Tìm hiểu R-plasmid ở một số chủng Salmonella typhi phân lập tại Hà Nội, Huế và thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đắc Trung 1 , Lê Văn Phủng 2 và Lê Huy Chính 2 1 Đại học Y Thái Nguyên 2 Đạ
Trang 1Tìm hiểu R-plasmid ở một số chủng Salmonella typhi
phân lập tại Hà Nội, Huế và thành phố Hồ Chí Minh
Nguyễn Đắc Trung 1 , Lê Văn Phủng 2
và Lê Huy Chính 2
1 Đại học Y Thái Nguyên
2 Đại học Y Hà Nội
Các chủng Salmonella typhi đa đề kháng hiện đã lan tràn tới hầu hết các vùng trong cả nước Nghiên cứu đã dùng 90 chủng Salmonella typhi phân lập từ Hà Nội, Huế và Thành phố Hồ Chí
Minh để nghiên cứu về các plasmid của chúng Kết quả cho thấy:
Đã tìm thấy hai plasmid 120 Kb và 102 Kb ở các chủng kể trên, plasmid 120 Kb có 2 copy
Plasmid 120 Kb là một R-plasmid lớn, có khả năng tự truyền cho chủng khác và mang ít nhất 5 gene kháng kháng sinh: chloramphenicol, tetracycline, ampicillin, trimethoprim và sulphamethoxazole
Phân tích bằng enzyme hạn chế EcoR I cho thấy, các R-plasmid từ các chủng Salmonella phân
lập ở Hà Nội, Huế và Thành phố Hồ Chí Minh đều giống nhau
I đặt vấn đề
Thương hàn là một bệnh truyền nhiễm hay
gây thành dịch, do một số loài thuộc giống
Salmonella gây nên, trong đó hay gặp nhất là
do Salmonella typhi
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy S
typhi đề kháng kháng sinh chủ yếu qua
R-plasmid- đó là những phân tử ADN mang thông
tin di truyền nằm ngoài nhiễm sắc thể với các
gen mã hoá cho sự đề kháng nhiều kháng sinh
khác nhau
Cho đến nay, tại Việt Nam, S typhi kháng
đa kháng sinh đã xuất hiện ở nhiều tỉnh, thành
phố và đã gây nhiều ổ dịch thương hàn lưu
hành trong toàn quốc [1] Mức độ và kiểu cách
kháng thuốc của vi khuẩn cũng ngày một gia
tăng và phức tạp Đứng trước thực trạng đó,
việc giám sát tỷ lệ và mức độ kháng thuốc của
vi khuẩn đã được tiến hành thường xuyên tại
nhiều khu vực Tuy vậy, những nghiên cứu về
cơ chế đề kháng cũng như phương thức lan
truyền tính kháng thuốc của vi khuẩn ở cộng
đồng và trong bệnh viện còn rất hạn chế Để góp phần làm rõ thêm về vấn đề này, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu:
1 Tìm hiểu về plasmid ở S typhi và nghiên
cứu một số đặc điểm của chúng (độ lớn, số lượng các bản sao)
2 Xác định R-plasmid tự truyền ở các
chủng S typhi đa đề kháng qua tiếp hợp
3 So sánh R-plasmid tự truyền của các
chủng S typhi phân lập từ những vùng khác
nhau trong nước
II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1 Đối tượng nghiên cứu
90 chủng S typhi được phân lập từ các bệnh
nhân thương hàn:
- Hà Nội : 30 chủng
Trang 2- Huế : 30 chủng
- Tp Hồ Chí Minh : 30 chủng
Những chủng S typhi được nghiên cứu đều
đã được xác định mức độ nhạy cảm với 4
kháng sinh: chloramphenicol (CHL), ampicillin
(AMP), tetracycline (TET) và co-trimoxazole
(SXT) Những chủng kháng CHL đều là những
chủng đa kháng thuốc (kháng với 2 kháng sinh
trở lên)
2 Vật liệu
* Chủng vi khuẩn mẫu: Do trường đại học
Gifu, Nhật Bản cung cấp (40-Tsukasa-machi,
Gifu, Japan), gồm E.coli V517 (mang 8
plasmid mẫu, đã biết trước kích cỡ) và E.coli
GGS 75 (nhạy cảm với CHL, kháng với
Nalidixic axit)
* Enzyme hạn chế EcoR I (BioRad, Pháp)
* Kháng sinh bột và khoanh giấy kháng sinh (Meiji, Nhật Bản)
3 Phương pháp nghiên cứu
3.1 Xác định lại các chủng S typhi:
Theo thường quy chuẩn của WHO [9]
3.2 Kỹ thuật tách chiết ADN và nghiên cứu về plasmid:
Theo phương pháp của Kado và Liu [6]
- Xác định kích cỡ plasmid qua điện di trên gel agarose 0,8% và tính toán bằng đồ thị trên thang logarit
