol 26, 2405- 9

5 Dhawan B.N (1997), Hepatoprotective activity of natural products axperimental evaluation International workshop on medicinal plants their bioactivity Screening and Evaluation Lucknow, L15

6 Neal, G.E et al (1981), Specific examples

of activation reaction, Toxicologie appl Pharmacol 6.15

7 Slater T F (1984), Free- radial mechanism

in tissue injury J Biochem, 222, 1- 15

Summary

Hepatoprotective effect of Vietnamese -

Ganoderma lucidum (Leyss ex.Fr.) on rat with

experimental liver insufficiency

On the rat with experimental liver insufficiency caused by paracetamol and carbone

tetrachloride, the aqueous extract of - Ganoderma lucidum (Leyss ex.Fr.) with the oral dose of 4g/

kg of body weight evidently inhibited the increase of serum AST, ALT and the decrease of serum total cholesterol, total protein This hepatoprotective effect has also been observed in histopathologic microscopic examinations of rat's liver

Basing on these results of experiment, the authors suggest that the mechanism of

hepatoprotective effect of - Ganoderma lucidum (Leyss ex.Fr.) should be similar to that of

Silymarin