Tất cả các bệnh nhân lao đều có kết quả âm tính với trực khuẩn kháng cồn, kháng axit AFB bằng soi kính hiển vi trực tiếp.. Bệnh phẩm nhóm chứng bao gồm dịch não tuỷ, dịch màng phổi, và d
Trang 1Hiệu quả của PCR trong phát hiện M tuberculosis trực tiếp trong bệnh phẩm soi kính âm tính
của bệnh nhân lao
Hồ Minh Lý 1 , Nguyễn Vân Anh 1 , Phạm Kim Liên 1 , Nguyễn Hiền Anh 1 , Nguyễn Kim Trinh 1 ,
Đặng Đức Anh 1 , Nguyễn Văn Thiêm 2
1
Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương
2 Học viện quân y 103, Hà Nội
PCR được áp dụng để xác định M tuberculosis trực tiếp trong bệnh phẩm của 254 bệnh nhân
lao và 60 bệnh phẩm của bệnh nhân nhóm chứng Tất cả các bệnh nhân lao đều có kết quả âm tính với trực khuẩn kháng cồn, kháng axit (AFB) bằng soi kính hiển vi trực tiếp Bệnh phẩm nhóm chứng bao gồm dịch não tuỷ, dịch màng phổi, và dịch rửa phế quản của bệnh nhân có căn nguyên
ngoài lao Đối với bệnh phẩm của bệnh nhân lao, PCR đã phát hiện được M tuberculosis trong
60/100 (60%) bệnh phẩm đờm , 35/41 (85%) bệnh phẩm dịch rửa phế quản, 60/86 (70%) bệnh phẩm dịch não tuỷ và 19/27 (70%) bệnh phẩm dịch màng phổi, đạt độ nhậy chung là 69% PCR chỉ cho dương tính giả với 2 trong số 60 bệnh phẩm nhóm chứng, đạt độ đặc hiệu chung là 97% Đối
với các bệnh phẩm có kết quả nuôi cấy âm tính, PCR phát hiện được M tuberculosis trong 81/118
trường hợp đạt 69% Tất cả các trường hợp nuôi cấy dương tính, ngoại trừ một mẫu dịch não tuỷ và hai mẫu dịch rửa phế quản, đều có phản ứng PCR dương tính Kết quả cho thấy PCR là một trong những công cụ có thể cải thiện khả năng chẩn đoán bệnh lao bao gồm cả lao phổi và lao ngoài phổi, đặc biệt là các trường hợp AFB âm tính bằng soi kính
I Đặt vấn đề
Chẩn đoán lao phổi và lao ngoài phổi âm
tính với trực khuẩn kháng cồn kháng toan
(AFB) luôn là một thách thức khi mà kỹ thuật
chẩn đoán phòng thí nghiệm chủ yếu cho các
trường hợp soi kính âm tính vẫn là nuôi cấy cổ
điển Do thời gian chờ đợi kéo dài (4-8 tuần)
trong khi độ nhậy cũng không cao đặc biệt đối
với lao ngoài phổi [1, 2, 3], các nhà lâm sàng
nhiều khi phải áp dụng phương pháp điều trị
thử hoặc quyết định điều trị chỉ dựa trên triệu
chứng lâm sàng Hệ thống đo phóng xạ
BACTEC ra đời cho phép phát hiện sớm quá
trình mọc của vi khuẩn nhờ cơ chất có đánh
dấu phóng xạ giúp làm giảm thời gian chờ đợi
xuống còn một nửa Tuy vậy do chi phí mua
sắm cao và khó khăn trong xử lý chất thải phóng xạ, việc sử dụng vẫn còn hạn chế [4] PCR là một kỹ thuật có thể thực hiện nhanh trong vòng 1-2 ngày, nhưng lại có khả năng sao chép trình tự đặc hiệu trên genome của vi khuẩn từ một vài bản lên hàng trăm triệu đến hàng tỷ phiên bản Trong khi soi kính chỉ xác
định được vi khuẩn ở nồng độ tối thiểu 105/ 1
ml bệnh phẩm, PCR cho phép xác định vi khuẩn ở nồng độ rất thấp chỉ 1-3 vi khuẩn trong
1 bệnh phẩm [1] PCR do vậy được đánh giá là một công cụ có giá trị trong chẩn đoán các bệnh nhiễm khuẩn trong đó có bệnh lao Tuy nhiên cho đến nay việc sử dụng PCR trong chẩn đoán lao mới được áp dụng hạn chế ở một