- Xác định số lượng bản sao các plasmid theo công thức:
Số lượng bản sao =
% ADN chromosome
x
Kích cỡ plasmid
3.3 Xác định R-plasmid tự truyền qua
tiếp hợp:
Theo Roy Curtiss (1981) [8]
III Kết quả
1 Tỷ lệ mang plasmid ở 90 chủng S typhi
phân lập tại Hà Nội, Huế và Tp Hồ Chí
Minh:
Số lượng plasmid CHL
∑
- 64/ 90 chủng S typhi (71,1%) có plasmid
- 63/ 69 chủng S typhi kháng CHL (91,3%)
có plasmid
- 6/ 69 chủng S typhi kháng CHL (8,7%)
không tìm thấy plasmid, 6 chủng này là những chủng đặc biệt Chúng đa kháng thuốc (theo hồ sơ) nhưng lại không tìm thấy plasmid nào, vì vậy, chúng đã được kiểm tra lại mức độ nhạy cảm với 4 kháng sinh CHL, AMP, TET và SXT Kết quả cho thấy có 1 chủng trở nên nhạy cảm với các kháng sinh được thử, 5 chủng còn lại vẫn giữ nguyên khả năng đề kháng
2 Số lượng và độ lớn plasmid
Sau khi tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình của Kado và Liu và quan sát trên
điện di gel agarose chúng tôi đã xác định được
sự xuất hiện của 2 loại plasmid ở các chủng S
typhi được nghiên cứu (Hình 1)
Trang 3Hình 1 : Hai loại plasmid ở Salmonella typhi
1 S typhi VCMM 1142 4 S typhi VCMM 1022 7 S typhi VCMM 465
2 S typhi VCMM 250 5 S typhi VCMM 1024 8 S typhi VCMM 466
3 S typhi VCMM 254 6 S typhi VCMM 463 9 S typhi VCMM 1048
- Loại plasmid thứ nhất xuất hiện ở đa số
những chủng S typhi đa kháng thuốc phân lập
ở cả ba khu vực được nghiên cứu Qua điện di
trên gel agarose, ở các chủng đa kháng thuốc,
chúng tôi thấy băng ADN plasmid này đều
xuất hiện ở một vị trí giống nhau Việc lập đồ
thị logarit biểu diễn mối tương quan giữa kích
cỡ plasmid và khoảng cách điện di tương đối
của chúng đã cho phép chúng tôi xác định được
kích cỡ của plasmid này là khoảng 120 Kb
Plasmid 120 Kb này đều không thấy xuất hiện
ở bất kỳ một chủng S typhi nhạy cảm CHL nào
được nghiên cứu
- Ngoài plasmid 120 Kb kể trên, qua nghiên
cứu chúng tôi cũng đã xác định được plasmid
thứ 2 với kích cỡ khoảng 102 Kb (Hình 1)
Plasmid 102 Kb không tồn tại riêng rẽ mà
thường đi kèm với plasmid 120 Kb ở những
chủng đa kháng thuốc này Tuy nhiên, plasmid
này còn được tìm thấy duy nhất ở một chủng S
typhi nhạy cảm CHL phân lập tại Huế Như
vậy, có thể sơ bộ nghĩ rằng plasmid này không
mang gen kháng thuốc
3 Số lượng bản sao plasmid 120 Kb
Trên cơ sở kết quả tỷ lệ ADN của plasmid
và chromosome tương ứng qua phép đo mật độ màu hai thành phần này, kích cỡ plasmid và
chromosome của chủng S typhi đã biết, cho
phép chúng tôi xác định được số bản sao đặc trưng so với chromosome của plasmid 120 Kb
là 2
4 R-plasmid tự truyền ở S typhi đa
kháng thuốc
Sự xuất hiện phổ biến của plasmid 120 Kb ở
đa số những chủng S typhi đa kháng thuốc
phân lập tại Hà Nội, Huế và Tp Hồ Chí Minh, cũng như kích cỡ và số lượng bản sao của plasmid này cho phép hiểu rằng đây có thể là một plasmid tiếp hợp mang một số gen kháng thuốc của vi khuẩn (R-plasmid tự truyền)
Để xác định vai trò của plasmid này trong cơ chế đề kháng cũng như sự lan truyền của
một số gen kháng kháng sinh ở S typhi, chúng
tôi đã tiến hành thực nghiệm tiếp hợp giữa một
chủng S typhi kháng CHL (mang 1 plasmid
120 Kb) nhưng nhạy cảm NAL với chủng
Trang 4E.coli GGS 75 nhạy cảm CHL (không mang
plasmid) nhưng kháng NAL
Kết quả thực nghiệm tiếp hợp cho thấy tính
kháng thuốc của S typhi đã được truyền sang
cho chủng E.coli GGS 75 thông qua R-plasmid
120 Kb Các gen đề kháng với những kháng
sinh thông thường (CHL, AMP, TET và SXT)
được theo dõi cùng nằm trên plasmid này và plasmid này đã được truyền hoàn chỉnh sang
