Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam Phan Thị Ngà 1 , Kouichi Morita 2 1 Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Hà Nội 2 Viện Y
Trang 1Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam
Phan Thị Ngà 1 , Kouichi Morita 2
1 Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Hà Nội
2 Viện Y học Nhiệt đới, Trường Đại học Nagasaki Nhật Bản
Trong năm 2002, có 2 chủng virut Arbo mới được phân lập từ dịch não tuỷ (DNT) của bệnh nhân
có hội chứng não cấp (HCNC) ở miền Bắc Việt Nam bằng dòng tế bào muỗi C6/36 Virut hình cầu, có
vỏ (envelop), kích thước khoảng 50 nm, vật liệu di truyền là ARN Trình tự vật liệu di truyền của chủng virut có ký hiệu 02VN208 không giống trình tự của các chủng virut đã công bố trên thế giới Cặp mồi
đặc hiệu (specific) được thiết kế từ một phần trình tự clone gen của chủng virut có ký hiệu 02VN208
để định loại những chủng virut phân lập từ bệnh nhân và từ muỗi năm 2002 bằng kỹ thuật RT-PCR
Có 2 chủng virut phân lập từ dịch não tuỷ (DNT) của bệnh nhân HCNC và có 4 chủng virut phân lập
từ muỗi được xác định dương tính; Kết quả này là một bằng chứng cho thấy đây có thể là một loại virut Arbo do muỗi truyền gây viêm não, mới được phát hiện ở Việt Nam Virut Nam Định là tên của virut
được đặt theo tên địa phương của bệnh nhân Những nghiên cứu về huyết thanh học, siêu cấu trúc của virut cần được thực hiện để có cơ sở phân loại virut Arbo mới này
I Đặt vấn đề
Viêm não do virut là một trong những
nguyên nhân gây tử vong ở trẻ em trong khu
vực châu á, đặc biệt là viêm não do virut viêm
não Nhật Bản (VNNB), tuy nhiên chỉ có
khoảng 20 – 60% trường hợp bị viêm não
được xác định là do virut VNNB, số còn lại có
thể là viêm não do virut khác [3, 8] Tương tự
như vậy ở Việt Nam, theo số liệu thống kê
hằng năm có khoảng 2000 – 3000 trường hợp
bị hội chứng não cấp (HCNC) do virut,
khoảng 30 – 50% số trường hợp bị HCNC
được xác định là do virut VNNB bằng kỹ thuật
MAC-ELISA, các virut gây viêm não tiềm ẩn
khác vẫn chưa được phát hiện ngoài virut
VNNB và virut đường ruột [1, 2] Năm 1971,
một số chủng virut thuộc nhóm Alpha được
phân lập từ muỗi ở miền Bắc Việt Nam, có giả
thiết rằng nó có thể là một virut Arbo mới gây
HCNC [6], tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa
phân lập được virut Alpha từ bệnh nhân Việt
Nam (số liệu phòng thí nghiệm) Do vậy mục
tiêu nghiên cứu của đề tài là phát hiện virut
viêm não mới do muỗi truyền từ DNT của
bệnh nhân có HCNC chưa rõ căn nguyên
II Nguyên vật liệu và phương pháp
1 Vật liệu:
Có 148 mẫu DNT được lấy từ bệnh nhân
có HCNC (3/2002 – 11/2002) tại Khoa Lây, Viện Nhi trung ương Các mẫu DNT này được xác định không có kháng thể IgM kháng virut VNNB bằng kỹ thuật MAC-ELISA
Huyết thanh được lấy vào ngày thứ 5 của bệnh và sau khi khỏi bệnh trên một năm (của bệnh nhân - chủng virut có ký hiệu 02V208
được phân lập từ DNT)
Kháng thể kháng virut nhóm Alpha, Flavi, Bunya, kháng thể gắn FITC do trung tâm kiểm soát bệnh tật CDC, Colorado Mỹ cung cấp
Kháng thể định loại virut VNNB do Viện VSDTTƯ, Hà Nội cung cấp
Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR và cặp mồi đặc hiệu định loại virut VNNB do Viện Y học Nhiệt đới, Nagasaki cung cấp (841 N và
2670 R)
Trang 2Cặp mồi đặc hiệu với chủng virut có ký hiệu