số phòng thí nghiệm lớn ở Việt Nam Hiệu quả
Trang 2và tính năng áp dụng của phương pháp còn
chưa được nhiều nghiên cứu đề cấp đến một
cách toàn diện, đặc biệt trong chẩn đoán lao
AFB âm tính
Mục tiêu của nghiên cứu là: Đánh giá hiệu
quả kỹ thuật PCR trong phát hiện M
tuberculosis trực tiếp trong bệnh phẩm soi kính
âm tính với trực khuẩn kháng cồn kháng axit
của bệnh nhân lao
II Vật liệu và phương pháp
nghiên cứu
1 Vật liệu:
Vật liệu bao gồm 254 bệnh phẩm của bệnh
nhân lao và 60 bệnh phẩm của bệnh nhân nhóm
chứng được điều trị tại viện Lao trung ương,
bệnh viện Bạch Mai, viện Nhi trung ương, viện
Quân Y 103 và trung tâm Chống lao Hà Nội
Bệnh phẩm của bệnh nhân lao bao gồm 100
mẫu đờm, 41 mẫu dịch rửa phế quản, 86 mẫu
dịch não tuỷ và 27 mẫu dịch màng phổi Tất cả
các bệnh nhân này đều có kết quả AFB âm tính
bằng soi kính hiển vi trực tiếp và sau này đều
được chẩn đoán là bệnh nhân lao dựa vào kết
luận cuối cùng kết hợp các kết quả thăm khám
lâm sàng và các xét nghiệm khác Bệnh phẩm
nhóm chứng bao gồm 37 mẫu dịch não tuỷ của
bệnh nhân viêm màng não có căn nguyên ngoài
lao, 13 bệnh phẩm dịch màng phổi của bệnh
nhân tràn dịch màng phổi do ung thư và 10
bệnh phẩm dịch rửa phế quản của bệnh nhân
viêm phế quản không do lao
2 Phương pháp nghiên cứu:
Tất cả các bệnh phẩm trên được thu thập
trong thời gian nghiên cứu (1997-2001) riêng
lẻ cho từng trường hợp tại các bệnh viện mà
bệnh nhân đến điều trị Bệnh phẩm được gửi
cùng ngày về phòng thí nghiệm Mycobacteria
viện Vệ sinh dịch tễ trung ương không kèm
theo thông tin về lâm sàng của bệnh nhân Tất
cả các bệnh phẩm đều được chẩn đoán bằng kỹ
thuật PCR sử dụng đoạn mồi Pt18 và INS2 đặc
hiệu cho trình tự trên IS6110 của vi khuẩn lao nhóm điển hình Trừ bệnh phẩm đờm, tất cả các bệnh phẩm đều được tiến hành nuôi cấy phân lập song song với PCR tại đây Kết quả PCR được đối chiếu với kết luận cuối cùng của lâm sàng tại thời điểm bệnh nhân ra viện đồng thời so sánh với nuôi cấy Các tính toán thống
kê cũng được sử dụng để so sánh kết quả
III Kết quả
Tất cả các bệnh phẩm kể cả bệnh phẩm của bệnh nhân lao và bệnh nhân không lao nhóm chứng đều được xử lý tách chiết DNA, chạy PCR và điện di xác định kết quả trên gel agarose Bệnh phẩm dương tính là bệnh phẩm cho vạch trên gel điện di đặc hiệu cho đoạn trình tự axit nucleic trên IS6110 được sao chép với cặp đoạn mồi sử dụng Tỷ lệ dương tính với PCR đối với mỗi loại bệnh phẩm của các bệnh nhân mắc các thể lao khác nhau bao gồm lao màng não, lao tràn dịch màng phổi, lao phổi, và bệnh nhân nhóm chứng được trình bầy ở bảng
1
Bảng 1 Kết quả PCR xác định
M tuberculosis trong bệnh phẩm của bệnh nhân lao và bệnh nhân nhóm chứng
Bệnh
phẩm
PCR (+)
Se (%) Sp(%)
Bệnh nhân lao
Đờm DRPQ DMP DNT
60/100 35/41 19/27 60/86 174/254
60
85
70
70
69
90
100
97
96 Bệnh
nhân chứng
DNT DMP DRPQ