chủng nhận E.coli (vì ở chủng vi khuẩn lai xuất
hiện một băng ADN có cùng vị trí với băng
plasmid 120 Kb ở chủng S typhi trước khi
mang vào tiếp hợp (Hình 2)
Hình 2 : Kết quả tách chiết ADN plasmid sau thực nghiệm tiếp hợp
1 E coli V517 (chứng plasmid) 2 E coli GGS 75 3 S typhi VCMM 250 4 E coli lai
5 Kết quả phân tích R-plasmid tự truyền
bằng enzyme hạn chế:
Nghiên cứu bước đầu dùng enzyme hạn chế
EcoR I phân tích R-plasmid 120 Kb ở 3 chủng
S typhi đa kháng thuốc phân lập tại Hà Nội,
Huế và Tp Hồ Chí Minh được trình bày trong
hình 3
Hình 3 Các mảnh cắt plasmid bằng EcoR I
1 Hà Nội; 2 Huế; 3 Kiên Giang
Có thể thấy, hình ảnh các mảnh cắt các plasmid ở 3 vùng khác nhau là giống nhau
Iv Bàn luận
1 Tỷ lệ mang plasmid ở S typhi:
Trong số 69 chủng S typhi đa đề kháng
được nghiên cứu, đã tìm thấy 2 loại plasmid
Có 63 (91,3%) chủng có mang ít nhất 1 plasmid còn 6 chủng không tìm thấy plasmid nào
Hiện tượng vi khuẩn đề kháng trở nên nhạy cảm với các kháng sinh sau một thời gian dài lưu giữ và cấy chuyển đã được y văn ghi nhận
từ lâu Trong nghiên cứu này, 1 chủng S typhi
đã có hiện tượng như vậy, hiện tượng này được giải thích là do chúng đã mất các gen đề kháng với những kháng sinh đó khi giữ chúng trong những điều kiện không có áp lực chọn lọc Còn hiện tượng không tìm thấy plasmid và giữ nguyên khả năng đề kháng với các kháng sinh thông thường (nghĩa là các gen kháng thuốc
Trang 5vẫn tồn tại trong tế bào vi khuẩn) ở 5 chủng S
typhi còn lại có thể do các plasmid đã bị phân
ly thành những thành phần có kích cỡ nhỏ hơn
[2], nên với kỹ thuật tách chiết plasmid đã sử
dụng, không phát hiện được; hoặc có thể do các
transposon mang các gen kháng thuốc đã
chuyển vị trí từ R-plasmid vào nhiễm sắc thể
của vi khuẩn [3, 5]
2 Đặc điểm của các plasmid:
Plasmid lớn thường có cấu tạo gồm đầy đủ
các thành phần cần thiết để có thể tự truyền cho
vi khuẩn khác [3, 4] Plasmid 120 kb trong
nghiên cứu này cũng là một plasmid lớn và đã
được chứng minh là có khả năng tự truyền:
plasmid này xuất hiện ở các chủng lai (Hình 2)
sau khi tiếp hợp mà không cần tác động bằng
bất cứ điều kiện nào khác Số lượng bản sao
plasmid này rất thấp (2 bản sao) phù hợp với
quy luật thường thấy ở vi khuẩn: kích cỡ
plasmid thường tỷ lệ nghịch với số các bản sao
và số các bản sao plasmid là hằng định ở một
loài vi khuẩn nhất định, ví dụ 2 plasmid:
pBR322 (kích cỡ 4,36 Kb) có 15-20 bản sao,
pUC (kích cỡ 2,69 Kb) có tới 500-700 bản sao
[7]
Plasmid 120 kb chỉ xuất hiện ở các chủng
đa đề kháng, không thấy ở bất cứ chủng nhạy
cảm nào Như vậy, plasmid này có liên quan tới
cơ chế đề kháng cũng như sự lan truyền của
một số gen kháng thuốc ở những chủng S typhi
này Những chủng nhận được plasmid này sau
tiếp hợp đều trở nên đề kháng với các kháng
sinh vốn trước đó chúng vẫn nhạy cảm, đồng
thời, kiểu cách đề kháng của các chủng lai
giống hệt kiểu cách đề kháng của các chủng
cho; vì vậy, plasmid đã truyền này đã mang các
gene đề kháng Những plasmid như thế, trong y
văn gọi là các R-plasmid [3]
3 So sánh các plasmid tự truyền:
Trên điện di gel agarose các plasmid 120
Kb sau khi cắt bằng EcoR I đều xuất hiện các
băng (mảnh cắt) với số lượng và vị trí giống
nhau Tuy chưa có điều kiện xác định chính xác kích cỡ của các mảnh cắt, song có thể thấy
rõ trên Hình 3: 3 plasmid ở 3 chủng S typhi đa
kháng thuốc phân lập tại ba khu vực khác nhau
đều giống nhau