02VN208 được thiết kế từ chuỗi kéo dài để tổng
hợp một sản phẩm PCR khoảng 400 bp
Hoá chất cho kỹ thuật nhuộm âm bản do
Viện VSDTTƯ, Hà Nội cung cấp
Dòng tế bào muỗi C6/36 tế bào Vero và
BHK 21, tế bào thần kinh chuột (Mouse
neuronal cells) môi trường nuôi tế bào, các
trang thiết bị và vật liệu cần thiết khác
2 Phương pháp:
Phân lập virut: Mẫu DNT được làm tan
băng, gây nhiễm vào tế bào C6/36 [4, 7],
quan sát tế bào trong 5 ngày Chai tế bào gây
nhiễm có hình ảnh huỷ hoại tế bào, nước nổi
tế bào gây nhiễm được lọc qua lọc 0,22 nm,
hỗn dịch lọc được cấy truyền lần thứ hai trên
tế bào C6/36 Nếu có hình ảnh huỷ hoại tế
bào sau lần cấy truyền này chai tế bào được
lưu giữ ở – 70oC để định loại virut
Định loại virut bằng kỹ thuật ELISA, huỳnh
quang, kỹ thuật RT-PCR
Xác định hình thái virut bằng kính hiển vi
điện tử với kỹ thuật nhuộm âm bản
Xác định sự thích ứng của virut trên động vật phòng thí nghiệm (chuột ổ), các dòng tế bào thường trực bằng thử nghiệm đám hoại tử (Plaque Assay)
Sử dụng dòng tế bào BHK 21 để thực hiện
kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử, kết quả dương tính khi huyết thanh ở độ pha loãng 1/10 làm giảm 90% đám hoại tử
Virut được tinh chế từ nước nổi tế bào gây nhiễm virut bằng Polyethylene Glycol (PEG) 6.000 – Sucrose Gradient để tách chiết vật liệu di truyền theo phương pháp của Chapon [5], sử dụng enzym Dnase và Rnase xác định vật liệu di truyền của virut
Trình tự vật liệu di truyền của virut được xác định bằng những bộ mồi ngẫu nhiên sử dụng TOPOTA cloning kit của In-Vitrogen,
Mỹ So sánh trình tự nucleotit của virut với trình từ nucleotit của những virut đã được công bố trong ngân hàng số liệu
IV Kết quả
Kết quả phân lập virut bằng tế bào C6/36
Hình 1 Hình ảnh chủng virut có ký hiệu 02VN208 được phát hiện bằng kính hiển vi
điện tử với kỹ thuật nhuộm âm bản (mũi tên chỉ hạt virut X 150.000 )
14
Trang 3Từ 148 mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân
có HCNC năm 2002, không phát hiện được
kháng thể IgM kháng virut VNNB bằng kỹ
thuật MAC-ELISA, sử dụng tế bào C6/36
phân lập được 4 chủng virut VNNB và 2
chủng virut không định loại được với các
kháng thể kháng virut nhóm Alpha, Flavi,
Bunya Hai chủng virut không định loại được
có ký hiệu 02VN193 và 02VN208 Hình thái
virut được xác định bằng kính hiển vi điện tử
theo phương pháp nhuộm âm bản, hai chủng
virut này có hình thái giống nhau: virut hình
cầu, có vỏ, kích thước khoảng 50 nm
Kết quả xác định virut
Trong nghiên cứu này chủng virut có ký
hiệu 02VN208 được chọn để xác định các đặc
tính của virut Kết quả thực nghiệm cho thấy
chủng virut này không gây liệt chuột, nhưng
virut thích ứng trên tế bào C6/36 và nhiều
dòng tế bào của động vật có vú khác đặc biệt
là dòng tế bào thần kinh chuột Sự thích ứng
của virut trên các dòng tế bào thường trực
được khẳng định bằng thử nghiệm đám hoại
tử tế bào và kỹ thuật RT-PCR
Bằng kỹ thuật trung hoà, xác định ở độ
pha loãng 1/10 của huyết thanh làm giảm
90% đám hoại tử, như vậy kháng thể trung
hoà kháng virut trong mẫu huyết thanh được
lấy sau khi khỏi bệnh hơn một năm vẫn còn
tồn tại và có phản ứng đặc hiệu với chủng virut có ký hiệu 02VN208
Vật liệu di truyền của virut được kiểm tra với enzym Rnase và Dnase Enzym Rnase đã tiêu huỷ toàn bộ vật liệu di truyền của virut, khẳng