1/37 0/13 1/10
DRPQ: dịch rửa phế quản; DMP: dịch màng phổi; DNT: dịch não tuỷ
Trang 3Đối với bệnh phẩm của bệnh nhân lao, PCR
phát hiện được M tuberculosis trong 60/100
(60%) bệnh phẩm đờm , 35/41 (85%) bệnh
phẩm dịch rửa phế quản, 60/86 (70%) bệnh
phẩm dịch não tuỷ và 19/27 (70%) bệnh phẩm
dịch màng phổi, đạt độ nhậy chung là 69%
PCR chỉ cho dương tính giả với 2 trong số 60
bệnh phẩm nhóm chứng, bao gồm một mẫu
dịch não tuỷ của bệnh nhân viêm màng não mủ
và một mẫu dịch rửa phế quản của bệnh nhân
viêm phế quản không do lao Như vậy độ đặc
hiệu dao động từ 90% đến 100%, đạt độ đặc
hiệu chung 96% (bảng 1)
So với kết quả nuôi cấy, PCR có độ nhậy cao hơn một cách có ý nghĩa ở nhóm bệnh nhân lao màng não và bệnh nhân tràn dịch màng phổi do lao (P<0.01, χ2), tuy nhiên lại không cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê ở nhóm bệnh nhân lao phổi với bệnh phẩm là dịch rửa phế quản (bảng 2) Do không có điều kiện nuôi cấy phân lập bệnh phẩm đờm vào thời điểm nghiên cứu nên số liệu về nuôi cấy
đối với loại bệnh phẩm này của bệnh nhân lao phổi AFB âm tính với soi kính không được trình bầy ở đây
Bảng 2 Kết quả của PCR so với nuôi cấy
Bệnh nhân Bệnh phẩm PCR dương tính Nuôi cấy dương tính P Lao màng não
Lao tràn dịch màng phổi
Lao phổi
DNT DMP DRPQ
60/ 86 (70%) 19/27 (70%) 35/41 (85%)
4/86 (5%) 2/ 27 (7%) 30/41 (73%)
P<0.01 P<0.01 P>0.05
DRPQ: dịch rửa phế quản; DMP: dịch màng phổi; DNT: dịch não tuỷ
Đối với bệnh phẩm nuôi cấy dương tính PCR cho dương tính với 33/36 trường hợp (92%) Đối với bệnh phẩm có kết quả nuôi cấy âm tính PCR cho dương tính với 17/25 (68%) bệnh phẩm dịch màng phổi, 56/82 (68%) bệnh phẩm dịch não tuỷ và 8/11 (73%) bệnh phẩm dịch rửa phế quản cho
tỷ lệ chung là 69% (bảng 3)
Bảng 3 Kết quả PCR trên bệnh phẩm nuôi cấy dương tính và bệnh phẩm nuôi cấy âm tính
PCR Dương tính Âm tính
Tổng số
Nuôi cấy Dương tính
Âm tính
33 (92%)
81 (69%)
3
37
36 (100%)
118 (100%)
So sánh tỷ lệ dương tính của PCR trên nhóm
bệnh nhân đã điều trị và chưa điều trị thuốc lao
cho thấy việc điều trị có thể ảnh hưởng đến kết
quả PCR trên bệnh nhân lao màng não Tỷ lệ
dương tính của PCR trên nhóm bệnh nhân chưa
điều trị thuốc lao (84%) cao hơn có ý nghĩa so
với nhóm bệnh nhân đã điều trị (33%)
(P<0.01) Đối với bệnh nhân tràn dịch màng phổi do lao, tỷ lệ dương tính với PCR không khác nhau có ý nghĩa giữa hai nhóm này (P>0.05, χ2 ) (bảng 4) Tuy nhiên kết quả PCR trên nhóm bệnh nhân được điều trị thuốc lao trong thời gian dưới hoặc bằng 10 ngày và nhóm bệnh nhân đã được điều trị trên 10 ngày
Trang 4ở bệnh nhân lao màng não không có sự khác
biệt với tỷ lệ tương ứng là 67% và 60%
(P>0.05)
Bảng 4 Liên quan giữa kết quả PCR với điều trị thuốc lao của bệnh nhân lao
Dương tính PCR Bệnh nhân
Đã điều trị (%) Chưa điều trị (%)
P
Lao MN 8/24 (33%) 54/64 (84) <0.01 Lao TDMP 5/6 (83%) 17/24 (71%) >0.05
TDMP: tràn dịch màng phổi; MN: màng não
IV Bàn luận