Các R-plasmid tự truyền, giống nhau là một chỉ điểm dịch tễ học phân tử quan trọng để coi chúng có cùng một nguồn gốc Như vậy, với việc bùng phát dịch thương hàn kháng thuốc từ Kiên Giang năm 1993, có thể coi Kiên Giang
đã là nguồn gốc của các chủng S typhi đa đề
kháng và từ đó, chúng lan tràn ra cả nước Phân tích như trên, một lần nữa, nhắc nhở chúng ta phải dùng kháng sinh thận trọng, phải giữ vệ sinh môi trường tốt để tránh sự xuất hiện
và lan tràn các chủng vi khuẩn kháng thuốc, gây ra những hậu quả trầm trọng
V Kết luận
1
2
3
Hai plasmid với kích cỡ khoảng 120
Kb và 102 Kb đã được tìm thấy ở các chủng S
typhi phân lập tại ba khu vực được nghiên cứu
Plasmid 120 Kb có 2 bản sao
Plasmid 120 Kb là một R- plasmid tự truyền, mang ít nhất các gen đề kháng với chloramphenicol, ampicillin, tetracycline và trimethoprim/sulfamethoxazole Qua tiếp hợp,
toàn bộ kiểu cách đề kháng này của S typhi đã
được truyền sang chủng nhận E coli thông qua
R-plasmid 120 Kb
Phân tích bước đầu R-plasmid tự
truyền ở các chủng S typhi phân lập tại ba khu vực bằng enzyme hạn chế EcoRI, sơ bộ cho
thấy các R-plasmid giống nhau
Tài liệu tham khảo
1 Lê Đăng Hà (1996): Tình hình thương hàn đa kháng thuốc tại viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới (1988-1995) Bộ Y tế, Viện YHLSCBNĐ Tài liệu tập huấn
2 Chopra G S., Basu S K., Bhattacharya
S R (1992): Present phage types and antibiotic
Trang 6susceptibility of Salmonella Indian J Pathol
Microbiol 35 (4): 345-350
Medical microbiology 2nd ed Edit by Murray
P R., Kobayashi G S., Pfaller M A.,
Rosenthal K S Missouri: Mosby 1994: 28-45
4
5
6
7
8
9
Hoa N T., Diep T S., Wain J et al
(1998): Community-acquired septicaemia in
southern Viet Nam: the importance of
multidrug- resistant Salmonella typhi Trans R
Soc Trop Med Hyg 92 (5): 503-508
Holmes R K (1986): Genitics In:
Medical microbiology 2nd ed Edit by Baron S
California: Addison-Wesley 243: 261-264
Kado C I., Liu S T (1981): Rapid
procedure for detection and isolation of large
and small plasmids J Bacteriol 145:
1365-1373
Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (1989): Molecular cloning A laboratory manual 2nd ed, Vol 1 New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press
Roy Curtiss (1981): Gene Transfer, Mannal of Methods for General Bacterilogy, American Society for Microbiology, 14:
243-265
WHO (1991) Blood culture In: Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology 21-25
C¶m ¬n: C«ng tr×nh nµy ®−îc thùc
hiÖn t¹i labo Trung t©m Y sinh häc vµ bé m«n Vi sinh Y häc tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi
Summary
r-plasmid in several salmonella typhi strains isolated
from Ha Noi, Hue and Ho Chi Minh city
The multi-antibiotic resistant Salmonella typhi strains have already spread over the country Authors analysed 90 Salmonella typhi strains isolated in Ha Noi, Hue and Ho Chi Minh city and
had some observation as follows
- Two plasmids with size about 120 kilobase (Kb) and 102 Kb had been found in S typhi strains
isolated in 3 studied areas Plasmid 120 Kb had two copies
- Plasmid 120 Kb is a conjugated R-plasmid and carrying at least antibiotic resistant genes to chloramphenicol, ampicillin, tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole By conjugation, all
the resistant genes of S typhi were transferred to recipient E coli strains through R-plasmid 120
Kb
Through the initial analysis on the R-plasmids in S typhi strains isolated in 3 areas by a restricted
enzyme of EcoR I, we saw that these self-transmitted R-plasmids may have the same origin