định virut có vật liệu di truyền là ARN So sánh với trình tự vật liệu di truyền của chủng virut này với các chủng virut đã công bố trên thế giới trong ngân hàng số liệu, xác định trình tự vật liệu di truyền của nó không giống với trình tự vật liệu di truyền của các chủng virut đã công bố, chỉ có 40% tương tự như trình tự vật liệu di truyền của virut Corona
Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế từ chủng virut có ký hiệu 02VN208 được dùng để kiểm tra với những chủng virut phân lập trong năm
2002 từ DNT của bệnh nhân có HCNC và từ muỗi bằng kỹ thuật RT-PCR Xác định có 6 chủng virut dương tính với cặp mồi này trong
đó có 2 chủng virut phân lập từ DNT bệnh nhân HCNC (chủng virut có ký hiệu 02VN193, 02VN208) và 4 chủng virut phân lập từ muỗi
Culex Tritaeniorhynchus và Culex Vishnui
(chủng virut có ký hiệu 02VN9, 02VN18, 02VN178 và 02VN108)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 2 Kết quả định loại các chủng virut phân lập năm 2002 bằng cặp mồi đặc hiệu
với chủng virut có ký hiệu 02VN208 (sản phẩm PCR khoảng 400 bp)
Trang 4Ghi chú các cột gen kiểm tra sản phẩm
PCR trên Agarose 1%: 1: Thang chuẩn DNA
100 bp; 2: Chứng dương (02VN208); 3:
02VN193, 4: 02VN 9; 5: 02VN18,
6: 02VN178, 7: 02VN180, 8: vi rut VNNB;
9: Chứng âm; 10: Thang chuẩn DNA 1 kb)
IV Bàn luận
Trong nghiên cứu này có 2 chủng virut
Arbo mới có vật liệu di truyền là ARN được
phân lập bằng dòng tế bào muỗi C6/36 Trình
tự vật liệu di truyền của chủng virut này được
xác định không giống trình tự vật liệu di truyền
của các virut đã được công bố trong ngân
hàng số liệu, như vậy đây là một chủng virut
mới được phát hiện ở Việt Nam cũng như trên
thế giới Kết quả xác định dương tính với các
chủng virut phân lập từ bệnh nhân và từ muỗi
năm 2002 bằng cặp mồi đặc hiệu với chủng
virut có ký hiệu 02VN208 là cơ sỏ để khẳng
định đây là virut gây HCNC do muỗi truyền [hình 2] Kiểm tra một số chủng virut phân lập
từ DNT của bệnh nhân HCNC trong năm
2003, xác định có 1 chủng dương tính với cặp mồi này (số liệu phòng thí nghiệm) Tên của virut được đặt theo tên địa phương của bệnh nhân, chủng virut có ký hiệu 02VN208 có tên
là virut Nam Định
Hai chủng virut Arbo mới phân lập từ bệnh nhân HCNC trong mùa dịch viêm não hè năm
2002, cả hai bệnh nhân hồi phục hoàn toàn sau điều trị Do chẩn đoán bằng phân lập virut thường ít đạt kết quả (bảng 1), nên việc chế tạo sinh phẩm cho kỹ thuật chẩn đoán và giám sát huyết thanh học cần được đề cập tới trong những nghiên cứu tiếp theo để ứng dụng cho chẩn đoán, giám sát huyết thanh học làm cơ sở để xác định dịch tễ, lâm sàng HCNC do virut Arbo mới này
Hình3 Kết quả xác định sự nhân lên của virut trên tế bào thần kinh chuột gây nhiễm với chủng virut có ký hiệu 02VN208 (sản phẩm PCR khoảng 400 bp)
Ghi chú các cột gen kiểm tra sản phẩm
PCR trên Agarose 1%: 1: Thang chuẩn DNA
100 bp; 2: Chứng dương (02VN208); 3 - 7:
ARN của virut trong nước nổi tế bào gây
nhiễm chủng virut có ký hiệu 02VN208 sau 1,
2, 3, 4 và 5 ngày; 8: Chứng âm
V Kết luận
1 Virut Arbo mới được phân lập từ DNT của bệnh nhân có HCNC năm 2002 có đặc
điểm: hình cầu, có vỏ, kích thước khoảng 50
nm, vật liệu di truyền được xác định là ARN