Việc cho ra đời một phương pháp chẩn đoán
nhanh và hiệu quả đã trở nên rất quan trọng và
cấp thiết trong trong cuộc chiến đấu chống lại
bệnh lao, đặc biệt đối với các thể lao ít vi
khuẩn không thể phát hiện bàng phương pháp
soi kính
Trong nghiên cứu của chúng tôi độ nhậy
của PCR đối với bệnh phẩm của bệnh nhân lao
phổi và lao ngoài phổi AFB âm tính với soi
kính dao động từ 60% đối với bệnh phẩm đờm,
70% đối với bệnh phẩm dịch não tuỷ, 70% đối
với bệnh phẩm dịch màng phổi, tới 85% đối với
bệnh phẩm dịch rửa phế quản của bệnh nhân
lao phổi, cho độ nhậy chung là 69% Độ đặc
hiệu dao động từ 90% đối với dịch rửa phế
quản, 97% đối với dịch não tuỷ, đến 100% đối
với dịch màng phổi, cho độ đặc hiệu chung là
96%
Khi so sánh với các phương pháp khác cũng
xác định M tuberculosis trực tiếp từ bệnh
phẩm, PCR có ưu thế hơn hẳn So với nuôi cấy
PCR có ưu thế về thời gian Trong khi nuôi cấy
phải chờ ít nhất 4 tuần để có kết quả thì độ
nhậy trong nghiên cứu này cũng chỉ đạt từ 5%
đến 73% Soi kính cho kết quả ngay nhưng lại
không có giá trị trong các trường hợp lao soi
AFB âm tính
Khả năng phát hiện của PCR là 10 fg (10
-14g) DNA của M tuberculosis trong một ống
phản ứng (tương đuơng với lượng DNA của 2
đến 3 vi khuẩn) Điều này có thể giải thích tại sao PCR lại đạt độ nhạy cao trong chẩn đoán lao, thậm chí lao có AFB âm tính với soi kính
Độ nhậy của PCR còn cao hơn hẳn so với nuôi cấy đặc biệt ở các thể lao ít vi khuẩn nhưng lại nguy hiểm như lao màng não, lao tràn dịch màng phổi (P<0.01) Trong nghiên cứu này PCR cho dương tính với 69% trường hợp bệnh phẩm có kết quả nuôi cấy âm tính
Tỷ lệ dương tính của PCR trên nhóm bệnh nhân chưa điều trị thuốc lao cao hơn một cách
có ý nghĩa so với nhóm đã điều trị ở bệnh nhân lao màng não (P<0.01) Kết quả cho thấy việc
điều trị có tác động loại bỏ vi khuẩn nhanh hơn
ở bệnh nhân mắc thể lao này Kết quả cũng phù hợp với một số nghiên cứu của tác giả nước ngoài khi thấy rằng tỷ lệ dương tính với PCR giảm hẳn ở bệnh nhân lao màng não sau khi
được điều trị thuốc lao [5, 6]
V Kết luận
1 PCR sử dụng đoạn mồi Pt18 và INS2 xác định trình tự đặc hiệu trên IS6110 của vi
khuẩn lao nhóm điển hình M tuberculosis cho
độ nhậy từ 60% đền 85%, độ đặc hiệu từ 90%
đến 100% đối với bệnh phẩm soi kính âm tính của bệnh nhân lao phổi và lao ngoài phổi
2 So với nuôi cấy, độ nhậy của PCR cao hơn một cách có ý nghĩa đối với lao ngoài phổi (P<0.01)
Trang 53 PCR dương tính với 69% bệnh phẩm
có kết quả nuôi cấy âm tính
4 Tỷ lệ dương tính của PCR trên nhóm
bệnh nhân chưa điều trị thuốc lao cao hơn một
cách có ý nghĩa so với nhóm đã điều trị ở bệnh
nhân lao màng não (P<0.01)
Như vậy PCR là một kỹ thuật cho phép chẩn
đoán nhanh bệnh lao với độ nhậy và độ đặc
hiệu cao nhờ khả năng phát hiện vi khuẩn lao
trực tiếp trong bệnh phẩm ngay ở nồng độ rất
thấp Thời gian để có kết quả chỉ trong vòng 1
đến 2 ngày PCR thật sự là một công cụ hiệu
quả để chẩn đoán các dạng lao khó chẩn đoán
đặc biệt là lao có AFB âm tính với soi kính
TàI liệu tham khảo
1 Hồ Minh Lý, Đặng Đức Anh, Nguyên
Kim Trinh, Nguyễn Vân Anh Nguyễn Hiền
Anh, Le Kim Tuyến, Hoàng Thi Phượng,
Ngyễn Việt Cồ (1999): Chẩn đoán nhanh tràn
dịch màng phổi nghi do lao bằng phản ứng
PCR Tạp chí Y học dự phòng 1(39): 48-52
2 Hồ Minh Lý, Đặng Đức Anh, Nguyễn
Vân Anh Nguyễn Hiền Anh, Nguyên Kim
Trinh, Đặng Đức Trạch, Hoàng Thuỷ Long,
Hoàng Thị Phượng, Nguyễn Thu Hà, Đặng Văn
Khiêm, Nguyễn Thị Diễm Hồng, Nguyễn
Quang Trung (2000): PCR trong chẩn đoán
bệnh lao Tuyển tập công trình viện Vệ sinh
dịch tễ trung ương 1997-2000, Nhà xuất bản Y học Tr 200-204
3 A H J Kolk, A R J Schuitema, S Kuijper, J van Leeuwen, P W M Hermans, J
D A van Embden, and R A Hartskeerl (1992): Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioative
detection system J Clin Microbiol 30:
2567-2575
4 Anargyros P., D S J Astill, and I S L Lim (1990): comparison of improved BACTEC and Lowenstein-Jensen media for culture of
mycobacteria from clinical specimens J Clin
Microbiol 28: 1288-1291
5 Bonington A, J I Strang, P E Klapper (1998): Use of Roche amplicor mycobacterium tuberculosis PCR in early diagnosis of
tuberculous meningitis J Clin Microbiol 36:
1251-1254
6 Lin J J., H J Harn, Y D Hsu (1995): Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction assay of
cerebrospinal fluid J Neurol 242: 14
Summary
Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) for
direct detection of M tuberculosis in AFB smear
negative clinical specimens of tuberculosis patients
IS6110 based PCR was used for direct detection of M Tuberculosis in clinical
specimens obtained from 254 tuberculosis patients and from 60 other patients in control group The tuberculous specimens included sputum samples, bronchial washes, cerebrospinal fluids, and pleural fluids All these 254 patients were acid fast bacillus (AFB) smear negative and were diagnosed as tuberculosis according to clinical symptoms, biochemical criteria, biopsy or internal examination and response to therapy The control specimens included 37 cerebrospinal fluids, 13 pleural fluids and 10 bronchial washes
Trang 6taken from patients with pleural cancer, non-tuberculosis meningitis and bronchitis The
PCR could detect M tuberculosis in 60/100 (60%) sputum samples, 35/41 (85%)
bronchial washes, 60/86 (70%) cerebrospinal fluids and 19/27 (70%) pleural fluids The overall sensitivity of the PCR for these AFB smear negative was 69% False positive presented in only 2 out of 60 specimens of control group, the specificity therefore was
97% PCR could detect M tuberculosis in 81/118 (69%) culture negative specimens
Excepted one cerebrospinal fluid and two bronchial washes, all culture positive specimens were positive with PCR The result demonstrate the usefulness of using PCR in rapid diagnosis of pulmonary and extra pulmonary tuberculosis, especially AFB smear negative cases