2 Virut thích ứng trên tế bào muỗi C6/36, BHK-21…và đặc biệt là tế bào thần kinh chuột Trình tự vật liệu di truyền của virut không giống
16
Trang 5trình tự của các chủng virut đã công bố trong
ngân hàng số liệu, nó là một chủng Arbo virut
mới được phát hiện ở Việt Nam
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm
virut Viêm não, Khoa Virut, Viện VSDTTƯ, Hà
Nội, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Y tế và Viện
VSDTTƯ
Các tác giả xin trân trọng cảm ơn sự hợp
tác trong nghiên cứu này của:
- Tập thể cán bộ Khoa lây Viện Nhi
Trung ương
- PGS TS Nguyễn Kim Giao, các
đồng nghiệp của Phòng Kính hiển vi điện tử,
Phòng thí nghiệm Virut viêm não, Khoa Virut
Viện VSDTTƯ
- Tiến sĩ Manmohan Parida, Khoa
Virut, Viện Y học Nhiệt đới, Nagasaki, Nhật
Bản cho sự trợ giúp về kỹ thuật sequencing
tại Nagasaki
- Trung tâm kiểm soát bệnh tật CDC,
Colorado Mỹ
Tài liệu tham khảo
1 Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh,
Vương Đức Cường, Vũ Sinh Nam, Phạm Thị
Minh Hằng, Trần Văn Tiến 2002 Giám sát,
chẩn đoán Viêm não Nhật Bản ở Việt Nam
(2000 – 2001), Tạp chí Y học dự phòng, tập
XII, số 4 (55 ), 2002, tr 5 – 11
2 Nguyễn Thị Hiền Thanh 2003 Bước
đầu tìm hiểu căn nguyên gây viêm màng não
ở trẻ em do một số virut đường ruột Tạp chí Y
học dự phòng, tập XIII, số 4 (61): 5-12
3 Boquan C and Sanju T 1996 Arbovirus survey in China in recent ten years Chinese Medical Journal, 109 (1): 13 – 15
4 Calisher C H., Shope R E., and Walton T.E 1988 Cell cultures for diagnosis
of Arbovirus infections in livestock and wildlife Journal of Tissue Culture Methods, Vol 11, No 3: 157 - 163
5 Chapon C., Cech T R., Zaug A J
1997 Polyadenylation of telomerase RNA in budding yeast RNA 3:1337 – 1351
6 Ha D Q., Calisher C H., Tien P H., Karabatsos N., and Gubler D J 1995 Isolation of a newly recognized Alphavirus from mosquitoes in Vietnam and evidence for human infection and disease Am J Trop Med Hyg 53 (1): 100 -104
7 Igarashi, A (1978) Isolation of singl’s Aedes Albopictus cell clone sensitive to Dengue and Chikungunyaviruses J Gen Virol 40: 531 – 544
8 Mackenzie J S., Chua K B., Daniels
P W., Eaton B T., field H E., Hall R A., Halpin K., Johansen C A., Kirkland P D., Lam S K., McMinn P., Nisbet D J., Paru R., Pyke A T., ritchie S A., siba P Smith d w., Smith G a., Hurk A F., Wang L F., Williams
D T 2001 Emerging viral Diseases of Southeast Asia and the Western Pacific Emerging Infectious Disease, Vol 7, No 3:497 – 504
Summary
Detection of new viral encephalitis from Cerebrospinal fluids
of acute encephalitis syndrome patients in North Vietnam
Two new Arbo viruses were isolated from cerebrospinal fluids of acute encephalitis syndrome patients in the North Vietnam in 2002 by C6/36 cells It was determined spherical, envelope and RNA virus The sequence of the virus did not homology with any known sequences that are available in the data bank Specific primer pair was designed for RT-PCR to examine unknown human and mosquito isolates in 2002 Four mosquito and 2 human isolates were confirmed positive by the primer pair indicating the virus to be a new Arbovirus Nam Dinh virus was named after patient’s locality Further study on serology, ultramorphology should be needed in order to have sufficient data to classify this new Arbovirus in Vietnam
